以菊芋全粉為碳源培養(yǎng)基對乳桿菌的發(fā)酵性實(shí)驗(yàn)及發(fā)酵條件優(yōu)化

于濟(jì)洋，秦 寧，李新華，王 杕，張 明，鄭鳳娥，王 琳

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866；2.沈陽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院食品安全所，遼寧沈陽110022；3.中國農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京110193；4.遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧沈陽110036）

菊芋（Inulin），俗稱鬼子姜、洋姜。鮮菊芋中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括碳水化合物為16.6%（其中78%為菊芋多糖，即菊粉），除以此之外，還含有少量蛋白質(zhì)、粗纖維、氨基酸、維生素以及多種礦物質(zhì)[1-4]。保加利亞乳桿菌是一種益生菌，在食品發(fā)酵、乳酸發(fā)酵、飼料行業(yè)和醫(yī)療保健領(lǐng)域均有比較廣泛的應(yīng)用[5-8]，乳桿菌活菌制品的生產(chǎn)和檢驗(yàn)都必須首先獲得可大量生長增殖的培養(yǎng)基，既要保證培養(yǎng)基對菌種有良好的選擇性，還要培養(yǎng)基原料物美價廉。

研究表明[9-12]菊粉有促進(jìn)乳桿菌生長的作用，是一種較好的培養(yǎng)基原料，而全粉產(chǎn)品在實(shí)際生產(chǎn)中具有工藝相對簡單，營養(yǎng)物質(zhì)全面利用，產(chǎn)品安全無加工溶劑殘留等優(yōu)勢。目前，全粉研究主要集中在薯類方面[13-14]，與薯類由淀粉到全粉的研究過程相似的是，大家目前更熱衷于研究菊粉，而忽略了對菊芋全粉的研究，從目前對全粉的認(rèn)可程度上可以判斷，菊芋全粉同樣會有廣泛的利用價值和應(yīng)用空間。

本實(shí)驗(yàn)利用菊芋全粉、菊粉作為單一碳源分別取代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖成分發(fā)酵培養(yǎng)乳桿菌，并對不同碳源的增殖效果進(jìn)行比較，進(jìn)一步研究菊芋全粉對乳桿菌的發(fā)酵性。同時對主要條件進(jìn)行優(yōu)化獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件。本研究結(jié)果既為乳桿菌的發(fā)酵增殖提供了一種快速高效、綠色安全的培養(yǎng)基基礎(chǔ)物質(zhì)，也為菊芋全粉的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳桿菌（ASI.1482） 沈陽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院食品安全所菌種保藏中心提供；菊芋全粉、菊粉 實(shí)驗(yàn)室自制；0.85%生理鹽水，0.1mol/L氫氧化鈉溶液。

生物安全柜 賽默飛世爾科技有限公司；2.5L密封培養(yǎng)罐 上海天呈科技有限公司；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HZQX100A恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；DK-S22電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；VORTEX3旋渦混勻器 德國IKA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 乳桿菌瓊脂培養(yǎng)基（MRS瓊脂培養(yǎng)基）：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉5.0g，酵母膏粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐溫1m L，磷酸氫二鉀2.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸三銨2.0g，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，瓊脂15g，加蒸餾水至1000m L，煮沸溶解，調(diào)pH至7.0（20～25℃）。121℃滅菌20min。4℃下保存?zhèn)溆?。（用于活菌檢測計數(shù)）

乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（MRS肉湯培養(yǎng)基）：酪蛋白酶消化物10.0g，牛肉膏粉10.0g，檸檬酸三銨2.0g，酵母膏粉4.0g，乙酸鈉5.0g，硫酸錳0.05g，硫酸鎂0.2g，磷酸氫二鉀2.0g，葡萄糖20.0g，吐溫1m L，加蒸餾水至1000m L，煮沸溶解，調(diào)pH至7.0（20～25℃）。分裝于具塞試管中，每管9m L，121℃滅菌20m in。4℃下保存?zhèn)溆谩＃ㄓ糜诰N增菌培養(yǎng)）

