電針聯(lián)合BMSCs移植治療對出血性腦卒中大鼠血清BMP表達的影響

鄭宇杰　湯華軍　范光碧　楊朝鮮

【摘要】 目的：探討電針聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）移植治療對出血性腦卒中大鼠血清髓鞘堿性蛋白（MBP）表達的影響。方法：將培養(yǎng)的BMSCs和生理鹽水分別移植入腦出血模型大鼠尾殼核內(nèi)，將NSS評分≥9分的模型大鼠隨機分為4個實驗組：生理鹽水組（NS組）；電針組（Ea組）；BMSCs移植組（BMSCs組）；電針聯(lián)合BMSCs移植組（Ea BMSCs組），每組25只。另選正常對照組（Normal組）5只，不做任何處理；假手術(shù)組（FO組）5只，造模和移植都同步麻醉和進針但不注入任何藥物。用MK3全自動酶標儀對血清中MBP進行ELISA檢測。結(jié)果：腦出血各治療組MBP第1天表達最高，隨即下降第3天達谷底，隨后快速上升第7天達到波峰后下降，但都高于FO組和Normal組（P<0.05）。與NS組比較：Ea組第5、7、14天MBP表達低于NS組（P<0.05）；BMSCs組MBP表達第14天低于NS組（P<0.05）；Ea BMSCs組第5、7、14天MBP表達顯著低于NS組（P<0.01）。與Ea BMSCs組比較：Ea組第1、3天MBP表達低于Ea BMSCs組（P<0.05），第14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）；BMSCs組MBP表達第5、7、14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）。結(jié)論：電針聯(lián)合BMSCs移植治療腦出血能有效保護神經(jīng)組織減輕脫髓鞘反應(yīng)，降低MBP的表達。

【關(guān)鍵詞】 電針； 骨髓間充質(zhì)干細胞； 移植； 腦出血； 髓鞘堿性蛋白

研究表明將骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）移植入腦出血大鼠，BMSCs能存活、遷徙、分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，減少損傷體積，促進神經(jīng)功能的恢復[1-2]。臨床實踐與動物實驗表明電針對腦出血運動功能恢復具有明顯促進作用[3]，但對其機制的研究還不夠深入。髓鞘堿性蛋白（Myelin basic protein，MBP）是構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的一種堿性蛋白，神經(jīng)組織損傷時髓鞘崩解，MBP從神經(jīng)纖維髓鞘上脫落，MBP含量較正常生理狀態(tài)下急劇增高，其血清含量的增高是急性腦實質(zhì)損傷和脫髓鞘改變的特異性生化指標[4]。本研究旨在探討電針聯(lián)合BMSCs移植治療對腦出血大鼠血清MBP表達的影響，為電針聯(lián)合BMSCs移植治療腦出血的神經(jīng)保護機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 成年SD雄性大鼠110只，體質(zhì)量200～300 g，由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供；Rat Mesenchymal Stem cell購自賽業(yè)生物科技有限公司；肝素鈉注射液購自上海市醫(yī)藥股份有限公司；I型膠原酶購自Sigma公司；α-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；MBP抗體，MBP酶標抗體，SABGCy3購自武漢博士德；HM 6805-Ⅱ型經(jīng)穴治療儀購自四川恒明科技開發(fā)有限公司；Multiskan MK3全自動酶標儀購自博奧通科科技（北京）有限公司。

1.2 大鼠腦出血動物模型制備 用5 ?L微量注射器抽取2 U/?L的肝素鈉1 ?L和0.125 U/?L的膠原酶2 ?L，然后固定在立體定位儀上。實驗大鼠用1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg的標準進行腹腔注射麻醉；然后固定于立體定位儀上，作顱頂中線切口12 mm，用30%H2O2腐蝕暴露前囟及冠狀縫，以前囟為基點，向前0.2 mm，向右3 mm，開顱鉆鉆孔至硬腦膜，沿鉆孔進針6 mm，將肝素鈉和膠原酶溶液緩慢注入尾殼核內(nèi)，留針5 min，緩慢退針，速度為1 mm/min，骨蠟封閉鉆孔，消毒縫合切口。

1.3 BMSCs復蘇、培養(yǎng)、傳代及誘導 在超凈工作臺內(nèi)打開凍存管，將解凍后的細胞轉(zhuǎn)入離心管中加入10倍體積的改良型α-MEM培養(yǎng)基，吸管輕吹均勻。1000 rpm離心4 min。棄上清，加入含15%胎牛血清的的α-MEM培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度以5×105/mL[5]。轉(zhuǎn)入25 mm2培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當細胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶壁75%～80%左右時傳代。細胞移植前，將貼壁達80%融合BMSCs的培養(yǎng)基，更換為預誘導液培養(yǎng)24 h，再更換為誘導液誘導6 h后，收集細胞，調(diào)整細胞密度以2.5×107/mL，置于培養(yǎng)基中備用。

