MyHC基因在C2C12成肌細(xì)胞分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)

林亞秋, 張明, 鄔楊楠, 李瑞文, 鄭玉才

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 成都 610041; 2. 成都市婦女兒童中心醫(yī)院生殖與不孕研究所, 成都 610051)

MyHC基因在C2C12成肌細(xì)胞分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)

林亞秋1, 張明1, 鄔楊楠1, 李瑞文2, 鄭玉才1

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 成都 610041; 2. 成都市婦女兒童中心醫(yī)院生殖與不孕研究所, 成都 610051)

以體外培養(yǎng)的C2C12成肌細(xì)胞為研究對(duì)象, 然后利用熒光定量PCR檢測(cè)肌球蛋白重鏈(myosin heavy chains, MyHC)的3種亞型MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在成肌誘導(dǎo)分化中(0-8 d)中的時(shí)序表達(dá)規(guī)律. 結(jié)果表明,MyHC1基因在誘導(dǎo)分化的0-4 d表達(dá)呈上升趨勢(shì), 4-8 d又呈下降趨勢(shì), 在第4 d和第6 d的表達(dá)水平顯著高于其他天數(shù)(p<0.05).MyHC2x基因在誘導(dǎo)分化的0-6 d 表達(dá)呈上升趨勢(shì), 但在第8 d又開(kāi)始下降.MyHC2b在誘導(dǎo)分化的0-8 d 中表達(dá)一直呈上升趨勢(shì), 第6 d和第8 d表達(dá)水平顯著高于其他天數(shù)(p<0.05).

肌球蛋白重鏈基因; C2C12成肌細(xì)胞; 時(shí)序表達(dá)

骨骼肌是機(jī)體的重要組成部分, 肌纖維是組成骨骼肌的基本單位, 由成肌細(xì)胞分化而來(lái), 其特性直接決定肉的品質(zhì), 是動(dòng)物養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)性狀. 肌纖維特性主要包括肌纖維的類(lèi)型、直徑、密度及肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律等. 其中肌纖維類(lèi)型的多樣性以及復(fù)雜的時(shí)空分布模式是肌肉功能差異的分子基礎(chǔ), 不同類(lèi)型的肌纖維在收縮功能、線粒體成分和代謝特性等方面有很大差異[1], 進(jìn)而導(dǎo)致肌肉之間品質(zhì)的差別[2]. 研究表明, 肌肉中紅肌纖維所占的比例越大, 白肌纖維所占比例越小, 肌肉的品質(zhì)就越好[3-5]. 1994年, Scohiaffin和Reggiani確定了哺乳動(dòng)物中與肌纖維類(lèi)型相對(duì)應(yīng)的肌球蛋白重鏈MyHC的類(lèi)型, 即肌球蛋白重鏈的亞型MyHCI(MyHCslow)、MyHCIIa、MyHCIIx和MyHCIIb分別對(duì)應(yīng)I型、IIa型、IIx型和IIb型肌纖維[6]. 目前肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MyHC)同功型被認(rèn)為是決定肌纖維快、慢類(lèi)型的主要決定因素[7], 是區(qū)分肌纖維類(lèi)型和研究肌肉適應(yīng)性的分子標(biāo)志. 因此闡明MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在C2C12成肌細(xì)胞分化過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)規(guī)律具有重要的意義. 本實(shí)驗(yàn)以C2C12成肌細(xì)胞為研究對(duì)象, 利用熒光定量PCR檢測(cè)MyHC1、MyHC2x和MyHC2b基因在誘導(dǎo)分化的0-8 d成肌細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律, 研究結(jié)果為闡明動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)及肉品質(zhì)形成的分子機(jī)制提供重要的基本資料.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用C2C12成肌細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存.

