多棘海盤車化學(xué)成分的分離與鑒定

田麗冉，侯秀秀，佟長青，譚成玉，李偉

(1．大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116023;2．大連海洋大學(xué)海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧大連116023)

多棘海盤車Asterias amurensis Lutken隸屬于海盤車科 Asteriidae、海盤車屬Asterias，是一種海洋無脊椎動物。海星中含有多糖、脂類、甾醇、皂苷、生物堿等多種化學(xué)成分和活性物質(zhì)，具有廣泛的藥理作用和生物活性。海洋活性物質(zhì)因支鏈豐富多樣、骨架結(jié)構(gòu)新奇、生理活性獨(dú)特而備受關(guān)注［1］。國內(nèi)外學(xué)者已從海星中分離純化出了多種具有生物活性的化學(xué)成分，但仍然有許多具有潛在價值的化合物尚未分離得到。為了更加全面分析多棘海盤車所含有的化合物，本研究中從多棘海盤車70%乙醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇萃取部分中，利用多種色譜技術(shù)相結(jié)合的手段，首次從多棘海盤車中分離得到4種化合物，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，旨在為多棘海盤車的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用多棘海盤車采自遼寧省大連市黑石礁海域。

試驗藥品主要有硅膠 (200～300目)(Sigma公司)、Sephadex LH-20葡聚糖凝膠 (Sigma公司)、ODS反相硅膠 (200～300目)(購于北京吉瑞森科技有限責(zé)任公司)。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等均為國產(chǎn)分析純。

試驗儀器主要有RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠)、ZF-90型暗箱式紫外透射儀(上海顧村電光儀器廠)、XT5型顯微熔點測定儀(熔點未校正，北京科儀電光儀器廠)、BRUKERAPX-300型1H核磁共振儀 (瑞士 BRUKER公司)、BRUKER-APX-150型13C核磁共振儀 (瑞士BRUKER公司)。

1.2 方法

1．2．1 多棘海盤車化合物的分離 取20 kg多棘海盤車剪碎，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇回流提取2次，每次2 h，過濾，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮得到水溶液，置于冰箱 (-20℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對提取得到的水溶液進(jìn)行多次萃取，直至有機(jī)層基本無色，濃縮，分別得到石油醚部分 (65 g)、乙酸乙酯部分 (130 g)和正丁醇部分 (150 g)。

將正丁醇部分進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以乙酸乙酯與甲醇的混合液 (二者的比為100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)進(jìn)行梯度洗脫得到6個組分。其中組分2重結(jié)晶得到化合物1(68 mg);組分3進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷與甲醇的混合液 (二者的比為100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)進(jìn)行梯度洗脫得到的亞組分c反復(fù)運(yùn)用凝膠柱進(jìn)行分離，得到化合物2(18 mg);組分4進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以乙酸乙酯與甲醇的混合液(二者的比為100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)進(jìn)行梯度洗脫得到的亞組分b反復(fù)運(yùn)用凝膠柱分離，得到化合物3(40 mg)。將乙酸乙酯部分反復(fù)運(yùn)用硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷與甲醇的混合液 (二者的比為100∶0，100∶1，…，10∶1，…，1∶1)進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)合Sephadex LH-20分離，最終得到化合物4(18 mg)。

1．2．2 化合物結(jié)構(gòu)的鑒定1H NMR譜在BRUKER-APX-300型1H核磁共振儀上進(jìn)行，13C NMR譜在BRUKER-APX-150型13C核磁共振儀上進(jìn)行。樣品均溶于D2O，樣品濃度為20 mg/mL。

2 結(jié)果

對多棘海盤車70%乙醇提取物，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取，得到4種化合物，分別為化合物1、2、3、4。

