江西省產(chǎn)黃酒中氨基甲酸乙酯殘留量的GC-MS分析

宋利軍，楊竹，周銀古*，李騰根，劉瑞弘，毛尚根，劉芳宇，李彪

（1.新余市疾病預(yù)防控制中心，江西新余338025；2.新余市渝水區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江西新余338025）

江西省產(chǎn)黃酒中氨基甲酸乙酯殘留量的GC-MS分析

宋利軍1，楊竹2，周銀古1*，李騰根1，劉瑞弘1，毛尚根1，劉芳宇1，李彪1

（1.新余市疾病預(yù)防控制中心，江西新余338025；2.新余市渝水區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江西新余338025）

采用氣相色譜-質(zhì)譜法調(diào)查60份江西省內(nèi)生產(chǎn)的黃酒產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯（EC）殘留量。酒樣添加d5-EC同位素內(nèi)標(biāo)，經(jīng)硅藻土層析住吸附，乙醚洗脫，用GC-MS測定，內(nèi)標(biāo)法定量。色譜柱為DB-INNOWAX石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。加標(biāo)回收試驗(yàn)的平均回收率為107.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%（n=2），黃酒中EC的污染水平中，EC的中位數(shù)為24.4μg/kg，均值為35.0μg/kg，檢出率為70%，含量值范圍為6.0～123.7μg/L。通過此次調(diào)查江西產(chǎn)黃酒中氨基甲酸乙酯殘留量，將為我國制定國家標(biāo)準(zhǔn)和對黃酒中氨基甲酸乙酯的污染水平評估提供數(shù)據(jù)支持。

氣相色譜-質(zhì)譜法；黃酒；氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamagte，EC）是一種可以引起癌變的物質(zhì)，當(dāng)氨基甲酸乙酯攝入過量或累積過量，都會引起動物體內(nèi)脫氣核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）中多位點(diǎn)發(fā)生堿基突變、移位，從而導(dǎo)致癌變的發(fā)生。氨基甲酸乙酯引起癌變的組織或器官主要有：肺、淋巴結(jié)、肝和皮膚等。1985年，多位學(xué)者研究證實(shí)飲料酒中含有的EC具有致癌作用[1-3]，引起世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）和各個國家的重視。氨基甲酸酯類中的甲酯不具有致癌作用，而乙酯、丙酯和丁酯都具有致癌作用，其中，危害性較強(qiáng)的是乙酯[4]。2007年2月，在里昂舉行的WHO的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）專家會議上，正式將氨基甲酸乙酯從2B類致癌物提高為2A類致癌物——“很可能對人類有致癌作用”[5]。肝細(xì)胞瘤的發(fā)生與氨基甲酸乙酯的含量呈線性關(guān)聯(lián)，主要原因是N6-末端脫氧核苷酸隨著DNA復(fù)制而不斷的形成[6]。氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法是用氣相色譜法分離并定性與用質(zhì)譜法定性相聯(lián)用的一種分析方法。其主要用于檢測痕量的化合物。本研究主要采用GC-MS法對60份江西省內(nèi)生產(chǎn)的黃酒產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯殘留量進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

60份樣本均來自江西省內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)。采樣要求依據(jù)《2012年國家食品污染和有害因素風(fēng)險》工作手冊進(jìn)行，所有樣本都抽取2份，其中一份用于檢測，另一份作為留樣，以備復(fù)檢。所采集的樣本嚴(yán)格按照工作手冊要求記錄產(chǎn)品名稱、產(chǎn)品批號、產(chǎn)地等樣本信息。

1.1.2 試劑

無水乙醚（色譜純）、甲醇（色譜純）、CLE-硅藻土固相萃取柱（ExtrelutTM20）。標(biāo)準(zhǔn)品EC（分子質(zhì)量89.09，純度> 98.0%，批號51-79-6）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；d5-EC（分子質(zhì)量94.13，純度≥98.0%，批號73962-07-9）：上海普邁生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010plus氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本SHIMADZU公司；N-EVAPTM 111氮吹儀：美國Organ-omation Associates公司；UVS-1渦旋混勻器：美國Thermo公司；HSE-120固相萃取儀：上海禾工科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

（1）試樣制備

稱取2.0g（準(zhǔn)確至0.01g）酒樣于10mL比色管中，加100μL d5-氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)使用液（1.0μg/mL），渦旋混勻。

（2）試樣凈化

將添加了內(nèi)標(biāo)的試樣加到層析柱中，打開活塞，放置30min。用15mL乙醚洗脫，收集洗脫液于10mL具塞刻度試管中，30℃以下用氮?dú)饩従彺抵辽儆?mL，加少量甲醇繼續(xù)吹至0.5mL左右，加甲醇定容至1.0mL，渦旋混勻，靜置，取上清液供GC/MS分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取（精確至0.1mg）適量的d5-EC標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用時用甲醇稀釋至1.0μg/mL。

