獨(dú)流減河野生鯽魚的同工酶分析

張文術(shù)，張大莉，郝 君，楊 薔，董 仕

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

鯽魚屬鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidac）、鯽屬（Carassius）.我國鯽屬魚類有黑鯽（Carassius carassius）、鯽 （Carassius auratus auratus） 以及銀鯽（Carassius auratus gibelio）.依據(jù)形態(tài)、染色體數(shù)和繁殖特性將各地的鯽魚分為野鯽、紅鯽、方正銀鯽等.在選育種方面，也已培育出多個(gè)養(yǎng)殖品種或雜交種[1-3].國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用同工酶、線粒體 DNA（mtDNA）、RAPD、微衛(wèi)星DNA等遺傳標(biāo)記對野生鯽魚、選育品種、鯉鯽雜交子代等進(jìn)行了多方面的遺傳分析[4-8].

同工酶由一個(gè)或多個(gè)基因座位編碼，能夠催化同一生化反應(yīng)，在電場中的運(yùn)動(dòng)有多種可分離形式[9].同工酶分析能夠揭示生物種群的遺傳結(jié)構(gòu)，識(shí)別從形態(tài)學(xué)上不容易區(qū)別的近緣種，也可檢測種群的遺傳多樣性，分析物種之間的親緣關(guān)系[10].檢測行有性生殖二倍體生物的同工酶的遺傳結(jié)構(gòu)，可以計(jì)算出多態(tài)基因座位的比例、單位基因座位的等位基因數(shù)、平均雜合度觀察值、平均雜合度預(yù)期值等遺傳變異指標(biāo)[11-12].鯽魚中有染色體數(shù)為100條的二倍體種群和染色體數(shù)為150條左右的三倍體種群.對于三倍體鯽魚，由于含有3套染色體組，每一基因座位有3個(gè)等位基因，依據(jù)同工酶電泳圖譜難以判別基因型，同工酶分析一般只進(jìn)行電泳條帶差異性、組織表達(dá)特異性、克隆鑒別等研究[4，13-16].對于二倍體鯽魚，羅莉中等[15]、王春元等[17]、汪亞平等[18]分別對金魚的同工酶、洪湖和洞庭湖鯽魚的同工酶進(jìn)行了檢測分析.作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的養(yǎng)殖種類以及雜交育種中重要的育種材料，對二倍體鯽魚遺傳結(jié)構(gòu)的研究尤為重要.本課題組應(yīng)用同工酶檢測技術(shù)研究了采自天津市獨(dú)流減河的野生鯽魚同工酶的遺傳變異情況，以期為鯽魚資源的種質(zhì)鑒定、保護(hù)利用以及遺傳育種等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

2012年11月在獨(dú)流減河用刺網(wǎng)捕獲鯽魚47尾，鮮活狀態(tài)下測量體長為（11.93±1.10）cm、體重為（58.52±14.60）g，從臀鰭后尾柄基部采血制作血涂片.-20℃冷凍保存?zhèn)溆?

1.2 紅細(xì)胞大小的測量以及倍性判別

用吉姆薩染液對血涂片染色，在10×100高倍鏡下測量紅細(xì)胞的長徑.依據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行鯽魚倍數(shù)性的判別，標(biāo)準(zhǔn)為紅細(xì)胞長徑小于15μm的為二倍體鯽魚，15～19μm為三倍體鯽魚.

1.3 同工酶電泳檢測

使用水平式淀粉凝膠電泳法檢測獨(dú)流減河鯽魚肌肉和肝臟組織的同工酶，電泳及染色方法參照文獻(xiàn)[20]，使用 TBE（pH8.9）、C-T（pH8.0）、C-APM（pH6.0）3種緩沖液.采用文獻(xiàn) [21]的方法命名同工酶的縮寫名、編號(hào)、基因座位、等位基因和基因型.

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)電泳結(jié)果判斷每尾魚每種同工酶的基因型，依據(jù)基因型計(jì)算每種同工酶的基因頻率、多態(tài)基因座位數(shù)、多態(tài)基因座位比例、單位基因座位的等位基因數(shù)、平均雜合度觀察值、平均雜合度預(yù)期值，并對有變異的基因座位進(jìn)行哈代-溫伯格平衡的χ2檢驗(yàn)[12].

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞的大小

實(shí)驗(yàn)測得獨(dú)流減河野生鯽魚紅細(xì)胞的長徑范圍為11.16～14.42μm，平均為（12.45±0.71）μm，所有個(gè)體的紅細(xì)胞長徑均小于15μm，因此判定實(shí)驗(yàn)用魚均為二倍體鯽魚.

2.2 同工酶電泳結(jié)果

本研究檢測到獨(dú)流減河野生鯽魚中的7種同工酶和肌漿蛋白，其種類、編號(hào)、基因座位等如表1所示.

