五種核酸提取法對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒提取效率的比較

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（1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410014；2. 長沙市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410006）

五種核酸提取法對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒提取效率的比較

何世成1，林源1，王昌建1，劉道新1，譚 丹2，唐小明1，王衛(wèi)國1，魯杏華1，邱立新1，何玉玲1

（1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410014；2. 長沙市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙 410006）

目的 研究Trizol RNA提取法、杭州博日吸附柱RNA提取法、Promega核酸提取儀磁珠RNA提取法、西安天隆核酸提取儀磁珠RNA提取法、Thermo核酸提取儀磁珠RNA提取法等五種不同核酸提取方法對(duì)不同含量豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）陽性樣品的相對(duì)提取效率，為動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)診斷實(shí)驗(yàn)室核酸提取方式的選擇提供技術(shù)參考。方法用五種不同核酸提取方法對(duì)4份10倍梯度稀釋的PRRSV陽性血清、2份PRRSV陽性組織懸液及其離心后的上清液共8份樣品同時(shí)進(jìn)行核酸提取，用熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，獲取各樣品PRRSV熒光RT-PCR結(jié)果的CP值，分析五種提取方式的相對(duì)提取效率。結(jié)果 對(duì)合適的提取樣品，磁珠提取法相對(duì)提取效率最高，吸附柱法其次，Trizol提取法相對(duì)效率較差；在三種磁珠提取法中，提取效率相差在2個(gè)CP值內(nèi)，差異不明顯，但以天隆磁珠提取法提取效率更高。結(jié)論預(yù)裝試劑結(jié)合儀器自動(dòng)化操作的磁珠法提取效果穩(wěn)定，效率最高；國產(chǎn)儀器國產(chǎn)試劑提取效率不亞于進(jìn)口儀器和試劑。

RNA提?。籔RRSV；TRIZOL；吸附柱；磁珠法

隨著分子檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，核酸提取技術(shù)獲得長足發(fā)展。第一代化學(xué)法，如異硫氰酸胍-酚-氯仿提取法、Trizol提取法等操作繁瑣、耗時(shí)、易污染，對(duì)人員技術(shù)水平要求較高；第二代為吸附柱提取法操作較簡單、提取效率高、提取質(zhì)量穩(wěn)定；近年發(fā)展起來的第三代磁珠提取法提取效率更高，且可進(jìn)行儀器自動(dòng)化批量提取，在有批量提取要求的實(shí)驗(yàn)室中廣受推崇[1-2]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，在臨床上能引起母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸道癥狀，是嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一[3]。本研究以PRRSV陽性樣品為對(duì)象，平行比較了五種不同提取方法提取效率的差異，旨在獲取動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室選擇合適、可靠的核酸提取方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

備用樣品8份，其中4份為10倍梯度稀釋的PRRSV陽性血清樣品，2份為PRRSV陽性的組織懸液，2份為PRRSV陽性的組織上清。制作方法為：PRRSV陽性血清解凍后，用0.01M pH7.2pBS作10倍梯度稀釋，制成4個(gè)不同稀釋度的樣品備用；取兩份PRRSV陽性豬扁桃體，在生物安全柜內(nèi)各剪取少量組織用組織研磨儀進(jìn)行研磨，將每份組織研磨后的混懸液一分為二，一份用于直接提取，一份經(jīng)10000r/min離心1min后，取上清備用。所有樣品來自于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑或試劑盒

Trizol? LS Reagent，ambian公司產(chǎn)品，批號(hào)55174203；Simply P Total RNA Extraction Kit，BioFlux公司產(chǎn)品；Maxwell? 16 Tissue LEV Total RNA Purifcation Kit，Promega公司產(chǎn)品，批號(hào)016953；LabSerb Viral Total NA Kit，F(xiàn)isher Scientifc公司產(chǎn)品，批號(hào)00LSKFR805496H14M020；Ex-RNA/DNA病毒核酸提取試劑盒，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20130909；豬繁殖和呼吸綜合癥（藍(lán)耳?。┖怂釞z測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法），中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)2013003.