實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基（用于菌種的增殖培養(yǎng)）：將葡萄糖碳源替換為實(shí)驗(yàn)用碳源適量（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）。菊粉代替葡萄糖，以下稱為菊粉肉湯培養(yǎng)基；菊芋全粉代替葡萄糖，以下稱為菊芋全粉肉湯培養(yǎng)基。

1.2.2 菌種的活化 乳桿菌使用MRS液體培養(yǎng)基活化，得菌種母液。

1.2.3 接種和培養(yǎng) 取培養(yǎng)基于121℃滅菌20m in，冷卻至室溫接入稀釋后的乳桿菌菌種母液，接種量為10%（菌落總數(shù)約為4.5×103CFU/m L），培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時間48h。用1m L無菌吸管取稀釋后的實(shí)驗(yàn)用菌種母液勻液，沿管壁緩慢注于裝有9m L生理鹽水、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、菊粉肉湯培養(yǎng)基、菊芋全粉肉湯培養(yǎng)基的無菌試管中（共12組，每組3個平行），用渦旋振蕩器振蕩20s，使菌液混勻，放入?yún)捬醺字袇捬跖囵B(yǎng)，放置（36±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4h取出1組試管進(jìn)行平板計數(shù)，培養(yǎng)48h。

1.2.4 菌落總數(shù)的測定 參照GB 4789.35食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計 選擇不同濃度的碳源、發(fā)酵溫度、接種量對乳桿菌進(jìn)行單因素發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.1 碳源單因素實(shí)驗(yàn) 發(fā)酵溫度為35℃，接種量為10%，菊芋全粉質(zhì)量濃度分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，考察碳源濃度對保加利亞乳桿菌發(fā)酵的影響。

1.2.5.2 發(fā)酵溫度單因素實(shí)驗(yàn) 菊芋全粉質(zhì)量濃度為2.0%，接種量為10%，發(fā)酵溫度分別為30、35、40、45℃，考察不同發(fā)酵溫度對保加利亞乳桿菌發(fā)酵的影響。

1.2.5.3 接種量單因素實(shí)驗(yàn)條件 菊芋全粉質(zhì)量濃度為2.0%，發(fā)酵溫度為35℃，接種量分別為6%、8%、10%、12%，考察不同接種量對保加利亞乳桿菌發(fā)酵的影響。

1.2.6 發(fā)酵條件實(shí)驗(yàn)設(shè)計 運(yùn)用Design-Expert 8.0實(shí)驗(yàn)設(shè)計對以菊芋全粉作為碳源的培養(yǎng)基對乳桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，變量為菊芋全粉的添加量（1.5%、2.0%、2.5%）、發(fā)酵溫度（30、35、40℃）、接種量（8%、10%、12%）。

表1 Design-Expert8.0實(shí)驗(yàn)設(shè)計表Table1 Variables and their levels for Design-Expert experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對于乳桿菌增殖情況的比較研究

以菊芋全粉、菊粉和葡萄糖三種物質(zhì)作為培養(yǎng)基的碳源對乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，乳桿菌生長曲線如圖1所示。由圖1可見，在以菊芋全粉作為碳源的培養(yǎng)基中，乳桿菌生長較快，在4h時，最先達(dá)到生長對數(shù)期，而且在20h時，活菌總數(shù)最先達(dá)到最高9.42lg CFU/m L（2.6×109CFU/m L）；而在菊粉和葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中，乳桿菌在8h時進(jìn)入生長對數(shù)期，較菊芋全粉緩慢，在24h時活菌總數(shù)達(dá)到最高，分別為8.74lg CFU/m L（5.4×108CFU/m L）和8.43lg CFU/m L（2.7×108CFU/m L），最高活菌總數(shù)菊芋全粉培養(yǎng)基是菊粉的4.8倍，是葡萄糖的9.6倍。由此可見，菊芋全粉作為碳源對乳桿菌的增殖效果要優(yōu)于菊粉和葡萄糖。

