3種硒化合物對刺參的急性毒性比較

周瑋，張津源，王祖峰，宋國斌

(1．大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023;2．大連寶發(fā)海珍品有限公司，遼寧大連116021)

20世紀70年代，世界衛(wèi)生組織宣布硒是生物體必需的微量元素，2000年，中國營養(yǎng)學(xué)會提出中國居民正常飲食中硒的攝入量嚴重不足［1］，此后通過富硒技術(shù)提高食品中的硒含量便成為中國國民補硒的主要渠道。富硒技術(shù)也稱作微量元素硒的生物有機化技術(shù)，水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，對克氏原螯蝦Procambarus clarkii的富硒研究，使蝦肉中的硒含量提高了200%［2］;而對大西洋鮭 Salmon salar、日本沼蝦Macrobrachium nipponense的研究表明，硒能夠顯著提高其生長速度。刺參Apostichopus japonicus作為中國北方海珍品養(yǎng)殖的主要種類之一，對其進行富硒技術(shù)研究，具有廣闊的市場前景。

目前，水產(chǎn)動物富硒技術(shù)中使用的硒源主要有兩類，即有機硒和無機硒。其中有機硒主要通過無機硒生物合成獲得，價格較為昂貴，以硒代蛋氨酸為主;無機硒來源較廣且相對便宜，主要為硒酸鈉和亞硒酸鈉，二者均能起到一定的富硒效果。但過量的硒化合物也會導(dǎo)致動物體內(nèi)自由基產(chǎn)生，從而對動物機體造成傷害［3-4］。另外，不同硒化合物對水產(chǎn)動物的毒性也不同［5-7］，Baumann 等［8］對黑鱸Micropterus salmodies和藍鰓太陽魚Lepomis macrochirus的研究表明，無機硒毒性是有機硒的3～5倍。而水產(chǎn)動物對無機硒的敏感性也因種類的不同有較大差異，以亞硒酸鈉為例，魚類對其敏感程度相對較差，其中斑馬魚 Brachydanio rerio［9］的96 h半致死濃度 (96 h LC50)為16．67 mg/L，泥鰍Misgurnus anguillicaudatus［10］的 96 h LC50為 44．8 mg/L，而海灣扇貝Argopecten irradiams［11］、大型水蚤Daphnia magna［12］的 96 h LC50僅 為 1．20、1．05 mg/L。關(guān)于硒對刺參的毒性，僅見孫振興等［13］進行了亞硒酸鈉對幼參的毒性研究，而有關(guān)不同硒化合物對刺參的毒性研究目前尚未見報道。本研究中，從富硒技術(shù)角度出發(fā)，選取常用的硒代蛋氨酸、亞硒酸鈉和硒酸鈉3種硒化合物，針對3種規(guī)格的刺參進行急性毒性試驗，研究了不同硒化合物對刺參的96 h LC50和安全濃度，旨在為富硒技術(shù)用于刺參養(yǎng)殖時的硒源選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗刺參取自大連寶發(fā)海珍品有限公司的海參養(yǎng)殖池塘，體質(zhì)量分別為(11．1±2．7)、(21．3±3．0)、(51．9 ±3．7)g，分別記為 10、20、50 g組，每組刺參200頭，分別置于20 m3水池中暫養(yǎng)3 d后進行試驗。

試驗藥品有硒代蛋氨酸、亞硒酸鈉和硒酸鈉(均為分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司)，分別用雙蒸水配制母液，試驗時用微量移液器將所需藥品的母液加入海水中稀釋至所需濃度。

1.2 方法

參考寇氏法設(shè)計預(yù)試驗和正式試驗，試驗海水為沙濾海水，試驗期間水溫為18℃，鹽度為28。

1．2．1 預(yù)試驗 根據(jù)3種刺參規(guī)格 (10、20、50 g)、3種硒化合物 (亞硒酸、硒代蛋氨酸、硒酸鈉)分別設(shè)置預(yù)試驗，每組放4頭刺參，采用接觸試毒法，觀察96 h，確定刺參全部死亡的劑量和零死亡的劑量。