1.4 BMSCs移植及電針治療 在造模成功后第3天，用腦立體定位儀進行固定，取細胞懸液20 ?L沿造模孔緩慢注入尾殼核，速度為5 ?L/min，留針5 min，緩慢退針，骨蠟封閉鉆孔，消毒縫合切口。在造模成功后第3天，對大鼠捆綁固定，參照林文注等[6]編著的《實驗針灸學》，應(yīng)用30號l寸毫針，選取百會穴及大椎穴進針，毫針接HM 6805-Ⅱ型經(jīng)穴治療儀，頻率3 Hz，強度1 V，連續(xù)波，持續(xù)10 min，1次/d，直至取材時間點。

1.5 實驗分組 實驗設(shè)對照組和實驗組。正常對照組（Normal組）5只，不做任何處理；假手術(shù)組（FO組）5只，造模和移植都同步麻醉和進針但不注入任何藥物。將NSS評分≥9分的模型大鼠隨機分為4個實驗組：生理鹽水組（NS組）；電針組（Ea組）；BMSCs移植組（BMSCs組）；電針聯(lián)合BMSCs移植組（Ea BMSCs組），每組25只，按照取材時間（1、3、5、7、14 d）不同分為5個亞組，每個時間點5只。NS組大鼠注射20 ?L生理鹽水，BMSCs組大鼠注射20 ?L細胞懸液，Ea BMSCs組大鼠注射20 ?L細胞懸液后再進行電針刺激，Ea組只進行電針治療不移植。

1.6 標本采集 在相應(yīng)時間點麻醉大鼠，剪開胸腔，用采血針刺入左心室采血3～5 mL，用不抗凝專用試管收集標注，4 ℃靜置30 min后，4000 r冷凍離心10 min，取血清分裝標注，-80 ℃冰箱保存待檢。

1.7 血清MBP檢測 用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測。將預包被MBP抗體的酶標板、試劑等平衡至室溫，分別在相應(yīng)孔內(nèi)加入待檢血清、陰性對照、陽性對照。每孔滴加酶標抗體，置37 ℃溫育60 min。室溫平衡5 min，甩干孔內(nèi)液體，用洗液洗滌5次，扣干。每孔加顯色劑，輕拍混勻。酶標儀測定OD值，用空白調(diào)零。樣品OD值/臨界值≥1為陽性，樣品OD值/臨界值<1為陰性，陰性對照OD值≥0.1時，重復試驗。

1.8 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示，單因素方差分析組內(nèi)差異，獨立樣本t檢驗分析組間差異，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

各組MBP第1天表達最高，隨即下降第3天達谷底，隨后快速上升第7天達到波峰后下降。與NS組比較：Ea組第5、7、14天MBP表達低于NS組（P<0.05）；BMSCs組MBP表達第14天低于NS組（P<0.05）；Ea BMSCs組第5、7、14天MBP表達顯著低于NS組（P<0.01）。與Ea BMSCs組比較：Ea組第1、3天MBP表達低于Ea BMSCs組（P<0.05），第14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）；BMSCs組MBP表達第5、7、14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）；腦出血各治療組14天時仍高于FO組和Normal組（P<0.05）。見表1、圖1、圖2。

3 討論

研究證實腦出血大鼠進行BMsCs移植，細胞能存活、遷徙，分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，減少損傷體積，促進神經(jīng)功能的恢復[1-2]。百會與大椎均為督脈穴位，督脈與腦密切相關(guān)[7]，電針百會與大椎穴可增加腦的供血，減輕腦的缺血缺氧，減輕腦水腫，減輕膜脂質(zhì)過氧化，進而抑制自由基的損傷，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化/抗氧化平衡，減少鈣超載，起到保護神經(jīng)元的作用[8]。