EC標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取（精確至0.1mg）適量的EC標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用時用甲醇稀釋至0.2μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確吸取0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、0.2μg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)使用液，各加100μL、1.0μg/mL d5-EC使用液（1.0μg/mL），用甲醇定容至1.0mL，得到質(zhì)量濃度為20.0ng/mL、40.0ng/mL、80.0ng/mL、120ng/mL、160ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（d5-EC質(zhì)量濃度均為100.0ng/mL）。

1.3.3 儀器分析

（1）色譜條件

色譜柱：DB-INNOWAX，30m×0.25mm×0.25μm；載氣（氦氣）流速：1.0mL/min，恒流；吹掃流速：3.0mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；柱溫程序：初溫50℃，保持0.5min，然后以5℃/min升至150℃，以40℃/min升至220℃保持3min；進(jìn)樣量：1.0μL；無分流進(jìn)樣。電離方式：電子電離（electron ionization，EI）源。離子源溫度：230℃。氨基甲酸乙酯選擇監(jiān)測離子（m/z）：45、62、74；定量離子62。d5-氨基甲酸乙酯選擇監(jiān)測離子（m/z）：50、64、76；定量離子64。

（2）測定

采用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，在相同的氣相色譜條件下，分別將標(biāo)準(zhǔn)系列和試樣溶液進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析，以保留時間和各監(jiān)測離子的豐度比定性，內(nèi)標(biāo)法定量。以各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（ng/mL）與定量離子峰面積比（m/z 62與m/z 64）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測試液中氨基甲酸乙酯含量。試劑空白、樣品本底、樣品加標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)序列均在同一儀器條件下進(jìn)行測定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用EXCEL2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣本的GC/MS圖

通過對標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析，以濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為y=1.845x+0.000，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9。此外，列出了樣本序號分別為45和54 2種樣品的總離子色普分別見圖2、圖3。

圖1 氨基甲酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ethyl carbamate

圖2 序號為45的瑞田老酒中氨基甲酸乙酯含量的總離子色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of ethyl carbamate content in No.45 Tianrui wine

圖3 序號為54的井岡山五年紅米酒中氨基甲酸乙酯含量的總離子色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of ethyl carbamate content in No.54 Jinggangshan red rice wine

2.2 加標(biāo)回收試驗(yàn)分析

為了考察本方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，對黃酒樣品添加了d5-氨基甲酸乙酯的回收試驗(yàn)，結(jié)果見表1。由表1可知，回收率為107.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative staudard deviation，RSD）為1.33%。本方法滿足黃酒中氨基甲酸乙酯殘留量的檢測要求，并且此結(jié)果與呂芬的研究結(jié)果一致[7]。該方法測定氨基甲酸乙酯的準(zhǔn)確度和精密度良好，能滿足痕量分析的要求。

表1 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=2)Table 1 Result of recovery standard addition

2.3 江西產(chǎn)黃酒中氨基甲酸乙酯含量的GC/MS分析

對60份江西產(chǎn)黃酒中氨基甲酸乙酯含量測定，結(jié)果見表2。由表2可知，黃酒中EC的污染水平中，EC的中位數(shù)為24.4μg/kg，均值為35.0μg/kg。

所有黃酒產(chǎn)品EC檢測結(jié)果見表3。由表3可知，氨基甲酸乙酯檢出42份，檢出率為70%（42/60），含量范圍為6.0μg/kg～123.7μg/kg，具體殘留量。

表2 黃酒中EC的污染水平Table 2 Pollution levels of ethyl carbamate in rice wine

表3 黃酒的EC檢測結(jié)果Table 3 Monitoring results of rice wine

2.3.1 產(chǎn)品批號分析

從表3可以得知，所有樣本的生產(chǎn)批號為2010年至2012年之間。其中，未檢出的18份樣本，其生產(chǎn)批號在這個期間內(nèi)，與其他產(chǎn)品批號之間并無差異。因此，樣本的氨基甲酸乙酯含量與生產(chǎn)批號無關(guān)。

2.3.2 產(chǎn)品產(chǎn)地分析

從表3中可以得知，樣本產(chǎn)地來源于南昌市的有18個，其中未檢出的樣本有7個，未檢出率為38.9%；樣本產(chǎn)地來源于撫州市的有8個，其中未檢出的樣本有3個，未檢出率為37.5%；樣本產(chǎn)地來源于吉安市的有10個，其中未檢出的樣本有3個，未檢出率為30.0%；樣本產(chǎn)地來源于井岡山市的有5個；樣本產(chǎn)地來源于九江市、萍鄉(xiāng)市的各有1個，其中未檢出的樣本各有1個，未檢出率為100%；樣本產(chǎn)地來源于樟樹市的有6個，其中未檢出的樣本有3個，未檢出率為50.0%；樣本產(chǎn)地來源于新余市的有6個，未檢出率為0%；樣本產(chǎn)地來源于宜春市的有5個，未檢出率為0%。從地域分布看，南昌市、九江市、萍鄉(xiāng)市、撫州市和吉安市分別位于江西省的東南西北4個方位，分別與湖南省、湖北省和福建省接近，這些省的經(jīng)濟(jì)發(fā)展比較快，會促進(jìn)鄰省地市的經(jīng)濟(jì)發(fā)展。而新余、宜春處于江西的中部，經(jīng)濟(jì)發(fā)展相對會受到一定影響。地域的差異會影響到當(dāng)?shù)厣a(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)規(guī)模、生產(chǎn)工藝等，從而影響黃酒的品質(zhì)，造成黃酒中氨基甲酸乙酯的含量不同。