1．2．2 急性毒性試驗 按照刺參規(guī)格和硒化合物的不同分別設(shè)計正式試驗。對每種規(guī)格的刺參進行3種硒化合物的急性毒性試驗，亞硒酸鈉、硒酸鈉均設(shè) 0(空白對照)、0．06、0．13、0．25、0．50、1．00 mg/L 6個濃度組，硒代蛋氨酸設(shè)0(空白對照)、0．13、0．25、0．50、1．00、2．00 mg/L 6 個濃度組，每個試驗設(shè)3個重復(fù)。硒化合物濃度的設(shè)定是將預(yù)試驗結(jié)果得出的最高劑量和最低劑量換算為常用對數(shù)，采用Korbor法按等對數(shù)間距設(shè)置。試驗前72 h停止投喂，采用靜水法并微量充氣，每組放10頭刺參，試驗時間為96 h，每天觀察3次刺參的中毒表現(xiàn)和死亡情況，并及時撿出死亡刺參，記錄死亡數(shù)量和中毒癥狀。

1.3 指標的測定

根據(jù)試驗結(jié)果計算 lg LC50，查反對數(shù)表得LC50及95%置信區(qū)間 (X)，計算公式為

其中:d為相鄰劑量比值的對數(shù);Xi、Xi+1分別為相鄰兩組的劑量對數(shù);Pi+1、Pi分別為相鄰兩組的動物死亡百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺參的中毒癥狀

刺參對硒代蛋氨酸、亞硒酸鈉、硒酸鈉的中毒反應(yīng)基本相同。在低劑量組，48 h內(nèi)刺參的活動情況與對照組沒有明顯差別，48 h后其活動及反應(yīng)能力逐漸遲緩，隨著中毒時間的延長，刺參部分管足喪失吸附能力并出現(xiàn)排臟現(xiàn)象，繼而極少數(shù)個體喪失活動能力，甚至死亡;在高劑量組，刺參的反應(yīng)相對敏感，具體表現(xiàn)為24 h后大部分刺參個體行動遲緩，48 h后管足開始喪失吸附能力，繼而出現(xiàn)排臟現(xiàn)象，隨后刺參體表開始起泡、潰爛，甚至死亡。

2.2 硒代蛋氨酸對刺參的急性毒性試驗

從表1可見:隨著硒代蛋氨酸濃度的升高，3個規(guī)格組刺參96 h的死亡率也隨之升高，最高濃度組死亡率均為100%;3種規(guī)格刺參的最低濃度組均有刺參死亡，其中20、50 g組刺參的死亡率均為6．7%，10 g組的死亡率為10%;而3種規(guī)格的空白對照組均未出現(xiàn)死亡。根據(jù)公式計算得出3種規(guī)格刺參的96 h LC50和安全濃度。從表2可見，3種規(guī)格刺參中50 g組的96 h LC50和安全濃度均最高，20 g組次之，10 g組均最低。

表1 硒代蛋氨酸對刺參的致死率Tab.1 Mortality of sea cucumber Apostichopus japonicus exposed to selenomethionine

表2 硒代蛋氨酸對刺參的半致死濃度、安全濃度Tab.2 96 h LC50，and safe concentration of selenomethionine in sea cucumber

2.3 亞硒酸鈉對刺參的急性毒性試驗

從表3可見:隨著亞硒酸鈉濃度的升高，3個規(guī)格組刺參96 h的死亡率也隨之升高，10 g組最高濃度時，刺參的死亡率為96．7%，20、50 g組最高濃度時死亡率為100%;50 g組最低濃度時無刺參死亡，而20、10 g組最低濃度時均有刺參死亡，死亡率均為10%;而3種規(guī)格的空白對照組均未出現(xiàn)死亡。從表4可見:3種規(guī)格刺參中50 g組的96 h LC50和安全濃度均最高，10 g組均最低。

表3 亞硒酸鈉對刺參的致死率Tab.3 Mortality of sea cucumber Apostichopus japonicus in the acute toxicity experiment of sodium selenite

