基于mtDNA COⅠ基因的西藏牦牛遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化研究

郭嬌, 信金偉, 姬秋梅, 張成福, 柴志欣, 鐘金城

(1. 西南民族大學(xué)動(dòng)物遺傳育種學(xué)國家民委/教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610041; 2. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 拉薩 850000)

基于mtDNA COⅠ基因的西藏牦牛遺傳多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化研究

郭嬌1, 信金偉2, 姬秋梅2, 張成福2, 柴志欣1, 鐘金城1

(1. 西南民族大學(xué)動(dòng)物遺傳育種學(xué)國家民委/教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 610041; 2. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 拉薩 850000)

為從分子水平上探討西藏牦牛的序列多態(tài)性、群體遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系, 本研究對(duì)17個(gè)西藏牦牛類群170個(gè)個(gè)體的mtDNA COⅠ全序列進(jìn)行測(cè)序, 用MEGA5.0、DNASP5.0等軟件分析核苷酸組成、單倍型多樣性和核苷酸多樣性. 基于Kimura-2-Parameter雙參數(shù)模型, 分別采用鄰近法(NJ)和最大似然法(UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 分析不同牦牛類群的親緣關(guān)系和分類. 結(jié)果表明: ①西藏17個(gè)牦牛類群的mtDNA COⅠ全序列長度均為1 545 bp, 個(gè)體間無長度差異, 無內(nèi)含子, 起始密碼子為AUG(ATG), 終止密碼子為UAA(TAA), 共編碼514個(gè)氨基酸. T、C、A和G 4種堿基的平均含量分別為29.5%(29.3%～29.8%)、25.5%(25.2%～25.6%)、28.7%(28.6%～28.9%)和16.3%(16.2%～16.5%); A+T的平均含量為58.2%, 存在一定的堿基偏倚性. ②在17個(gè)西藏牦牛類群的170頭牦牛中, 共發(fā)現(xiàn)mtDNA COⅠ有25種單倍型, 單倍型多樣性值在0～0.978之間, 平均單倍型多樣性和核苷酸多樣性值分別為0.566、0.00326, 表明西藏牦牛具有較豐富的遺傳多樣性. ③西藏牦牛mtDNA COⅠ中亮氨酸平均含量最多(11.496%), 半胱氨酸平均含量最少(0.1946%).堿性氨基酸、酸性氨基酸的含量分別為6.6171%、4.8627%; 親水性氨基酸、疏水性氨基酸分別為57.39%、42.61%. ④基于mtDNA COⅠ, 西藏17個(gè)牦牛類群可分為2大類, 即類烏齊(LWQ)牦牛單獨(dú)成一類, 其它牦牛類群聚為一類.

西藏牦牛; mtDNA COⅠ; 遺傳多樣性

牦牛是食草性反芻家畜, 主要分布在以青藏高原為中心的高山和亞高山地區(qū), 對(duì)高寒草地的極端氣候條件具有較強(qiáng)的適應(yīng)性, 并作為“全能”家畜為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┍匾纳a(chǎn)和生活資料. 目前, 中國牦牛數(shù)量約占全世界牦?？倲?shù)的95%左右, 主要分布于青海、西藏、四川、甘肅、新疆、云南、內(nèi)蒙古等省. 20世紀(jì)90年代以來,越來越多具有代表性的DNA序列、功能基因和各種分子標(biāo)記手段被用于牦牛遺傳資源的研究, 涂正超[1]、鐘金城[2]、肖玉萍[3]和廖信軍[4]等分別采用RFLP、微衛(wèi)星標(biāo)記、AFLP以及微衛(wèi)星熒光標(biāo)記等技術(shù)對(duì)西藏牦牛的mtDNA、染色體和mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行分析及分類研究. 目前, 限于地理、氣候等客觀因素的影響, 人們對(duì)西藏牦牛資源的研究相對(duì)較少, 缺乏系統(tǒng)完善的考證資料, 因此還有待于從歷史演變、地理分布、群體遷移、其它分子標(biāo)記及全基因組分析等方面進(jìn)行更加深入的研究.

