HPLC法測(cè)定甘肅地產(chǎn)不同品種釀酒葡萄中的花色苷

李琪，李廣*，金麗瓊，羅清楠

（甘肅省分析測(cè)試中心，甘肅蘭州730000）

HPLC法測(cè)定甘肅地產(chǎn)不同品種釀酒葡萄中的花色苷

李琪，李廣*，金麗瓊，羅清楠

（甘肅省分析測(cè)試中心，甘肅蘭州730000）

利用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)甘肅地產(chǎn)9種釀酒葡萄中的花色苷進(jìn)行了檢測(cè)分析。在9種釀酒葡萄中共定性檢測(cè)到9種花色苷（黑比諾除外，共檢測(cè)到5種）。利用相對(duì)百分含量對(duì)這9種花色苷進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9種釀酒葡萄都以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高，其他花色苷含量依釀酒葡萄品種不同而各異；利用9種花色苷總峰面積對(duì)9種釀酒葡萄所含花色苷總量進(jìn)行了比較分析，其含量順序依次為美樂(lè)＞寶石＞晚紅蜜＞蛇龍珠＞西拉＞赤霞珠＞品麗珠＞黑比諾＞馬瑟蘭；同時(shí)，利用4種花色苷對(duì)照品所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程對(duì)9種釀酒葡萄中的4種花色苷含量進(jìn)行了定量計(jì)算。為甘肅產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄在花色苷方面的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了重要參考依據(jù)。

釀酒葡萄；花色苷；高效液相色譜

花色苷是葡萄與葡萄酒中一類重要的多酚類物質(zhì)，具有抗癌、抗氧化、防止動(dòng)脈硬化等功能，是葡萄與葡萄酒中最主要的呈色物質(zhì)，而顏色恰是評(píng)價(jià)葡萄酒質(zhì)量好壞的重要依據(jù)之一[1-3]?；ㄉ湛膳c其他物質(zhì)（如單寧）化合，進(jìn)而影響葡萄酒的口感，對(duì)葡萄酒的品質(zhì)有著重要的影響[4]。葡萄酒中的花色苷主要來(lái)源于釀酒葡萄的果皮[5-6]。因此，釀酒葡萄的品質(zhì)直接關(guān)乎著葡萄酒的質(zhì)量。葡萄中花色苷的種類和含量因葡萄品種、種植地、氣候及種植條件的不同而各異[7-8]。所以，花色苷的種類及含量對(duì)葡萄及葡萄酒的品質(zhì)具有重要的意義。

河西走廊是甘肅種植釀酒葡萄的唯一產(chǎn)區(qū)，而河西走廊地處北緯36°～40°之間，年1 500h以上的有效積溫適合釀造葡萄生長(zhǎng)需要；干燥的氣候又可有效抑制葡萄病蟲(chóng)害發(fā)生；作為灌溉用水的祁連山雪水和地下井水富含礦物質(zhì)；土層深厚，透氣性良好，具有種植優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄的最佳光、熱、水、土等組合資源，賦予地產(chǎn)釀造葡萄自然天成的高品質(zhì)，因而甘肅也是我國(guó)葡萄酒的主要產(chǎn)區(qū)。其中莫高、祁連、國(guó)風(fēng)、紫軒等品牌地產(chǎn)葡萄酒更是享譽(yù)國(guó)內(nèi)外[9-10]。本研究以甘肅地產(chǎn)釀酒葡萄為對(duì)象，對(duì)甘肅目前大面積種植的9種釀造葡萄中的主要花色苷采用HPLC法進(jìn)行了檢測(cè)分析，為進(jìn)一步確定甘肅不同品種葡萄酒的品質(zhì)提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9種葡萄樣品均采自甘肅河西走廊不同釀酒葡萄種植園。

花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素3-O-葡萄糖苷對(duì)照品：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：德國(guó)默克公司；磷酸（優(yōu)級(jí)純）：天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；甲酸（分析純）：廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 1525高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器（2998 PDA）和在線脫氣機(jī)）：美國(guó)Waters公司；AE200電子天平：瑞士梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；0.22μm有機(jī)相過(guò)濾器：上海密粒膜分離技術(shù)有限公司；ELGA MK2超純水器：北京格瑞恩科技發(fā)展有限公司；KQ-50B超聲波清洗器：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；JHX280H渦旋振蕩器：北京京輝凱業(yè)科技有限公司；H-2050R高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