1.3 主要儀器設(shè)備

AS2000（LEV） 核酸提取儀，Promega公司產(chǎn)品；NP968核酸提取儀，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；KingFisher Flex核酸提取儀，Thermo公司產(chǎn)品；LightCycler480 II熒光定量PCR儀，Roche公司產(chǎn)品；5804R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 Trizol提取。在離心管中依次加入750uL Trizol和250uL樣品，震蕩混勻，靜置10min；加入200uL氯仿，混勻，靜置10min，4℃離心15min；轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中，加入500uL異丙醇，混勻，靜置20min，4℃離心10min；去上清，離心管倒置晾干，加1mL70%冰乙醇洗，離心5min；去上清，加1mL70%冰乙醇洗，離心5min；去上清，倒置晾干1h ；加入125uL無核酸酶水，適當(dāng)震蕩，離心，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 吸附柱提取。按照Simply P Total RNA Extraction Kit使用說明書中的操作方法，對(duì)100uL的樣品進(jìn)行RNA提取，用50uL洗脫液進(jìn)行核酸洗脫。

1.4.3 Promega磁珠提取。運(yùn)用Promega公司Maxwell16核酸提取儀以及其配套試劑Maxwell? 16 Tissue LEV Total RNA Purifcation Kit對(duì)樣品進(jìn)行磁珠法機(jī)器自動(dòng)提取，操作按Promega公司推薦方法進(jìn)行。起始樣品量為200uL，核酸洗脫液體積為100uL。

1.4.4 天隆磁珠提取。運(yùn)用西安天隆科技有限公司的核酸提取儀以及其配套試劑Ex-RNA/DNA病毒核酸提取試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行磁珠法機(jī)器自動(dòng)提取，操作按Promega公司推薦方法進(jìn)行。起始樣品量為200uL，核酸洗脫液體積為100uL。

1.4.5 LabServ磁珠提取。運(yùn)用Thermo KingFisher Flex核酸提取儀以及其匹配試劑LabSerb Viral Total NA Kit對(duì)樣品進(jìn)行磁珠法機(jī)器自動(dòng)提取，操作按Thermo公司推薦方法進(jìn)行。起始樣品量為200uL，核酸洗脫液體積為100uL。

1.4.6 RNA提取效率驗(yàn)證。對(duì)提取的核酸樣品進(jìn)行PRRSV熒光RT-PCR檢測(cè)，利用結(jié)果CP值比較提取效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清樣品結(jié)果與分析

五種不同提取方法對(duì)4份10倍梯度稀釋的血清樣品所提核酸熒光RT-PCR結(jié)果的CP值見表1，同一樣品不同提取方法CP值與最低CP值差值表見表2。結(jié)果顯示，不同提取方法、不同樣品在提取效率上均有差異，對(duì)同一樣品，磁珠法提取效率最高，且三種磁珠法提取效率間差異較?。–P值差異在±2以內(nèi)），吸附柱提取法其次，Trizol提取法提取效率最低，所提核酸的CP值最高，與最低CP值相比，最高差異達(dá)9.6，提取效率接近100倍。

表1 血清樣品熒光RT-PCR 結(jié)果（CP值）

表2 同一樣品不同提取方法CP值與最低CP值差值表

2.2 組織上清液樣品結(jié)果與分析

五種不同提取方法對(duì)2份組織研磨液上清樣品所提核酸熒光RT-PCR結(jié)果的CP值見表3，結(jié)果顯示，對(duì)目標(biāo)病毒核酸濃度較低的組組樣品上清，五種提取方法CP值差異不大，在2以內(nèi)，折算成提取效率，不超過4倍；就具體數(shù)據(jù)而言，以天隆磁珠提取法提取效率最高。

2.3 組織研磨混懸液樣品結(jié)果與分析

組織研磨混懸液因未經(jīng)離心，樣品內(nèi)組織塊、細(xì)胞含量很高，除非經(jīng)特殊裂解處理，一般不用于直接進(jìn)行核酸提取。五種不同提取方法對(duì)2份組織研磨混懸液樣品所提核酸熒光RT-PCR結(jié)果的CP值見表4。結(jié)果顯示，Trizol提取法、吸附柱提取法、Promega磁珠提取對(duì)復(fù)雜樣品的耐受更高，提取效率高于天隆磁珠提取法和LabServ磁珠提取法，提取效率相差約3個(gè)CP值左右，即10倍左右；相對(duì)于其上清樣品（表3），提取效率下降2倍以上，最高為天隆磁珠提取法的5個(gè)CP值差異，效率下降約為32倍。

