肝動脈灌注化療抑制肝癌血管生成的研究

鄭驚雷等

【摘要】 目的：通過對肝癌大鼠進行肝動脈區(qū)域灌注化療，研究其對腫瘤血管生成的影響。方法：建立大鼠肝癌模型后，將造模2周后的肝內(nèi)荷瘤大鼠18只，按照隨機數(shù)字表法分為對照組、外周靜脈組和肝動脈組各6只。大鼠的5-FU給藥劑量為20 mg/kg，連續(xù)給藥4 d。化療結(jié)束后第7天摘取肝臟腫瘤，采用免疫組化法檢測VEGF和CD34在肝癌組織中的表達。通過VEGF蛋白染色測定積分光密度（IOD），CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞檢測腫瘤內(nèi)微血管密度（MVD）。結(jié)果：對照組VEGF表達（IOD值）為（46351.48±2926.24），明顯高于外周靜脈組（43678.84±2852.76）和肝動脈組（35518.86±2657.16），且肝動脈組的肝癌VEGF表達明顯低于外周靜脈組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而肝動脈組肝癌組織CD34蛋白表達和MVD最低（36.26±8.43），均明顯低于外周靜脈組（62.08±10.77）和對照組（69.74±16.60），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而外周靜脈組和對照組的CD34蛋白表達和MVD比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：肝動脈灌注化療能有效抑制肝癌組織VEGF表達，降低MVD，從而抑制腫瘤血管生成。

【關(guān)鍵詞】 肝癌； 肝動脈灌注化療； 血管生成； 血管內(nèi)皮生長因子； 微血管密度

肝動脈灌注化療是肝癌常用的區(qū)域灌注化療方法，目前常作為肝癌術(shù)后治療和不能切除的晚期肝癌治療的重要手段。既往的研究提示經(jīng)肝動脈區(qū)域灌注化療可顯著提高肝臟組織藥物濃度，同時達到減少藥物在外周血和全身其他部位分布[1]?；熕幬镆种颇[瘤血管生成是抗腫瘤的重要機制，本文以5-Fu為化療代表藥物，通過對肝癌大鼠進行肝動脈區(qū)域灌注化療，研究其對腫瘤血管生成的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 兔抗鼠CD34多克隆抗體，VEGF多克隆抗體，武漢博士德有限公司生產(chǎn)。DAB顯色試劑盒，SP即用型試劑盒，PBS緩沖液，福州邁新有限公司生產(chǎn)。5-FU由南通精華制藥公司提供，批號：070402，規(guī)格10 mL：0.25 g。

1.2 腫瘤細(xì)胞株和實驗動物 CBRH-7919大鼠肝癌細(xì)胞株，中山大學(xué)細(xì)胞保藏中心提供。（1）BALB/c雄性裸鼠2只，17.1～19.6 g重，作種鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞。（2）Wistar雄性大鼠18只，（120±15）g重，作肝內(nèi)種植腫瘤用。上述動物均為SPF（無特定病原）級，由中山大學(xué)動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 大鼠肝癌模型的建立 將培養(yǎng)好的大鼠肝癌細(xì)胞注射于裸小鼠背部皮下，2周后成瘤并取出，切成l mm×l mm×1 mm瘤塊。然后采用肝內(nèi)隧道植入法將瘤塊接種于Wistar大鼠肝左葉。手術(shù)當(dāng)天始腹腔注射氫化可的松2 mg/只/d×5 d。術(shù)后密切觀察造模后荷瘤大鼠的生物學(xué)行為、死亡情況等。

1.3.2 實驗分組及給藥 造模2周后，將18只荷瘤大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組（不作任何處理）、外周靜脈組（經(jīng)尾靜脈注射）、肝動脈組（經(jīng)胃十二指腸動脈插管至肝動脈給藥），6只/組。大鼠的5-FU給藥劑量為20 mg/kg，連續(xù)給藥4 d。

1.3.3 標(biāo)本采集和處理 化療結(jié)束后第7天處死大鼠摘除肝臟腫瘤組織，并置于10%福爾馬林中固定后石蠟包埋。將瘤體石蠟標(biāo)本塊切片，厚度約5 μm。脫蠟后通過微波加熱法修復(fù)抗原，予免疫組織化學(xué)染色。每例標(biāo)本取2張切片，滴加CD34抗體和VEGF多抗各1滴。

1.3.4 VEGF檢測 標(biāo)本經(jīng)染色封片后在顯微鏡下（×200）觀察，細(xì)胞漿顯示棕黃色顆粒為VEGF陽性細(xì)胞。每張切片選陽性表達最高的5個高倍視野（×400）照相，采用IPP 圖像分析軟件將VEGF蛋白染色的黃色區(qū)域作為AOI（area of interest）測定分析光密度。取5個視野的積分光密度（IOD）平均值作為該標(biāo)本的表達強度計量值。