神經(jīng)系統(tǒng)功能主要體現(xiàn)在于信息的轉(zhuǎn)化、傳遞、整合、記憶和運用。其中信息有效及時的傳遞非常重要，而信息的傳遞主要依賴神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)和功能的健全。髓鞘堿性蛋白（MBP）是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的一種堿性蛋白，與髓鞘脂質(zhì)緊密結(jié)合，髓鞘結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定，MBP是重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，在正常情況下，血清中的MBP含量較低，在有髓纖維發(fā)生脫髓鞘病變時會明顯上升[9-10]。故MBP含量變化能特異地反映脫髓鞘損害程度，也是神經(jīng)病損的判斷指標之一[4，11-12]。腦出血后因為占位效應(yīng)，可引起髓鞘的崩解，神經(jīng)元的壞死、腦水腫形成等繼發(fā)性損傷，導致細胞膜破壞，使MBP進入血液，其含量升高。研究證實外傷性腦出血患者，血清MBP含量在早期即顯著升高，與損傷程度和預后緊密相關(guān)[4，13]，MBP可作為特異的生化指標，判斷顱腦損傷程度及預后。MBP由于降解作用，在傷后24 h應(yīng)下降至正常，艾文兵等[4]研究卻發(fā)現(xiàn)，血清MBP含量常持續(xù)較高水平7～9 d，目前認為與顱腦損傷后繼發(fā)性腦損害有關(guān)[4，13]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)各治療組在第1天MBP表達明顯增高，隨后下降，第3天達波谷后再次上升到第7天達波峰，隨后下降，但都高于假手術(shù)組和正常組，與艾文兵等[4]研究基本一致。筆者研究同時發(fā)現(xiàn)，NS組MBP的表達在第5、7、14天明顯高于其他治療組，Ea BMSCs組MBP表達比單一電針治療和單一BMSCs移植治療分別在第14天和第5、7、14天有明顯下降。表明電針聯(lián)合BMSCs移植治療更能保護神經(jīng)纖維減輕脫髓鞘反應(yīng)，減少MBP的產(chǎn)生，從而促進出血腦性腦損傷的恢復。

參考文獻

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[10]曾琳，楊恒文，邵陽，等.NGF對坐骨神經(jīng)損傷后腰髓與損傷神經(jīng)MBP含量變化的影響[J].第三軍醫(yī)人學學報，2002，24（3）：326.

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[13]范小璇，趙曉平，梁格婷，等.健腦益智膠囊對外傷性腦出血患者血清人髓鞘堿性蛋白含量的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20（4）：400-404.

（收稿日期：2013-07-09） （本文編輯：蔡元元）

1.8 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示，單因素方差分析組內(nèi)差異，獨立樣本t檢驗分析組間差異，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

各組MBP第1天表達最高，隨即下降第3天達谷底，隨后快速上升第7天達到波峰后下降。與NS組比較：Ea組第5、7、14天MBP表達低于NS組（P<0.05）；BMSCs組MBP表達第14天低于NS組（P<0.05）；Ea BMSCs組第5、7、14天MBP表達顯著低于NS組（P<0.01）。與Ea BMSCs組比較：Ea組第1、3天MBP表達低于Ea BMSCs組（P<0.05），第14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）；BMSCs組MBP表達第5、7、14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）；腦出血各治療組14天時仍高于FO組和Normal組（P<0.05）。見表1、圖1、圖2。

3 討論

研究證實腦出血大鼠進行BMsCs移植，細胞能存活、遷徙，分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，減少損傷體積，促進神經(jīng)功能的恢復[1-2]。百會與大椎均為督脈穴位，督脈與腦密切相關(guān)[7]，電針百會與大椎穴可增加腦的供血，減輕腦的缺血缺氧，減輕腦水腫，減輕膜脂質(zhì)過氧化，進而抑制自由基的損傷，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化/抗氧化平衡，減少鈣超載，起到保護神經(jīng)元的作用[8]。

神經(jīng)系統(tǒng)功能主要體現(xiàn)在于信息的轉(zhuǎn)化、傳遞、整合、記憶和運用。其中信息有效及時的傳遞非常重要，而信息的傳遞主要依賴神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)和功能的健全。髓鞘堿性蛋白（MBP）是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的一種堿性蛋白，與髓鞘脂質(zhì)緊密結(jié)合，髓鞘結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定，MBP是重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，在正常情況下，血清中的MBP含量較低，在有髓纖維發(fā)生脫髓鞘病變時會明顯上升[9-10]。故MBP含量變化能特異地反映脫髓鞘損害程度，也是神經(jīng)病損的判斷指標之一[4，11-12]。腦出血后因為占位效應(yīng)，可引起髓鞘的崩解，神經(jīng)元的壞死、腦水腫形成等繼發(fā)性損傷，導致細胞膜破壞，使MBP進入血液，其含量升高。研究證實外傷性腦出血患者，血清MBP含量在早期即顯著升高，與損傷程度和預后緊密相關(guān)[4，13]，MBP可作為特異的生化指標，判斷顱腦損傷程度及預后。MBP由于降解作用，在傷后24 h應(yīng)下降至正常，艾文兵等[4]研究卻發(fā)現(xiàn)，血清MBP含量常持續(xù)較高水平7～9 d，目前認為與顱腦損傷后繼發(fā)性腦損害有關(guān)[4，13]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)各治療組在第1天MBP表達明顯增高，隨后下降，第3天達波谷后再次上升到第7天達波峰，隨后下降，但都高于假手術(shù)組和正常組，與艾文兵等[4]研究基本一致。筆者研究同時發(fā)現(xiàn)，NS組MBP的表達在第5、7、14天明顯高于其他治療組，Ea BMSCs組MBP表達比單一電針治療和單一BMSCs移植治療分別在第14天和第5、7、14天有明顯下降。表明電針聯(lián)合BMSCs移植治療更能保護神經(jīng)纖維減輕脫髓鞘反應(yīng)，減少MBP的產(chǎn)生，從而促進出血腦性腦損傷的恢復。

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[10]曾琳，楊恒文，邵陽，等.NGF對坐骨神經(jīng)損傷后腰髓與損傷神經(jīng)MBP含量變化的影響[J].第三軍醫(yī)人學學報，2002，24（3）：326.