mtDNA由于具有進(jìn)化速度快、母系遺傳、結(jié)構(gòu)簡單、易于分析等特點(diǎn), 作為分子遺傳標(biāo)記在分子系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用甚廣, 是研究動(dòng)物地理分布和多態(tài)性的靈敏材料. COⅠ基因是全球性物種鑒別系統(tǒng)的通用序列. 與其它的基因片段相比, COⅠ基因有許多優(yōu)點(diǎn), 序列長度適中且既相對(duì)保守又具有足夠變異. COⅠ基因在脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的系統(tǒng)分類、種類鑒別、群體遺傳多樣性和分子進(jìn)化學(xué)研究中均得到廣泛應(yīng)用[5-8]. Gunilla等[9]利用線粒體COⅠ基因部分序列對(duì)北歐四節(jié)蜉種類界限進(jìn)行研究, 促進(jìn)了四節(jié)蜉分類群更深層次的研究. 本研究通過對(duì)西藏牦牛mtDNA COⅠ全序列測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化分析, 以期為西藏牦牛的遺傳多樣性和分類, 以及今后的保護(hù)和利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

樣品采集于西藏自治區(qū)各區(qū)縣, 從17個(gè)牦牛類群中, 選取健康成年牦牛各10頭, 共170頭(表1). 采集耳組織, 75%乙醇保存帶回實(shí)驗(yàn)室, 于–80℃保存?zhèn)溆?

表1 試驗(yàn)牦牛類群、數(shù)量及采樣地點(diǎn)Table 1 Test yak groups, number and sampling location

1.2 基因組DNA提取及檢測(cè)

牦牛耳樣基因組DNA的提取采用傳統(tǒng)酚-氯仿抽提法, 用紫外分光光度計(jì)(eppordf)和1%(10g/L)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度, –70℃保存?zhèn)溆?

1.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)牦牛線粒體全基因序列(GenBank:AY684273.2)中mtDNACOⅠ基因的核苷酸序列, 用Primer5.0設(shè)計(jì)引物, F:5′- GTCTAATGCTTTGCTCAGC-3′, R: 5′-GAGGTTATGATGTTGGCTTG-3′, 引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成.

PCR擴(kuò)增體系為25ul; 其中上、下游引物各1uL(10 pmol·μL-1), 模板DNA 1uL(200～600 ng·μL-1), 2×Long Taq DNA預(yù)混酶12.5 μL(0.625 u), ddH2O 9.50 μL. PCR擴(kuò)增程序: 94℃預(yù)變性5min; 30個(gè)循環(huán)(94℃ 45s、55.7℃ 30s、72℃ 1min); 72℃ 延伸10 min, 4℃保存. 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 膠回收試劑盒(OMEGA)純化后進(jìn)行測(cè)序.

1.4 分析方法及軟件

用DNAMAN、SeqMan(DNASTAR Inc)等軟件對(duì)mtDNACOⅠ序列進(jìn)行校對(duì)拼接, 用ClustalX1.83軟件進(jìn)行比對(duì)分析, MEGA5.0軟件統(tǒng)計(jì)堿基組成, 計(jì)算類群間遺傳距離并基于Kimura-2-Parameter雙參數(shù)模型, 分別采用鄰近法(NJ)和非加權(quán)平均值法(UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2), 使用DNASP5.0軟件分析其遺傳多樣性.

2 結(jié)果與分析

2.1 西藏牦牛mtDNA COⅠ序列的核苷酸組成

經(jīng)測(cè)序得到170頭西藏牦牛 mtDNACOⅠ的全序列, 長度均為1 545 bp, 無內(nèi)含子, 起始密碼子為AUG(ATG), 終止密碼子為TAA, 共編碼514個(gè)氨基酸. T、C、A和G 4種核苷酸的平均比例分別為29.5%(29.3%～

29.8%)、25.5%(25.2%～25.6%)、28.7%(28.6%～28.9%)和16.3%(16.2%～16.5%); A+T的平均含量為58.2%, 顯著高于G+C平均含量為41.8%. 表明17個(gè)類群的170頭牦牛的mtDNACOⅠ基因均富含堿基A和T.

2.2 西藏牦牛mtDNA COⅠ的遺傳多樣性

根據(jù)西藏牦牛mtDNACOⅠ的核苷酸序列, 經(jīng)分析共定義出25種單倍型, 平均單倍型數(shù)(H)、平均單倍型多樣性(Hd)、平均核苷酸多樣性(Pi)分別是3.647、0.566、0.00326(表2、3).