表4 亞硒酸鈉對刺參的半致死濃度、安全濃度Tab.4 96 h LC50，and safe concentration of sodium selenite in sea cucumber

2.4 硒酸鈉對刺參的急性毒性試驗

從表5可見:隨著硒酸鈉濃度的升高，3個規(guī)格組刺參96 h的死亡率也隨之升高，10 g組最高濃度時刺參的死亡率為100%，20、50 g組的死亡率分別為96．7%、90%;50 g組最低濃度時未出現(xiàn)刺參死亡，而20、10 g組最低濃度時均有刺參死亡，死亡率均為10%;3種規(guī)格的空白對照組均未出現(xiàn)死亡。從表6可見:3種規(guī)格刺參中50 g組的96 h LC50和安全濃度均最高，10 g組均最低。

3 討論

3.1 3種藥物對刺參的毒性比較

本試驗設(shè)計條件下，硒代蛋氨酸對刺參的96 h LC50高于其余兩種硒化合物，這與郝麗娟等［14］對水產(chǎn)動物的報道相符。根據(jù)GBT-22487—2008水產(chǎn)動物接觸致毒急性毒性劑量分級:LC50＜1 mg/L為極毒，LC50=1～100 mg/L為劇毒，LC50=100～1000 mg/L為中等毒，LC50=1000～10 000 mg/L為低毒，LC50＞10 000 mg/L為實際無毒。本研究中，3種硒化合物對各種規(guī)格的刺參均為極毒。

不同種類的硒化合物對水產(chǎn)動物的毒性大小，因生物種類而異。高世榮等［9］對斑馬魚的研究表明，Se(Ⅳ)和 Se(Ⅵ)的 96 h LC50分別為16．67、39．33 mg/L;Na2SeO3和 Na2SeO4對黑斑蛙蝌蚪的 96 h LC50分別為 33．5、94．8 mg/L［15］，均表明硒酸鈉的毒性小于亞硒酸鈉。鄧岳松等［16］研究表明，亞硒酸鈉對尼羅羅非魚的急性毒性約是硒代蛋氨酸的2倍。本研究結(jié)果表明:3種硒化合物的毒性為硒代蛋氨酸＜硒酸鈉＜亞硒酸鈉，且亞硒酸鈉的毒性約是硒代蛋氨酸的2倍，與上述結(jié)果相類似。同時可以看出，刺參對亞硒酸鈉的敏感程度大于斑馬魚、尼羅羅非魚和黑斑蛙蝌蚪，對硒酸鈉的敏感程度大于斑馬魚和黑斑蛙蝌蚪，對硒代蛋氨酸的敏感程度大于尼羅羅非魚。刺參對硒的敏感程度較高，且硒代蛋氨酸的毒性約為其余兩種無機硒的1/3～1/2，因此，考慮到毒性因素，在富硒海參生產(chǎn)中，推薦使用硒代蛋氨酸作為硒源。

表5 硒酸鈉對刺參的致死率Tab.5 Mortality of sea cucumber Apostichopus japonicus in the acute toxicity experiment of sodium selenate

表6 硒酸鈉對刺參的半致死濃度、安全濃度Tab.6 96 h LC50，and safe concentration of sodium selenate in sea cucumber

3.2 藥物對刺參的安全濃度評價

硒能夠提高水產(chǎn)動物的代謝水平及抗病力，但是水環(huán)境中過量的硒也會對刺參產(chǎn)生毒害作用，影響刺參的生長、發(fā)育和刺參食品的安全。按照Marino等［17］推薦的最大容許濃度公式 MPC=96 h LC50×0．01，計算得到硒代蛋氨酸對10、20、50 g組刺參的 MPC 分別為 0．006 39、0．007 41、0．007 95 mg/L，亞硒酸鈉對3組刺參的MPC分別為 0．002 75、0．002 99、0．003 24 mg/L，硒酸鈉對3 組 刺 參的 MPC 分 別 為 0．003 05、0．003 46、0．003 68 mg/L，與中國現(xiàn)行海水養(yǎng)殖水質(zhì)標準NY5052—2001［18］中硒≤0．02 mg/L 的標準值相比，3種藥物的MPC均小于該標準值，說明與其他水產(chǎn)動物相比，刺參對硒的耐受性較低，這可能與海參的生理結(jié)構(gòu)簡單、生物地位較低有關(guān)。