ZorbaxSB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流速1mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)535nm；流動(dòng)相：水/乙腈/甲酸（A=80/10/7；B=40/50/7），梯度洗脫見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件和程序Table 1 Gradient elution condition and program

1.3.2 葡萄中花色苷的提取

挑選著色均勻的葡萄，剝出果皮均質(zhì)后，準(zhǔn)確稱取樣品2.5g于50mL聚乙烯管中，加入浸提液（甲醇∶水=1∶1，磷酸調(diào)pH=2.0）20mL，冰浴中超聲波輔助提取10min，再渦旋振蕩提取10min，重復(fù)提取2次，最后以10 000r/min冷凍離心5min，取上層清液過(guò)0.22μm濾膜后上液相色譜儀分析。

1.3.3 葡萄中花色素苷的定性和定量分析

因目前市場(chǎng)上花色苷的對(duì)照品較少且昂貴，本研究花色苷采用標(biāo)樣花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷部分定性，然后參考相關(guān)文獻(xiàn)[11-18]定性其他花色苷。定量分析方面，花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷根據(jù)各自對(duì)照品所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算其含量，其他花色苷的含量表示為9種花色苷峰面積的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 處理方法的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)[19-21]，分別對(duì)以下3種常用的處理方法進(jìn)行了比較：

a.選取15粒著色均勻的葡萄，剝出果皮稱質(zhì)量，加入30mL甲醇超聲輔助提?。囟取?5℃），每提取一次換一次水，以防止溫度過(guò)高。每次提取20min，共提取6次，每3次提取液定容至100mL，合并提取液，4℃存放。重復(fù)2次，過(guò)0.22μm濾膜后上液相色譜儀分析。

b.挑選著色均勻的葡萄，剝出果皮均質(zhì)后，準(zhǔn)確稱取樣品2.5g于50mL聚乙烯管中，加入浸提液（甲醇/水=1∶1，磷酸調(diào)pH=2.0）20mL，冰浴中超聲波輔助提取10min，再渦旋振蕩提取5min，重復(fù)提取2次，最后以10 000r/min冷凍離心5min，取上層清液過(guò)0.22μm濾膜后上液相色譜儀分析。

c.挑選70～100粒著色均勻的葡萄，解凍剝皮，液氮快速處理，冷凍干燥24h，凍干粉末裝于自封袋中。稱取0.5g葡萄粉末，加10mL 2%甲酸-甲醇溶液，放于離心管中，超聲10min，然后搖床振蕩30min，8 000r/min離心5min，轉(zhuǎn)上清液于100mL圓底燒瓶中，重復(fù)4次（套黑袋）并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干（28℃），用上樣緩沖液定容至10mL，過(guò)0.22μm濾膜后上液相色譜儀分析。

通過(guò)以上不同處理方法的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，3種處理方法所得結(jié)果基本一致，但方法a和c操作起來(lái)比較繁瑣，而b則較為簡(jiǎn)便且省時(shí)省力，因此，最后選定方法b為花色苷最佳處理方法。

2.2 花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確稱取花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)適量，用0.01%的鹽酸-甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度為5μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，在確定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別對(duì)4種花色苷的質(zhì)量濃度（x）和峰面積（y）進(jìn)行擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，4種花色苷質(zhì)量濃度為5.0～100μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的相關(guān)系數(shù)均在0.999 5以上，線性關(guān)系良好。

表24 種花色苷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equation and correlation coefficient of four anthocyanins

2.3 不同品種釀酒葡萄中的花色苷組分

根據(jù)高效液相色譜分析，9種釀酒葡萄中花色素苷的色譜圖及4種標(biāo)樣色譜圖分別見(jiàn)圖1、圖2。其中，色譜圖1、圖2中1、2、4、5號(hào)峰即標(biāo)樣花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷的出峰時(shí)間與文獻(xiàn)[6-9]報(bào)道相同，根據(jù)這4個(gè)峰的出峰時(shí)間再參考文獻(xiàn)[11-18]推斷出其他色譜峰代表的成分。