本研究所測(cè)序列與牦牛線粒體全基因序列(AY684273.2)中的mtDNA COⅠ的核苷酸序列比對(duì)分析, 發(fā)現(xiàn)不變位點(diǎn)1436個(gè), 可變位點(diǎn)109個(gè), 其中單態(tài)突變位點(diǎn)21個(gè)(位于4、6、7、8、10、27、37、38、40、41、42、43、44、46、472、475、672、787、1014、1101和1538堿基處)、簡約信息位點(diǎn)88(位于18、19、20、21、45、69、72、138、204、213、219、252、264、273、276、282、294、297、327、333、363、423、441、471、534、543、546、549、570、583、588、594、604、618、627、628、648、666、684、688、693、717、741、742、750、765、771、774、813、822、825、847、867、879、882、921、924、951、960、970、972、1053、1062、1072、1077、1086、1107、1113、1128、1191、1206、1209、1218、1251、1266、1269、1329、1341、1357、1368、1380、1383、1395、1428、1446、1449、1459 和1533堿基處), 包含轉(zhuǎn)換、顛倒2種核苷酸變異類型, 無插入或缺失. 其中轉(zhuǎn)換91次(占81.25%), A?G間的轉(zhuǎn)換28次(占30.77%), C?T間的轉(zhuǎn)換 63次(占69.23%), 顛換21次(占18.75%), A?C間顛換4次(占19.05%), A?T間顛換 11次(占52.38%); G?C間顛換3次(占14.28%), T?G間顛換3次(占14.28%), 主要位于蛋白編碼區(qū)(1～1545), 共7個(gè)保守區(qū)分別為73～137bp, 139～203bp, 364～422bp, 476～533bp, 973～1013bp, 1129～1190bp和270～1328bp, 序列保守度C為 0.929.

西藏17個(gè)牦牛類群的單倍型多樣性變化范圍在0～0.978之間(表2), 帕里牦牛的單倍型多樣性最高為0.978,仲巴牦牛和桑桑牦牛的單倍型多樣性最低為0; 核苷酸多樣性變化范圍在0～0.02382之間, 其中類烏齊牦牛最高為0.02382, 其次為帕里牦牛0.00401, 仲巴牦牛和桑桑牦牛最低為0. 單倍型多樣性和核苷酸多樣性值變化范圍基本一致, 具有較強(qiáng)的相關(guān)性.

表2 西藏牦牛的單倍型多樣性和核苷酸多樣性Table 2 Haplotypes diversity and nucleotide diversity of domestic yaks in Tibetan region

表3 西藏牦牛mtDNA COⅠ的單倍型分布Table 3 mtDNA COⅠ gene haplotypes of 17 breeds of Tibetan yaks

2.3 西藏牦牛COⅠ的氨基酸組成

根據(jù)COⅠ基因序列推算COⅠ的氨基酸序列組成(表4). 結(jié)果表明, 在17個(gè)類群的牦牛中, COⅠ均含有20種氨基酸, 共由514個(gè)氨基酸組成, 其中天冬氨酸(Asp)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、異亮氨酸(Ile)、賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、絲氨酸(Ser)、纈氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr)等13種氨基酸在類群間存在一定差異. 亮氨酸平均含量最多(11.476%), 半胱氨酸的平均含量最少(0.1946%). 堿性氨基酸、酸性氨基酸的含量分別為6.6171%、4.8627%; 親水性氨基酸、疏水性氨基酸分別為57.39%、42.61%.

表4 西藏牦牛COⅠ的氨基酸組成Table 4 Average amino-acid composition of COⅠin Tibet Yak

2.4 西藏牦牛類群間的遺傳距離及其分類

用MEGA5.0軟件對(duì)西藏17個(gè)牦牛類群mtDNACOⅠ核苷酸序列進(jìn)行分析, 得出類群間的遺傳距離變化范

圍在0～0.0176之間, 申扎牦牛與康布牦牛、丁青牦牛與日多牦牛間的遺傳距離均最大(0.0176), 仲巴牦牛與桑桑牦牛間的遺傳距離為0, 表明西藏牦牛類群間的遺傳距離差異均較小, mtDNACOⅠ比較保守, 類群間差異不大(表5, 圖1).