2.4 氨基甲酸乙酯分析

2.4.1 氨基甲酸乙酯的限量分析

1985年，加拿大的衛(wèi)生與福利組織（canadian depart mentof healthandwelfare，CDHW）首先規(guī)定了各類酒中的EC限量，隨后多國也制定了限量條例[8-10]。關(guān)于黃酒中氨基甲酸乙酯的限量，國際上尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[11-12]。目前，我國尚無黃酒中氨基甲酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)，制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)已非常重要。

2.4.2 氨基甲酸乙酯的危害及降解分析

氨基甲酸乙酯主要在煎酒和貯酒過程中形成，煎酒溫度高，能提高黃酒的穩(wěn)定性，但隨煎酒溫度的升高和煎酒時間的延長，酒液中的尿素和乙醇會加速形成更多的氨基甲酸乙酯[13]。黃酒中EC具有致癌的特點(diǎn)會對人們的身體健康造成一定的負(fù)面影響。LUSTER M I等[14]對5～7周的雌性雜交小鼠飼喂不同劑量的氨基甲酸乙酯，觀察其免疫功能的變化，結(jié)果顯示，在不同劑量的氨基甲酸乙酯作用下，引起了嚴(yán)重骨髓抑制，而對體液免疫、細(xì)胞免疫和巨噬細(xì)胞的功能影響較少。為了降低黃酒中的氨基甲酸乙酯殘留量，可通過適當(dāng)?shù)乜刂瓢l(fā)酵條件降低酒中胺類化合物的含量，或向完成發(fā)酵的酒中添加酸性尿酶等措施[15]。

3 結(jié)論

本次檢測的江西產(chǎn)60份黃酒樣本中，EC的中位數(shù)為24.4μg/kg，均值為35.0μg/kg，參照國際標(biāo)準(zhǔn)（EC含量≤20μg/L）[16]，低于國際標(biāo)準(zhǔn)值的有35份（占58.33%），高于國際標(biāo)準(zhǔn)值的有25份（占41.67%），這表明，生產(chǎn)工藝和生產(chǎn)條件等的限制，使得國內(nèi)部分黃酒中的氨基甲酸乙酯殘留量處于比較高的水平。通過分析黃酒中的氨基甲酸乙酯殘留量，可以為我國制定國家標(biāo)準(zhǔn)和對黃酒中氨基甲酸乙酯的污染水平評估提供數(shù)據(jù)支持，并且通過進(jìn)一步對降低黃酒中氨基甲酸乙酯的含量進(jìn)行深入研究，更加有利于確保酒精飲料的安全。

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Determination of ethyl carbamate residue in Jiangxi rice wine by GC-MS

SONG Lijun1,YANG Zhu2,ZHOU Yingu1*,LI Tenggen1,LIU Ruihong1,MAO Shanggen1,LIU Fangyu1,LI Biao1
(1.Xinyu City Center for Disease Control and Prevention,Xinyu 338025;2 Xinyu City Yushui District Center for Disease Control and Prevention,Xinyu 338025,China)

The ethyl carbamate(EC)content of 60 wine samples produced by Jiangxi province was detected by GC-MS.The sample was added with ethyl carbamate-d5(D5-EC),then absorbed into a column of extrelut and eluted with ethyl ether,separated by GC-MS on a DB-INNOWAX capillary column(30m×0.25mm×0.25μm)and quantified by internal standard method.The result show that the average recovery and the relative standard deviation of EC content were 107.5%and 1.33%(n=2),respectively.The median value of EC content was 24.4 μg/kg and average value was 35.0 μg/kg in rice wine EC pollution levels.Within the 60 samples,the positive detection rate of EC content was 70%,and the EC content were between 6.0-123.7 μg/L.Through the survey of EC residue content of rice wine produced by Jiangxi,it would provide data support to draw up the national standards and assess the EC pollution levels of wine for China.

GC-MS;rice wine;ethyl carbamate

TS262.4

A

0254-5071（2014）03-0147-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.035

2013-12-29

新余市科技計(jì)劃項(xiàng)目（20123090851）

宋利軍（1984-），男，碩士，主要從事國家食品安全風(fēng)險監(jiān)測工作。

*通訊作者：周銀古（1968-），男，高級技師，本科，主要從事理化檢驗(yàn)工作。