3 討論

3.1 目前，核酸檢測(cè)是病原學(xué)監(jiān)測(cè)、檢測(cè)的主要技術(shù)手段之一，也是臨床運(yùn)用最廣泛的技術(shù)方法，而其前提是高質(zhì)量、高效率的核酸提取。本試驗(yàn)以動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)中的主要監(jiān)測(cè)對(duì)象之一——豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）為對(duì)象，以熒光RT-PCR方法為評(píng)價(jià)手段，平行比較了5種核酸提取方法的相對(duì)提取效率，結(jié)果顯示，對(duì)合適的提取樣品，磁珠提取法相對(duì)提取效率最高，吸附柱法其次，Trizol提取法相對(duì)效率較差；在三種磁珠提取法中，提取效率差異不明顯，但以天隆磁珠提取法提取效率更高。

3.2 本實(shí)驗(yàn)的5種提取方法中，Trizol提取法和吸附柱提取法為純手工操作；LabServ磁珠提取法所有試劑、樣品需手工加入，由儀器進(jìn)行提??；Promega磁珠法和天隆磁珠提取法均為預(yù)裝試劑，只少量試劑和樣品需人工加入，由儀器進(jìn)行提取，相較而言自動(dòng)化程度較高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自動(dòng)化程度較高的Promega磁珠法和天隆磁珠提取法提取效率高于自動(dòng)化程度較低的LabServ磁珠提取法，明顯高于純手工提取法，表明預(yù)裝試劑的運(yùn)用和儀器自動(dòng)化操作有利于核酸提取效率的提高。

3.3 本實(shí)驗(yàn)中的5種提取方法其針對(duì)的樣品均為清亮狀態(tài)的液體樣品，如拭子上清液、組織研磨離心后上清液、血清等。本實(shí)驗(yàn)中組織混懸液和組織上清的核酸提取結(jié)果顯示，混懸液樣品的核酸提取效率低于上清液樣品的2-32倍，表明，過多的組織塊及細(xì)胞含量，雖在理論上能增加細(xì)胞釋放病毒的數(shù)量，但實(shí)際上無助于病毒核酸的提取效率。

3.4 報(bào)道稱，國產(chǎn)核酸提取試劑其提取效率低于進(jìn)口試劑，但在文獻(xiàn)中無法獲知國產(chǎn)試劑為何種產(chǎn)品[4-5]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，作為國產(chǎn)儀器和國產(chǎn)試劑組合而成的天隆磁珠提取法在提取效率上不亞于進(jìn)口儀器和進(jìn)口試劑的組合，其原因可能在于近年來國產(chǎn)試劑和儀器設(shè)備制造水平厚積薄發(fā)的技術(shù)升級(jí)。

3.5 利用熒光定量RT-PCR結(jié)果的CP值（CT值）來比較不同核酸提取方法間的提取效率是目前的常用方法[4-10]。本次實(shí)驗(yàn)因成本因素，未進(jìn)行大量樣品對(duì)比實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析與結(jié)論非統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，僅供臨床使用者參考借鑒。

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Comparison of fve RNA extraction methods for extraction of PRRS virus nucleic acids

He Shicheng1，Lin Yuan1，Wang Changjian1，Liu Daoxin1，Tan Dang2，Tang Xiaoming1，Wang Weiguo1，Lu Xinhua1，Qiu Lixin1，He Yuling1
（1. Hunan Center for Animal Disease Prevention and Control，Changsha，Hunan 410014；2. Changsha Center for Animal Disease Prevention and Control，Changsha，Hunan 410006）

Aim To compare the extraction effciency of fve RNA extraction methods（Trizol RNA extraction method、adsorption column RNA extraction of BIOER，magnetic bead RNA extraction of Promega，XianTianlong and Thermo）for detection of PRRSV viruses，so as to provide technical reference for animal disease diagnostic laboratories in nucleic acid extraction.MethodsPRRSV RNAs were extracted using the 5 RNA extraction methods on positive serum samples of PRRS viruses diluted serially from 10-1to 10-4and 2 PRRSV positive tissue suspension and supernatant at the same time. The RNA preparations were quantifed by fuorescence real-time quantitative RT-PCR.ResultsFor the appropriate samples，the extraction effciency of magnetic bead was the highest；the adsorption column RNA extraction followed；and Trizol RNA extraction method was lower；there was 2 CP value deference among the three magnetic bead RNA extraction methods，indicating no obvious difference，but the Tianlong magnetic bead extraction effciency was higher relatively.ConclusionPre-installed reagent combination with automation magnetic beads to extract was stable and gave the highest effciency. The magnetic bead extraction effciency had no signifcant difference between the domestic and imported products.

RNA extraction；PRRSV；Trizol；adsorption column；magnetic bead extraction

R373.1

：A

：1005-944X（2014）08-0070-04