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12、馬血清購(gòu)自Gibco公司; 胰蛋白酶(購(gòu)自sigma公司), Trizol試劑、SYBR? Premix Ex Taq TM (2×)和pMD-19T載體購(gòu)自大連TaKaRa公司; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq DNA聚合酶購(gòu)自Fermentas公司;其他均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 C2C12成肌細(xì)胞的培養(yǎng)

從液氮罐中快速取出裝有凍存細(xì)胞的凍存管, 快速放于37 ℃水浴中, 輕搖1 min使其溶解, 然后加入10倍

凍存液體積的培養(yǎng)基, 1050 rpm離心4 min, 棄上清, 將細(xì)胞接種于含10 %FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中, 在37 ℃, 5 %CO2的培養(yǎng)箱中靜臵培養(yǎng). 待細(xì)胞將長(zhǎng)至90 %以上的時(shí)候進(jìn)行傳代, 在37 ℃、5 %的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 第2天換為含2 %馬血清高糖DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化, 繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)研究.

1.2.2 細(xì)胞總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

分別收集誘導(dǎo)0、2、4、6、8 d的C2C12成肌細(xì)胞, 吸出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液. 按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法提取細(xì)胞總RNA, 紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的質(zhì)量, 然后-80 ℃保存?zhèn)溆?

取1 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)以O(shè)ligo (dT) 為引物合成cDNA第一鏈.

1.2.3 熒光定量PCR

根據(jù)小鼠MyHC1、2b、2x的mRNA基因序列(登錄號(hào)分別為BC158018、AJ278733、DQ021871), 應(yīng)用Primer Premier5.0軟件, 設(shè)計(jì)MyHC1、MyHC2x和MyHC2b基因特異引物(表1), 送交上海生物工程股份有限公司合成.

利用熒光定量PCR檢測(cè)MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在不同分化時(shí)期的C2C12細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律. 反應(yīng)體系為20 μL: SYBR? Premix Ex Taq TM (2×)PCR 10 μL , 10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL, cDNA 1μL, 滅菌水8 μL. 反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性1 min, 95 °C 30 s, 61 ℃/58 ℃ 30 s, 45個(gè)循環(huán), 72 °C 延伸30 s. 熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析[8].

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行分析, 所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤( mean ± SE) 表示, 采用ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析, 當(dāng)P<0.05 時(shí), 認(rèn)為差異顯著, 當(dāng)P<0.01 時(shí), 認(rèn)為差異極顯著.

表1 擴(kuò)增MyHC1, MyHC2x, MyHC2b基因的引物參數(shù)Table 1 Primers for quantitative real-time PCR(qPCR)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞總RNA的鑒定

提取的細(xì)胞總RNA樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定, 其OD260/OD280值均在1.8-2.0之間, 表明細(xì)胞RNA無(wú)蛋白及酚污染. 且總RNA經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA有28 S, 18 S, 5 S 3條主要區(qū)帶, 說(shuō)明樣品中的RNA基本沒(méi)有降解, 可用于后續(xù)分析.

2.2 MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化

熒光定量PCR結(jié)果顯示: MyHC1基因在0-4 d表達(dá)呈上升趨勢(shì), 在4-8 d又呈下降趨勢(shì), 但在第4 d和第6 d的表達(dá)水平顯著高于其他天數(shù)(p<0.05)(圖1).

MyHC2x基因在誘導(dǎo)分化的0-6 d表達(dá)是呈上升趨勢(shì), 但在第8 d又開(kāi)始下降(圖2).MyHC2b在誘導(dǎo)分化的0-8 d中表達(dá)一直呈上升趨勢(shì), 第6 d和第8 d表達(dá)水平顯著高于其他天數(shù)(p<0.05)(圖3).