由此可見，菊芋全粉作為碳源對乳桿菌的增殖效果要優(yōu)于菊粉和葡萄糖。李沖等[11]研究了菊芋復(fù)合汁增菌培養(yǎng)基對保加利亞乳桿菌的優(yōu)化篩選，該研究結(jié)果排除了菊芋對保加利亞乳桿菌具有抑制作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同，同時李沖等得出優(yōu)化后的菊芋汁培養(yǎng)基活菌數(shù)與實(shí)驗(yàn)室常用的MRS培養(yǎng)基的活菌數(shù)相當(dāng)?shù)慕Y(jié)論，此結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)菊芋全粉是葡萄糖培養(yǎng)基活菌數(shù)9.6倍的結(jié)論不一致，究其原因一方面是由于優(yōu)化菊芋汁培養(yǎng)基僅僅培養(yǎng)了16h，菌種生長還未達(dá)到穩(wěn)定期，另一方面是由于本實(shí)驗(yàn)選用的是標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)基，僅僅替換了標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的碳源，其他元素比例處于最優(yōu)條件，更適合菌種增殖生長。K leessen[12]和Roberfriod[5]分別研究了菊粉對乳酸桿菌顯著促進(jìn)作用，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢與本文相同，而菊芋全粉對保加利亞乳桿菌增殖效果的研究還未見報道，因此對于保加利亞乳桿菌而言該實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具實(shí)際意義。

圖1 保加利亞乳桿菌在不同碳源培養(yǎng)基上發(fā)酵的生長曲線Fig.1 Growth curves of Bulgaria lactobacillus in different carbon source culturemediums

2.2 不同碳源對保加利亞乳桿菌代謝pH的比較研究

以菊芋全粉、菊粉和葡萄糖三種物質(zhì)作為培養(yǎng)基的碳源培養(yǎng)保加利亞乳桿菌，其培養(yǎng)基的pH變化如圖2所示，菊芋全粉培養(yǎng)基的pH下降最快，當(dāng)20h時pH已經(jīng)降至4.67，既低于同條件下菊粉和葡萄糖培養(yǎng)基的pH，又低于雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌同時間的pH（課題組其他實(shí)驗(yàn)章節(jié)內(nèi)容），當(dāng)48h時菊芋全粉的pH降至3.94，是本課題組乳酸菌實(shí)驗(yàn)中唯一一個菌種代謝產(chǎn)物能使培養(yǎng)環(huán)境pH低于4的培養(yǎng)基。究其原因很可能是保加利亞乳桿菌是乳酸菌中產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的菌種，而且耐酸能力強(qiáng)，保加利亞乳桿菌是制作酸奶必備菌株之一，其發(fā)酵生成的乳酸使pH下降至4.5，從而使酪蛋白沉淀制得酸奶，保加利亞乳桿菌利用菊芋全粉同樣能使pH低于4.5，因此添加菊芋全粉發(fā)酵制備酸乳具有可行性。

圖2 保加利亞乳桿菌在不同碳源培養(yǎng)基上pH變化曲線Fig.2 pH value curves of Bulgaria lactobacillus in different carbon source culturemediums

2.3 菊芋全粉培養(yǎng)基對保加利亞乳桿菌的發(fā)酵條件的篩選

2.3.1 不同碳源濃度對保加利亞乳桿菌發(fā)酵的單因素實(shí)驗(yàn) 由圖3可知，碳源對于菌種的發(fā)酵的影響是比較顯著的。隨著菊芋全粉的添加量增多，乳桿菌的長勢越好；當(dāng)菊芋全粉的質(zhì)量濃度達(dá)到2.5%時，菌種的菌落總數(shù)與質(zhì)量濃度為2.0%的菊芋全粉的培養(yǎng)基的菌落總數(shù)相差不大，隨著碳源添加量的增加，乳桿菌的增殖趨于平穩(wěn)。較多的碳源為乳桿菌的增殖提供了充足的養(yǎng)分，過多的碳源超出了乳桿菌的利用范圍，反而會因?yàn)榫簼舛鹊纳咭种凭N的發(fā)酵。