化合物1 為白色粉末狀固體，mp 216～220℃，易溶于甲醇，微溶于氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，分子式為 C41H75NO9。1H NMR譜顯示，δH8．52處有酰胺N-H特征信號，δC106．0為糖苷異頭碳信號。神經(jīng)酰胺與鞘胺醇都具有N-?；窠?jīng)鞘胺醇的骨架結(jié)構(gòu)，骨架中兩個羥基的位置是固定的，同時已經(jīng)確定羥甲基與糖成苷相連接［2］。結(jié)合δH3．85～4．87分子中含有多個連氧碳上的質(zhì)子，推測此化合物為鞘脂糖苷類化合物。其1D NMR譜數(shù)據(jù)如下:1H NMR(500 MHz，MeOH)，δH8．52(d，J=8．6 Hz，1H，NH)，7．65(br s，1H，OH)，7．25(br s，1H，OH)，7．17(br s，1H，OH)，6．90(br s，1H，OH)，6．41(br s，1H，OH)，6．20(d，J=15．6 Hz，1H，H-10)，6．00(dd，J=15．4，6．0 Hz，1H，H-4)，5．90(dt，J=15．4，6．2 Hz，1H，H-5)，5．72(m，1H，H-11)，5．48(m，1H，H-8)，5．34(d，J=4 Hz，1H，H-1″)，4．80(m，1H，H-2)，4．75(m，1H，H-3)，4．71(dd，J=10．3，5．9 Hz，1H，H-1)，4．57(m，1H，H-2')，4．50(br d，J=10．3 Hz，1H，H-6″)，4．36(m，1H，H-6″)，4．23(m，1H，H-1)，4．21(m，2H，H-3″，H-4″)，4．03(m，1H，H-2″)，3．90(m，1H，H-5″)，2．21(m，2H，H-7)，2．16(m，3H，H-3'，H-6)，2．12(m，2H，H-12)，2．00(m，1H，H-3')，1．76(s，3H，H-19)，1．75(m，2H，H-4')，1．36(m，4H，H-5'，H-13)，1．29(br s，28H)，0．90(t，J=6．7 Hz，6H，H-18，H-16')。其13C NMR(125 MHz，MeOH)譜數(shù)據(jù)如下:δ 177．2(s，C-1')，134．8(d，C-10)，133．4(s，C-9)，132．3(d，C-4)，132．0(d，C-5)，130．9(d，C-8)，128．5(d，C-11)，104．7(d，C-1″)，78．0(d，C-5″)，77．9(d，C-3″)，75．0(d，C-2″)，73．1(d，C-2')，72．9(d，C-3)，71．6(d，C-4″)，70．0(t，C-1)，62．7(t，C-6″)，54．6(d，C-2)，35．9(t，C-3')，33．5(t，C-12)，33．1(t，C-6)，33．1(t)，33．0(t)，30．9(2xt)，30．9(2xt)，30．8(2xt)，28．2(t，C-7)，26．2(t，C-4')，23．8(2xt)，14．5(2xq，C-18，C-16')，12．8(q，C-19)。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，此化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的Phalluside 1基本一致，故確定化合物1為Phalluside 1，結(jié)構(gòu)為1-O-(β-D-葡萄糖基)-(4E，8E，10E)-2-(2'R-2-羥基十八烷基酰胺基)-4，8，10-三烯-1，3-二醇 ［1-O-(β -D-glucose)-(4E，8E，10E)-2-(2R'-2-hydroxy octadecyl)-4，8，10， -amide-1，3-diol］［3］。

化合物2 為白色晶體，mp 279～282℃，易溶于氯仿，微溶于甲醇，不溶于水，分子式為C47H75NO2。Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性，提示可能為甾體類化合物。其1D NMR譜數(shù)據(jù)如下:1H NMR(500 MHz，CDCl3)，δH5．36(m，2H，H-6，H-6')，5．10(d，J=8．2，1 H，NH)，3．73(m，1 H，H-3)，3．52(m，1 H，H-3')，1．01(s，3 H，H-19)，0．99(s，3 H，H-19')，0．91(d，J=6．5，3H，H-21)，0．87(d，J=6．6，3H，H-26)，0．86(d，J=6．6，3H，H-27)，0．70(s，3 H，H-18')，0．67(s，3H，H-18)。其13C NMR(125 MHz，C5D5N)譜數(shù)據(jù)如表1所示。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，化合物2的結(jié)構(gòu)為N-(膽甾-5-烯-3β-烴基)-3β-醋酸酯-5-乙基-17β-咪唑羧酰胺 ［N-(Cholest-5-en-3β -yl)-3β -hydroxyandrost-5-ene-17β -carboxamide］［4］。

化合物3 為白色無定形粉末，mp 145～148℃，易溶于吡啶，微溶于甲醇、氯仿，不溶于水，分子式為C27H44O。Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性，提示可能為甾體類化合物。其1H-NMR(500 MHz，C5D5N)波譜中:5個甲基質(zhì)子信號為1．86(3H，s，18-Me)，2．06(3H，d，19-Me)，2．07(3H，d，J=6．5 Hz，26-Me)，2．15(3H，d，J=6．5 Hz，27-Me)，2．24(3H，d，J=6．5 Hz，21-Me)，2個烯氫質(zhì)子信號為6．14(1H，s，H-6)和6．61(1H，s，H-22)，1個連氧碳的氫信號為5．04(1H，s，H-3)。13C NMR低場可觀察到4個烯碳信號，其中δC140．1、121．7提示為△5(6)雙鍵。其13C NMR(125 MHz，C5D5N)波譜數(shù)據(jù)如表2所示，從NMR譜圖數(shù)據(jù)中可看出，比膽固醇多了一個碳碳雙鍵。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，化合物3的結(jié)構(gòu)為膽甾-5，20(22)-二烯 -3β-醇［Cholest-5，20(22)-diene-3β -ol］［5］。