圖1 MyHC1在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化Fig.1 Expression of MyHC1 during C2C12 myoblast differentiation

圖2 MyHC2x在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化Fig.2 Expression of MyHC2x during C2C12 myoblast differentiation

圖3 MyHC2b在C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化Fig.3 Expression of MyHC2b during C2C12 myoblast differentiation

3 討論

肌纖維類(lèi)型及其組成是肌肉生長(zhǎng)和肉品質(zhì)形成的生物學(xué)基礎(chǔ), 可直接影響肌肉色澤、嫩度和肌內(nèi)脂肪含量, 因此備受動(dòng)物育種工作者的廣泛關(guān)注. 骨骼肌根據(jù)肌纖維的形態(tài)、功能和生理生化特性分為兩類(lèi), 即Ⅰ型(紅肌, 慢肌)和Ⅱ型(白肌, 快肌)肌纖維. Ⅰ型含有更多的線粒體和細(xì)胞色素, Ⅱ型細(xì)胞色素和肌紅蛋白含量較少. 后來(lái)學(xué)者指出MyHC的亞型可決定肌纖維的類(lèi)型, 是分子水平上的主要檢測(cè)指標(biāo)[9]. 本實(shí)驗(yàn)以2 %的馬血清誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化, 分別收集誘導(dǎo)0-8 d的細(xì)胞, 利用熒光定量PCR檢測(cè)MyHC1、MyHC2x和MyHC2b的表達(dá)規(guī)律, 結(jié)果指出這些基因在分化過(guò)程中具有一定的表達(dá)規(guī)律, MyHC1基因在分化的前期表達(dá)呈上升趨勢(shì), 在分化后期表達(dá)水平開(kāi)始下降, 在第4 d表達(dá)最高(p<0.05); MyHC2x基因在誘導(dǎo)分化的0-6 d表達(dá)是呈上升趨勢(shì), 但在第8 d又開(kāi)始下降,在第6 d表達(dá)水平最高. MyHC2b在誘導(dǎo)分化的0-8 d中表達(dá)一直呈上升趨勢(shì), 在分化后期表達(dá)水平高. 這一實(shí)驗(yàn)結(jié)

果與肌肉本身的生長(zhǎng)發(fā)育特性、生理變化規(guī)律是基本相符的[10,11]. 這與楊曉靜等[12]的研究結(jié)果相似, 3日齡豬MyHC1和MyHC2x的表達(dá)水平顯著高于20日齡及以后豬的表達(dá)水平,MyHC2b在20日齡豬的表達(dá)水平顯著高于3日齡豬的表達(dá)水平. 總之肌纖維類(lèi)型的組成在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)時(shí)期受各種外界因素的影響會(huì)發(fā)生肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[13-15], 對(duì)動(dòng)物肉品質(zhì)的形成具有很大的影響, 因此研究肌纖維類(lèi)型的轉(zhuǎn)化及其調(diào)控機(jī)制將是一個(gè)十分有價(jià)值的課題.

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Temporal expression of MyHC gene during C2C12 myoblast differentiation

LIN Ya-qiu1, ZHANG Ming1, WU Yang-nan1, LI Rui-wen2, ZHENG Yu-cai1
(1.School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2 Reproductive and Endocrine Laboratory, Chengdu Woman-Child Central Hospital, Chengdu610051, P.R.C.)

In this experiment, C2C12 myoblasts were used as the research object, which were cultured in vitro with 2 % horse serum to induce differentiation 0-8 d, and then real-time PCR was carried out to detect the expression of three subtypes of MyHC (myosin heavy chains) includingMyHC1,MyHC2xandMyHC2b. The results showed thatMyHC1gene expression increases during day 0 to 4 after differentiation, while decreases during day 4 to 8. Moreover, the expression level on the 4th and 6th days is significantly higher than that of other days (p<0.05).MyHC2xgene expression is on the rise when it was induced differentiation from 0 to 6 days, but began to decline on the 8th day. The expression ofMyHC2bwas increasing when it was induced from 0 to 8 d and the expression of MyHC2b on the 6th and 8th days were significantly higher than the others(p<0.05)

MyHCgene; C2C12 Myoblasts; temporal expression

Q593+.3

: A

: 1003-4271(2014)03-0350-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.05

2014-04-03

林亞秋(1976-), 女, 內(nèi)蒙古阿榮旗人, 副教授, 博士.

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31201990)