圖3 不同碳源濃度對保加利亞乳桿菌發(fā)酵的影響Fig.3 Effectof different carbon source concentration on Bulgaria lactobacillus fermentation

2.3.2 不同發(fā)酵溫度對保加利亞乳桿菌發(fā)酵的單因素實(shí)驗(yàn) 由圖4可知，發(fā)酵溫度對于菌種的發(fā)酵有顯著的影響。隨著發(fā)酵溫度的升高，保加利亞乳桿菌的生長和繁殖速度加快，35、40℃時，保加利亞乳桿菌的長勢良好；當(dāng)溫度過高時，酶失活的速度加快，菌種衰老提前，菌種的長勢有所下降。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與王奎明等[15]研究保加利亞乳桿菌高密度培養(yǎng)條件相一致。

圖4 不同發(fā)酵溫度對保加利亞乳桿菌發(fā)酵的影響Fig.4 Effectof different fermentation temperature on Bulgaria lactobacillus fermentation

2.3.3 不同接種量對保加利亞乳桿菌發(fā)酵的單因素實(shí)驗(yàn) 由圖5可知，適當(dāng)?shù)木N接種量利用充足的空間和養(yǎng)分進(jìn)行最大限度的發(fā)酵增殖，10%的菌種接種量在全粉培養(yǎng)基的發(fā)酵中性價比是最好的，以相對較少的接種量獲得相差不大的菌種量。當(dāng)菌種量低于8%時，菌種不能充分利用養(yǎng)分；接種量過多，發(fā)酵進(jìn)行的速度加快，菌液濃度變大，抑制菌種的發(fā)酵。

圖5 不同接種量對保加利亞乳桿菌發(fā)酵的影響Fig.5 Effectof different inoculum size on Bulgaria lactobacillus fermentation

2.4 菊芋全粉培養(yǎng)基對乳桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 二次多項(xiàng)式模型的建立與分析 根據(jù)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到一個二元多次式。該方程為描述響應(yīng)變量（R）與自變量（A、B、C）的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停篟= 2.000×109+2.355×108A+2.227×108B+2.132×108C+1.598×108AB+3.428×107AC+1.934×108BC-7.764×108A2-9.593×108B2-7.734×108C2。

表2 Design-Expert8.0實(shí)驗(yàn)設(shè)計及其結(jié)果Table2 Design-Expert8.0 experimental design arrangement and results

由表3可見，回歸模型具有高度的顯著性（p＜0.0001），而失擬項(xiàng)差異不顯著（p=0.9286＞0.05），R2= 0.9904，R2adj=0.9781，而且A、B、C均達(dá)到顯著水平（p＜0.05），表明此模型對實(shí)驗(yàn)的擬合度很好，可以對乳桿菌得率進(jìn)行很好的分析和預(yù)測，而且該模型適用于優(yōu)化以菊芋全粉作為碳源的培養(yǎng)基對乳桿菌的發(fā)酵條件。由表3還可以看出，因素AB、BC、A2、B2、C2對乳桿菌的發(fā)酵得率有顯著的影響（p＜0.05）；因素AC對乳桿菌的得率影響不顯著（p＞0.05）。

由F值可知，各因素對乳桿菌得率的影響依次為A（碳源）＞B（發(fā)酵溫度）＞C（接種量）。

表3 二次多項(xiàng)式模型的系數(shù)及其方差分析Table3 Coefficients and ANOVA for the developed quadratic polynomialmodel