表1 化合物2的13C NMR波譜數(shù)據(jù)Tab.1 13C NMR data of compound 2

表2 膽固醇和化合物3的13C NMR波譜數(shù)據(jù)Tab.2 13C NMR data of cholesterol and compound 3

化合物4 為白色粉末，mp 64～65℃，易溶于氯仿，微溶于甲醇，不溶于水。分子式為C30H60O4。1H NMR顯示，高場沒有次甲基信號，其中在δH0．87(t，6．4)的末端甲基信號及其相鄰的δH1．27處含有46個質(zhì)子積分面積的疊加峰，暗示該化合物為鏈狀脂肪酸結(jié)構(gòu)。結(jié)合其在δH2．34(t，7．5)和 δH1．61(m)分別出現(xiàn)的兩個質(zhì)子信號，說明該化合物為一直鏈脂肪酸。進(jìn)一步根據(jù)13C NMR的1個羰基碳δC174．53、3個連羥基碳 δC63．49 ～70．40、1 個甲基碳 δC14．25 和分布在δC34．29～22．82之間的25個亞甲基碳信號，推測其結(jié)構(gòu)為三十烷酸甘油酯。其1D NMR譜數(shù)據(jù)如下:1H NMR(500 MHz，CDCl3)，δ 0．87(t，J=6．4 Hz，3H，Me-27')，1．05-1．27(br s，46H，H-4'to H-26')，1．61(m，2H，H-3')，2．34(t，J=7．5 Hz，2H，H-2')，3．60(dd，J=11．6，5．8 Hz，1H，H-3a)，3．68(dd，J=11．6，3．8 Hz，1H，H-3b)，3．92(m，1H，H-2)，4．14(m，2H，H-1)。其13C NMR(125 MHz，CDCl3)譜數(shù)據(jù)如下:δ 65．26(C-1)，70．40(d，C-2)，63．49(t，C-3)，174．53(s，C-1')，34．29(t，C-2')，25．04(t，C-3')，29．27-29．83(t，C-4'to C-24')，32．05(t，C-26')，22．82(t，C-25')，14．25(q，C-27')。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，化合物4的結(jié)構(gòu)為 (2S)-1-O-7溴烷醇甘油［(2S)-1-O-7 heptatriacontanoyl glycerol］［6］。

3 討論

提取方法不同對提取的化學(xué)成分種類有著明顯的影響。李巖等［7］利用酶解、50℃水浸提的方法從海星中分離純化出6種化合物:膽甾-5-烯-3-醇;丙二酸;乙酸鈉;正壬烷;麥角甾-7，9，22-三烯-3-醇;一水合立方癸烷。其中前5種為首次從海星綱中分離得到，一水合立方癸烷為新化合物。程平等［8］利用95%乙醇浸提、正丁醇萃取、大孔樹脂層析和ODS、Sephadex LH-20層析分離，從多棘海盤車中分離出6種化合物:Amurensoside D;色氨酸;3β-O-硫酸酯化 -6α，23β-二羥基-膽甾-9(11)-23-羰基-硫酸鹽;3β-O-硫酸酯化 -6α-羥基 -膽甾 -9(11);20(22)-二雙鍵-23-羰基-硫酸鹽;3β-O-硫酸酯化-6α-羥基-麥角甾-9(11)-雙鍵-23-羰基-硫酸鹽。其中色氨酸為首次從多棘海盤車中分離得到。

本研究中從多棘海盤車70%醇提物中得到4種化合物:Phalluside 1;N-(膽甾-5-烯-3β-烴基)-3β-醋酸酯-5-乙基-17β-咪唑羧酰胺;膽甾-5，20(22)-二烯-3β-醇;(2S)-1-O-heptatriacontanoyl glycerol。這4種化合物均為首次從海盤車屬中分離得到，其余組分中的化學(xué)成分有待進(jìn)一步分離純化，其生物活性有待進(jìn)一步研究。

近年來，海洋天然產(chǎn)物的開發(fā)應(yīng)用已經(jīng)成為研究的熱點，海洋無脊椎動物已經(jīng)被證實是眾多藥源化合物的主要來源。海星資源豐富，在中國渤海、黃海海域均有廣泛分布，其含有的活性成分具有抗癌、抗病毒、降血壓和抗氧化等多種生理功能，在人類腫瘤治療及心血管疾病等方面發(fā)揮了不可替代的作用，應(yīng)用前景十分廣闊。目前，尚未對多棘海盤車進(jìn)行有效利用，原因是對其所具有的成分沒有完全認(rèn)識。本研究中發(fā)現(xiàn)的4個化合物分別屬于鞘脂糖苷類化合物 (化合物1)、甾體類化合物 (化合物2、3)和脂肪酸類化合物 (化合物4)。這些發(fā)現(xiàn)將為多棘海盤車的開發(fā)利用提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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