表1 檢測到的同工酶種類、編號(hào)及基因座位Tab.1 Isozyme names，E C numbers and loci of crucian carp

由表1可以看出，7種同工酶和肌漿蛋白共判別出18個(gè)基因座位.其中MDH的基因座位數(shù)為4個(gè)，AAT、GPI、IDH各含3個(gè)基因座位，LDH的基因座位數(shù)為2個(gè)，其余3種同工酶的基因座位數(shù)為1個(gè).在18個(gè)基因座位中，有變異的為8個(gè)，分別是AAT-3*、GPI-1*、GPI-2*、GPI-3*、IDH-2*、ME*、PGM*和PROT*，每個(gè)等位基因的基因頻率如表2所示，部分同工酶和肌漿蛋白的電泳圖譜如圖1所示，每一條帶下方為該條帶的基因組成，由于GPI-1*和GPI-2*電泳條帶較復(fù)雜，圖中繪出其示意圖.

表2 鯽魚基因座位及其等位基因頻率Tab.2 Loci and allele frequencies of isozymes of crucian carp

圖1 鯽魚同工酶電泳圖譜Fig.1 Isozymes electrophoretogram of crucian carp

每個(gè)基因座位基因型的判別依據(jù)為：每種酶中每個(gè)條帶出現(xiàn)的位置以及每個(gè)條帶的分子構(gòu)成.對于GPI而言，由于是二聚體酶，因此每條帶都是兩條相同或者不同的多肽鏈聚合而成.由表2和圖1可以看出，同工酶GPI的3個(gè)基因座位均含有3個(gè)等位基因，AAT-3、IDH-2、PGM、PROT、ME含有 2個(gè)等位基因，其余的基因座位只有一個(gè)等位基因.

遺傳變異結(jié)果中，群體的單位基因座位的等位基因數(shù)為1.611；如果按基因座位上最高基因頻率小于0.99的為多態(tài)基因座位，則8個(gè)有變異的基因座位均為多態(tài)，多態(tài)基因座位比例為44.4%；如果按基因座位上最高基因頻率小于0.95的為多態(tài)基因座位，則GPI-1*、GPI-2*、GPI-3*、ME*4個(gè)基因座位為多態(tài)，多態(tài)基因座位比例為22.2%；平均雜合度觀察值（Ho）為0.0715，平均雜合度預(yù)期值（He）為0.0767，二者的比值為0.9322，接近于1.

對有變異的基因座位進(jìn)行哈代-溫伯格平衡的χ2檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，p值均大于0.05，符合哈代-溫伯格平衡.

表3 鯽魚群體內(nèi)哈代-溫伯格平衡的χ2檢測Tab.3 χ2textfor departurefrom Hardy-Weinberg equilibrium in polymorphic isozyme locus of crucian carp

3 討論與結(jié)論

同工酶作為遺傳標(biāo)記之一廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種學(xué)研究，如物種的分類系統(tǒng)學(xué)研究[22]、遺傳多樣性分析、同種不同群體遺傳分化程度的研究[23]、河流中放流類型魚類的混合比例分析[24]、種類的鑒別[25]、野生銀鯽克隆的鑒別及親子代的遺傳特性分析[13-14]、鯉鯽雜交種的遺傳分析[26]等.

鯽魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，也是重要的育種材料.鯽魚中有染色體數(shù)為100的二倍體種群和染色體數(shù)為150左右的三倍體種群.本研究通過紅細(xì)胞大小判定采集自天津市獨(dú)流減河的野生鯽魚屬于二倍體，再對其進(jìn)行遺傳多樣性的檢測分析.同工酶在魚類的肌肉、肝臟、腎、心、腦、鰓等組織中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)相同但電泳帶遷移率不同或遷移率相同但電泳帶濃度不同的現(xiàn)象，表現(xiàn)出組織特異性[23].本研究依據(jù)同工酶的電泳帶數(shù)量、位置、濃度等可以看出二倍體野生鯽魚同工酶的表達(dá)有明顯的組織特異性，GPI-1*、GPI-2*、IDH-1*和 IDH-2*只在肝臟中表達(dá)，IDH-3*和GPI-3*只在肌肉中表達(dá).

在應(yīng)用同工酶檢測技術(shù)分析魚類的遺傳多樣性研究中，多態(tài)基因座位比例、單位基因座位的等位基因數(shù)、平均雜合度等是衡量遺傳多樣性的主要指標(biāo)[11-12].其中平均雜合度是度量遺傳變異的最簡單直接、最富信息量的方法[11].一般認(rèn)為貝類的平均雜合度為0.147，甲殼類的為0.043，魚類的為0.059，水生哺乳類為0.034[27].Smith等[28]報(bào)道了89種海水魚類的平均雜合度為0.060.汪亞平等[18]檢測出洪湖和洞庭湖鯽魚的平均雜合度分別為0.0702和0.1048.本研究分析了天津市獨(dú)流減河二倍體野生鯽魚的8種同工酶，檢測出18個(gè)基因座位，其中8個(gè)有變異，平均雜合度觀察值為0.0715，平均雜合度預(yù)期值為0.0767，高于以往研究中魚類的0.059[27]以及89種海水魚的0.060[28]，這些結(jié)果表明天津市獨(dú)流減河二倍體野生鯽魚的遺傳多樣性較豐富.

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