[11] Omana-Zapata l，Khabbaz M A，Hunter J C，et al.QX-314 inhabbits ectopic nerve activityassociated with neuropathic pain[J].Brain Res，1997，771（2）：228-231.

[12] Fisher J，Levkovitch V H，Schori H，et al.Vaccination for neuroprotection in themouse optic nerve： implications for optic neuropathies[J].J Neurosci，2001，21（3）：136-139.

[13]范小璇，趙曉平，梁格婷，等.健腦益智膠囊對外傷性腦出血患者血清人髓鞘堿性蛋白含量的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，20（4）：400-404.

（收稿日期：2013-07-09） （本文編輯：蔡元元）

1.8 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示，單因素方差分析組內(nèi)差異，獨立樣本t檢驗分析組間差異，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

各組MBP第1天表達最高，隨即下降第3天達谷底，隨后快速上升第7天達到波峰后下降。與NS組比較：Ea組第5、7、14天MBP表達低于NS組（P<0.05）；BMSCs組MBP表達第14天低于NS組（P<0.05）；Ea BMSCs組第5、7、14天MBP表達顯著低于NS組（P<0.01）。與Ea BMSCs組比較：Ea組第1、3天MBP表達低于Ea BMSCs組（P<0.05），第14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）；BMSCs組MBP表達第5、7、14天高于Ea BMSCs組（P<0.05）；腦出血各治療組14天時仍高于FO組和Normal組（P<0.05）。見表1、圖1、圖2。

3 討論

研究證實腦出血大鼠進行BMsCs移植，細胞能存活、遷徙，分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，減少損傷體積，促進神經(jīng)功能的恢復[1-2]。百會與大椎均為督脈穴位，督脈與腦密切相關(guān)[7]，電針百會與大椎穴可增加腦的供血，減輕腦的缺血缺氧，減輕腦水腫，減輕膜脂質(zhì)過氧化，進而抑制自由基的損傷，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化/抗氧化平衡，減少鈣超載，起到保護神經(jīng)元的作用[8]。

神經(jīng)系統(tǒng)功能主要體現(xiàn)在于信息的轉(zhuǎn)化、傳遞、整合、記憶和運用。其中信息有效及時的傳遞非常重要，而信息的傳遞主要依賴神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)和功能的健全。髓鞘堿性蛋白（MBP）是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的一種堿性蛋白，與髓鞘脂質(zhì)緊密結(jié)合，髓鞘結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定，MBP是重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，在正常情況下，血清中的MBP含量較低，在有髓纖維發(fā)生脫髓鞘病變時會明顯上升[9-10]。故MBP含量變化能特異地反映脫髓鞘損害程度，也是神經(jīng)病損的判斷指標之一[4，11-12]。腦出血后因為占位效應(yīng)，可引起髓鞘的崩解，神經(jīng)元的壞死、腦水腫形成等繼發(fā)性損傷，導致細胞膜破壞，使MBP進入血液，其含量升高。研究證實外傷性腦出血患者，血清MBP含量在早期即顯著升高，與損傷程度和預后緊密相關(guān)[4，13]，MBP可作為特異的生化指標，判斷顱腦損傷程度及預后。MBP由于降解作用，在傷后24 h應(yīng)下降至正常，艾文兵等[4]研究卻發(fā)現(xiàn)，血清MBP含量常持續(xù)較高水平7～9 d，目前認為與顱腦損傷后繼發(fā)性腦損害有關(guān)[4，13]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)各治療組在第1天MBP表達明顯增高，隨后下降，第3天達波谷后再次上升到第7天達波峰，隨后下降，但都高于假手術(shù)組和正常組，與艾文兵等[4]研究基本一致。筆者研究同時發(fā)現(xiàn)，NS組MBP的表達在第5、7、14天明顯高于其他治療組，Ea BMSCs組MBP表達比單一電針治療和單一BMSCs移植治療分別在第14天和第5、7、14天有明顯下降。表明電針聯(lián)合BMSCs移植治療更能保護神經(jīng)纖維減輕脫髓鞘反應(yīng)，減少MBP的產(chǎn)生，從而促進出血腦性腦損傷的恢復。

參考文獻

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（收稿日期：2013-07-09） （本文編輯：蔡元元）