圖1 9種釀酒葡萄中花色苷的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of anthocyanins in nine wine grapes

圖2 4種花色苷對(duì)照品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of four anthocyanin reference substance

2.3.1 9種不同品種釀酒葡萄中花色苷的相對(duì)含量

表3為9種釀酒葡萄皮中花色苷的相對(duì)含量。由表3可知，在9種釀酒葡萄中相對(duì)含量最高的均是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。其中，赤霞珠中⑤相對(duì)含量為36.97%，其次是⑨、⑦、①，其他均在10%以下，依次為③、④、②、⑥、⑧、②；寶石中⑤相對(duì)含量為44.89%，其次是⑨、①、⑦，10%以下的依次為③、④、②、⑧、⑥；晚紅蜜中⑤相對(duì)含量為37.49%，其次是①、③，10%以下的依次為⑦、⑨、④、②、⑧、⑥。從表3結(jié)果分析可知，9種花色苷在不同釀酒葡萄中的含量順序各不相同。通過(guò)比較可發(fā)現(xiàn)，9種花色苷在葡萄中的含量順序中赤霞珠和美樂(lè)、蛇龍珠和晚紅蜜除⑥⑧順序顛倒外，其他順序基本一致；其他葡萄中花色苷的含量順序則各異，但均以⑤相對(duì)含量最高，相對(duì)含量均在30%以上。；美樂(lè)中⑤相對(duì)含量為48.47%，其次是⑨、⑦，10%以下的依次為①、③、④、②、⑧、⑥；黑比諾中只檢測(cè)到5種花色苷，⑤相對(duì)含量為47.11%，其次是①、④、③，10%以下的為②；蛇龍珠中⑤相對(duì)含量為40.14%，其次是①、③、⑦、⑨，10%以下的依次為④、②、⑥、⑧；品麗珠中⑤相對(duì)含量為40.04%，其次是⑦、①，10%以下的依次為⑨、③、④、⑥、②、⑧；西拉中⑤相對(duì)含量為32.14%，其次是⑨、⑦，10%以下的依次為④、③、①、⑧、⑥、②；馬瑟蘭中⑤相對(duì)含量為34.46%，其次是⑦、④，10%以下的依次為⑨、①、③、⑥、

表3 釀酒葡萄皮中花色苷的相對(duì)百分含量Table 3 Relative percentage of anthocyanins in different wine grapes %

2.3.2 9種釀酒葡萄中花色苷含量的比較

表4 9種釀酒葡萄皮中9種花色苷的響應(yīng)值Table 4 Chromatographic response value of nine anthocyanins in nine wine grapes

因目前市場(chǎng)上花色苷的對(duì)照品昂貴且不易購(gòu)得，不能一一測(cè)定這9種花色苷的含量，本實(shí)驗(yàn)采用色譜圖響應(yīng)值（峰面積）對(duì)9種釀酒葡萄中的花色苷含量進(jìn)行了初步比較，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，各種花色苷在各自葡萄中的含量各異，含量差別從1倍到8倍不等。如甲基花青素3-O-（6-O-對(duì)香豆酰）苷在蛇龍珠中的含量是晚紅蜜葡萄中含量的1.03倍，而其在寶石葡萄中的含量則是馬瑟蘭葡萄中的7倍多；花翠素3-O-葡萄糖苷在西拉葡萄中的含量是品麗珠葡萄中含量的1.02倍，而其在晚紅蜜葡萄中的含量則是馬瑟蘭葡萄中含量的8倍多。就花色苷總量（峰面積）而言，差別也在1.13倍到3.40倍不等。含量最高的是美樂(lè)（1.56×108），然后依次是寶石（1.50×108）、晚紅蜜（1.35× 108）、蛇龍珠（1.25×108）、西拉（1.0×108）、赤霞珠（1.03×108）、品麗珠（6.49×107）、黑比諾（4.59×107）、馬瑟蘭（4.05×107）。