2.4.2 碳源的濃度、發(fā)酵的溫度、接種量對乳桿菌得率的影響 由表3和圖6可知，碳源濃度（A）和發(fā)酵溫度（B）具有顯著的交互作用，p=0.0386＜0.05；發(fā)酵溫度（B）和接種量（C）也具有顯著的交互作用，p=0.0179＜0.05。碳源的濃度、發(fā)酵溫度、接種量三個影響因素中條件濃度或溫度較低時，適量的增加濃度或者提高溫度均可以促進(jìn)菌體的生長，可以使保加利亞乳桿菌增殖，但在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，碳源的濃度、發(fā)酵溫度和接種量之間存在著最佳值，超過最佳值后，增加任意組分的濃度或者提高發(fā)酵溫度，均不能提高菌種的單位菌落總數(shù)，甚至使菌種的單位菌落總數(shù)有所下降。該模型說明乳桿菌可以較好的利用菊芋全粉中的豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)元素進(jìn)行生長發(fā)酵，可以取代葡萄糖。而且菊芋全粉作為培養(yǎng)基中的碳源時，還會對乳桿菌有較好的增殖作用。

2.4.3 最佳工藝條件的預(yù)測和檢驗(yàn) 通過二次多項(xiàng)回歸的預(yù)測，得到以菊芋全粉作為碳源的培養(yǎng)基對保加利亞乳桿菌發(fā)酵的最佳條件是：碳源的濃度為2.09%，發(fā)酵溫度為35.73℃，接種量為10.32%，得到菌落總數(shù)為2.05×109CFU/m L。考慮實(shí)際操作過程的方便性，將提取工藝參數(shù)調(diào)整為碳源的濃度為2.1%，發(fā)酵溫度為36℃，接種量為10%，實(shí)際測得發(fā)酵后的保加利亞乳桿菌的菌落總數(shù)為2.2×109CFU/m L。因此，該模型與實(shí)際情況基本吻合，說明菊芋全粉作為碳源的培養(yǎng)基的發(fā)酵條件的優(yōu)化是可行的。

3 討論

萬榮峰[16]和Kap lan等[10]研究表明，果聚糖能促進(jìn)乳酸菌生長，抑制有害菌生長，對乳酸菌有益生作用。果糖是菊粉和菊芋全粉的基本成分，由此可以推斷，菊粉和菊芋全粉同樣能促進(jìn)乳酸菌的生長，該理論推斷在實(shí)驗(yàn)中得到證明。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究了菊芋全粉的發(fā)酵性能，得出結(jié)論菊芋全粉作為培養(yǎng)基增殖乳酸菌的效果是葡萄糖的9.7倍，但是實(shí)驗(yàn)中的乳酸菌是從酸乳中分離培養(yǎng)的，包括保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌等混合菌種，菊芋全粉對具體每種菌種的增殖效果可能有區(qū)別，本研究是具體菌種增殖實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一，課題組正在對菊芋全粉對其他菌種的發(fā)酵性進(jìn)行研究。菊芋全粉除了具有發(fā)酵性能外，還具有凝膠特性，因此一同研究菊芋全粉的凝膠性和發(fā)酵特性更具有實(shí)用價值，相關(guān)工作筆者所在課題組正在進(jìn)行研究。

圖6 碳源的濃度、發(fā)酵溫度、接種量對保加利亞乳桿菌菌落總數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surfaces for the effects of carbon source concentration，fermentation temperature，inoculum size on the total plate countof Bulgaria lactobacillus

4 結(jié)論

菊芋全粉具有良好的發(fā)酵性，可作為乳桿菌（ASI.1482）培養(yǎng)基碳源使用，活菌的生長情況優(yōu)于葡萄糖和菊粉。在同一條件下，乳桿菌的增殖數(shù)量分別為菊粉的4.8倍、葡萄糖的9.6倍。通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面曲面分析與實(shí)際檢測結(jié)果確定最佳發(fā)酵條件為：碳源的濃度2.1%、發(fā)酵溫度36℃、接種量10%，在此條件下保加利亞乳桿菌的菌落總數(shù)為2.2×109CFU/m L。本研究結(jié)果證明了菊芋全粉具有良好的發(fā)酵性能，為菊芋全粉在益生菌培養(yǎng)基碳源應(yīng)用前景提供了新的研究方向。

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