1.3.5 MVD檢測 參照Weidner的標(biāo)準(zhǔn)計算各組腫瘤內(nèi)的微血管密度（MVD）：低倍鏡下（×100）尋找切片中棕黃染色密度最高的區(qū)域，即為富含血管組織的“熱點”區(qū)。再在高倍鏡下（×400）按染色為棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞均記為一條獨立血管的標(biāo)準(zhǔn)計算血管數(shù)目。每張切片分別選10個不同高倍視野計算MVD，取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝癌組織VEGF表達比較 細(xì)胞漿內(nèi)染色為棕黃色為陽性。各組陽性染色深淺不均，肝動脈組較淺，外周靜脈組次之，對照組染色最深。圖像分析后比較，結(jié)果顯示對照組VEGF表達明顯高于外周靜脈組和肝動脈組，且肝動脈組的肝癌VEGF表達明顯低于外周靜脈組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 各組肝癌組織CD34的表達及MVD結(jié)果比較 各組MVD具有相似的分布特征：腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色，且分布不均勻，壞死組織周圍及腫瘤邊緣MVD相對較高。肝動脈組的肝癌組織CD34蛋白表達和MVD最低，均明顯低于外周靜脈組和對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而外周靜脈組和對照組的CD34蛋白表達和MVD比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

區(qū)域灌注化療可以增加癌灶和靶組織器官的化療藥物濃度和/或降低外周血及其他組織的藥物分布，是目前實體腫瘤化療增效減毒的重要措施和手段之一[1-2]。肝動脈灌注化療由于具有較明顯的藥動學(xué)優(yōu)勢，常作為肝癌化療的常用手段[3-4]。原發(fā)性肝癌（HCC）是典型的富血供惡性腫瘤，它的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移時刻離不開腫瘤新生血管。腫瘤血管生成是HCC生長和轉(zhuǎn)移的先決條件，如果腫瘤組織沒有新生血管支持，則因凋亡和壞死而腫瘤不會大于1～2 mm[5]。而肝癌預(yù)后則與癌組織的血管生成調(diào)節(jié)因子水平和微血管密度（MVD）密切相關(guān)[6-7]。endprint

VEGF目前被認(rèn)為是體內(nèi)最強的一種血管生成因子，其在肝細(xì)胞癌中呈高表達，與腫瘤的生長和預(yù)后緊密相關(guān)[8-10]。腫瘤微血管密度和VEGF的表達水平直接關(guān)聯(lián)，提示VEGF使腫瘤血管生成會導(dǎo)致肝癌的浸潤、生長轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。5-FU經(jīng)多年臨床應(yīng)用顯示毒副作用較小的對肝癌細(xì)胞敏感性較好的藥物，是肝癌化療目前最常用的藥物之一[11-12]。本實驗以5-FU作為化療代表藥物進行研究，結(jié)果顯示兩個化療組VEGF表達均明顯低于對照組（P<0.05），提示5-FU能抑制腫瘤細(xì)胞合成與分泌VEGF，減低其對血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激所致的過度增生，同時通過控制VEGF分泌實現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞增殖，從而說明5-FU可使VEGF表達下調(diào)，使血管生成受抑制而控制腫瘤生長。肝動脈組的VEGF表達明顯低于外周靜脈組（P<0.05），說明肝動脈化療比外周靜脈給藥更能有效減低VEGF表達。筆者既往的研究顯示肝動脈灌注化療的肝組織藥物濃度明顯高于經(jīng)外周靜脈給藥，綜合提示了不僅化療可以抑制VEGF在肝癌組織中的表達，而且一定程度上5-FU的藥物濃度和VEGF在腫瘤組織中表達水平呈負(fù)相關(guān)[1]。

MVD是反映肝細(xì)胞癌腫瘤血管生成情況的一項指標(biāo)[13-14]。CD34則是目前最敏感的腫瘤血管標(biāo)記物[15]。本課題采用CD34對血管內(nèi)皮細(xì)胞進行標(biāo)記來檢測腫瘤組織中的的MVD。研究結(jié)果顯示肝動脈組的肝癌組織MVD最低，均明顯低于對照組和外周靜脈化療組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；但對照組和外周靜脈組的MVD比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。提示肝動脈灌注化療可以有效降低肝癌組織的血管密度，而經(jīng)外周靜脈注射化療則對降低肝細(xì)胞癌腫瘤微血管密度，抑制腫瘤血管生成效果不顯著。綜上所述，肝動脈灌注化療能有效抑制肝癌組織VEGF表達，降低腫瘤MVD，從而抑制腫瘤血管生成。

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（收稿日期：2013-10-23） （本文編輯：歐麗）endprint