由于在富硒海參生產(chǎn)過程中，需要將硒添加劑混入飼料中，而飼料中硒化合物在水中的溶解度往往較高［19］，因此，在硒添加飼料的研發(fā)過程中，應(yīng)采用添加黏合劑和充分糊化等方式，盡可能防止硒化合物流失。

［1］Gupta U C．Selenium in soils and crops，its deficiencies in livestock and humans，implications for management［J］．Comm Soil Sei Plant Anal，2000，31:1791-1807．

［2］王井亮，葉良宏，周明．硒源和硒水對克氏螯蝦肉品質(zhì)的影響［J］．湖南飼料，2010(3):24-26．

［3］劉洪展，鄭風(fēng)榮，孫修勤，等．亞硒酸鈉對刺參免疫反應(yīng)中體腔液酶活力的影響［J］．水產(chǎn)學(xué)報，2012，36(1):98-105．

［4］Safir N，Wendel A，Saile R，et al．The effect of selenium on immune functions of j774．1 cells［J］．Clin Chem Lab Med，2003，41(8):1005-1011．

［5］孫德文，詹勇，許梓榮．硒及其在魚類營養(yǎng)上的應(yīng)用［J］．飼料博覽，2003(6):37-39．

［6］孫海香，宋保強，夏枚生．納米硒在動物營養(yǎng)中的應(yīng)用前景［J］．中國飼料，2003(10):23-24．

［7］Kim Y Y，Mahan D C．Effects of dietary selenium source and level on pig hair color and various selenium indices［J］．J Anim Sci，2001，79:949-955．

［8］Baumann P C，Gillespie R B．Selenium bioaccumulation in gonads of largemouth bass and bluegill fish from three power plant cooling reservoirs［J］．Environ Toxicol Chem，1986，5(7):695-702．

［9］高世榮，修瑞琴，郭琪，等．硒對斑馬魚的毒性研究［J］．中國公共衛(wèi)生學(xué)報，1993，12(1):37-38．

［10］劉民．亞硒酸鹽對泥鰍毒性作用的研究［D］．濟南:山東師范大學(xué)，2007．

［11］韓家波，龐軍輝，莊人沁，等．硒Se(IV)對海灣扇貝的影響［J］．水產(chǎn)科學(xué)，1993，12(8):6-10．

［12］修瑞琴，高世菜，許永香．硒對大型水蚤和梨形四膜蟲的毒性研究［J］．環(huán)境科學(xué)，1988，9(3):33-35．

［13］孫振興，王慧恩，王晶，等．汞、鎘、硒對刺參(Apostichopus japonicus)幼參的單一毒性與聯(lián)合毒性［J］．海洋與湖沼，2009，40(2):228-234．

［14］郝麗娟，蔡菊，孫隨飛，等．有機硒在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用［J］．飼料工業(yè)，2011(9):33-34．

［15］祝文興．硒鹽對黑斑蛙蝌蚪(Rana nigromaculata)毒性效應(yīng)的研究［D］．濟南:山東師范大學(xué)，2006．

［16］鄧岳松，陳權(quán)軍．納米硒對尼羅羅非魚生長的影響［J］．內(nèi)陸水產(chǎn)，2003，28(6):28-30．

［17］Marino Balsa J C，Poza E，Vazqez E，et al．Comparative toxicity of dissolved metals to early larval stages of Palaemon serratus，Maja squinado and Homarus gammarus(Crustacea:Decapoda)［J］．Archive of Environmental Contamination and Toxicity，2000，39:345-351．

［18］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．NY5052—2001中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準:無公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)［S］．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001．

［19］張平，劉強，黃應(yīng)祥，等．不同飼料硒源體外溶解度的研究［J］．飼料工業(yè)，2007，8(6):33-34．