2.3.3 9種釀酒葡萄中4種花色苷的含量

根據(jù)對(duì)照品（花翠素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-葡萄糖苷、甲基花青素3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（見(jiàn)表2），分別對(duì)9種葡萄中的4種花色苷含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，在稱樣量和處理?xiàng)l件相同的條件下，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量最高的是美樂(lè)（43.03g/kg），然后依次是寶石（38.19g/kg）、晚紅蜜（28.68g/kg）、蛇龍珠（28.43g/kg）、赤霞珠（21.63g/kg）、西拉（19.51g/kg）、品麗珠（14.76g/kg）、黑比諾（12.29g/kg）、馬瑟蘭（7.93g/kg）；結(jié)合表4中花色苷總含量發(fā)現(xiàn)，除赤霞珠和西拉順序顛倒外，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量高低順序與花色苷總含量高低順序完全一致。結(jié)果表明，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷在釀酒葡萄中所占比例，在一定程度上可以體現(xiàn)出釀酒葡萄中花色苷總含量情況，在用花色苷評(píng)價(jià)釀酒葡萄品質(zhì)優(yōu)劣時(shí)其含量情況具有一定的代表性。

表5 9種釀酒葡萄皮中4種花色苷的含量Table 5 Content of the four anthocyanins in nine grapes g/kg

3 結(jié)論

利用超聲波輔以渦旋振蕩提取，利用高效液相色譜法對(duì)甘肅產(chǎn)區(qū)9種釀酒葡萄中的花色苷進(jìn)行了分離檢測(cè)，依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)共定性檢測(cè)了9種花色苷，利用相對(duì)百分含量、各自色譜峰響應(yīng)值（峰面積）對(duì)9種釀酒葡萄中的花色苷進(jìn)行了比較分析；利用現(xiàn)有4種花色苷對(duì)照品對(duì)釀酒葡萄中相應(yīng)花色苷含量進(jìn)行了定量計(jì)算。結(jié)果表明，9種釀酒葡萄中均以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高，占花色苷總含量的30%以上，其他花色苷因葡萄品種不同在花色苷總含量中所占比例各異；除黑比諾外，其他釀酒葡萄中花色苷種類相差無(wú)幾，但含量方面有著較大的差異。從花色苷總含量的角度出發(fā)，對(duì)這9種釀酒葡萄進(jìn)行排序，依次為美樂(lè)>寶石>晚紅蜜>蛇龍珠>西拉>赤霞珠>品麗珠>黑比諾>馬瑟蘭。

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Determination of anthocyanins in different grape varieties in gansu region by HPLC

LI Qi,LI Guang*,JIN Liqiong,LUO Qingnan
(Analysis and Research Center of Gansu Province,Lanzhou 730000,China)

The nine kinds of anthocyanins were qualitatively detected by HPLC in the nine kinds of wine grapes(except Pinot Noir,only five kinds were detected).The relative percentage of the nine kinds of anthocyanins was compared,and result showed that malvidin-3-O-glucoside had the highest content in the 9 kinds of wine grapes,and other anthocyanins content depending on wine grape varieties.Comparative analysis of total anthocyanins was conducted refer to the total peak area.The anthocyanins content of different varieties in order was Merlot,Gems,Late Red Honey, Gernischt,Syrah,Cabernet Sauvignon,Cabernet Franc,Pinot Noir,Marselen.Meanwhile,the four kinds of anthocyanins in wine grape was quantitatively calculated with standard curve equation made by the reference substance of four anthocyanins,providing an important reference for grape quality evaluation on anthocyanins in Gansu region.

wine grape;anthocyanins;HPLC

TS262.6

A

0254-5071（2014）03-0132-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.032

2014-01-07

甘肅省科技重大專項(xiàng)計(jì)劃（1102FKDA011）

李琪（1963-），男，副研究員，碩士，研究方向?yàn)槠咸丫萍捌渌称贩治鰴z測(cè)。

*通訊作者：李廣（1981-），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)槠咸丫萍捌渌称返姆治鰴z測(cè)。