表5西藏牦牛類群間的kimura雙參數(shù)遺傳距離Table 5 Genetic distance between Tibetan yaks breeds inferred from kimura2-parameter

圖1 基于kimura雙參數(shù)遺傳距離的西藏牦牛類群間的NJ聚類關(guān)系Figure 1 NJ tree based on Kimura 2-parameter distance between groups of Tibetan yak

圖2 基于 Kimura 雙參數(shù)距離的西藏牦牛類群間的 UPGMA 聚類關(guān)系Figure2 UPGMA tree based on Kimura 2-parameter distance between groups of Tibetan yak

3 討論

3.1 西藏牦牛mtDNA COⅠ的遺傳多樣性

關(guān)于西藏牦牛mtDNA的研究中, 趙上娟等對(duì)111個(gè)西藏牦牛個(gè)體的COⅢ全序列進(jìn)行測(cè)序得到其長度均為781bp, 無插入或缺失; 姬秋梅等對(duì)西藏牦牛mtDNAcytb的研究, 其全序列長度均為1140bp, 不存在長度多態(tài)性,張成福等根據(jù)114個(gè)西藏牦牛個(gè)體測(cè)得的D-loop區(qū)全序列長度在890到896bp之間, 包含4種堿基變異類型, 存在長度多態(tài)性. 海汀等研究150個(gè)西藏牦牛個(gè)體的ND5基因, 其全序列長度為1821-1823bp, 同樣存在可能因插入或缺失引起的序列多態(tài)性. 以上研究結(jié)果顯示, 線粒體基因組序列發(fā)生插入或缺失的可能性較低.

本研究中測(cè)得的170個(gè)西藏牦牛mtDNACOⅠ基因長度均為1545bp, 序列中的A+T的平均含量為58.2%, G+C平均含量為41.8%, 說明西藏牦牛mtDNACOⅠ存在著一定的堿基偏好性. 與趙上娟等對(duì)COⅢ基因(A+T含量為55.4%)、姬秋梅等[10]對(duì)cytb基因(A+T含量為58%)的A、T堿基偏好性基本一致.

豐富的遺傳多樣性對(duì)牦牛產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展起著至關(guān)重要的作用. 單倍型多樣性(H)和核苷酸多樣性(Pi)是從群體DNA水平上衡量遺傳多樣性的重要指標(biāo), H和 Pi 的值越大, 表明類群的遺傳多樣性越豐富. 本研究中170條序列中共發(fā)現(xiàn)109個(gè)變異位點(diǎn), 有25種單倍型, 平均核苷酸多樣性(Pi)為0.00326, 平均單倍型多樣性(Hd)為0.566. 低于姬秋梅等[10]對(duì)西藏牦牛cytb基因的研究結(jié)果(Pi=0.003814, Hd=0.884), 但高于趙上娟等[11]對(duì)COⅢ基因(Pi=0.0018, Hd=0.3238)的研究結(jié)果, 說明西藏牦牛mtDNACOⅠ基因序列的核苷酸替代率高, 具有豐富的遺傳多樣性和單倍型多樣性.

對(duì)西藏牦牛17個(gè)類群的Tajima's D值中的檢測(cè)結(jié)果表明, 工布江達(dá)牦牛表現(xiàn)出顯著(P<0.01), 其余的均為不

顯著. 表明工布江達(dá)牦牛可能在某個(gè)歷史時(shí)期由于自然環(huán)境或者人工選擇而發(fā)生過群體擴(kuò)張現(xiàn)象.

3.2 西藏牦牛群體的遺傳分化

遺傳分化指群體間遺傳結(jié)構(gòu)存在差異或遺傳距離遠(yuǎn)近不同, 其主要影響因素有: 自然選擇、人工選育、地理隔離和遺傳漂變等. 生態(tài)環(huán)境的變化、群體遷移等使生物群體面臨著優(yōu)勝劣汰的自然選擇, 生存壓力使群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變, 產(chǎn)生不同變異類型.

依據(jù)雙參數(shù)遺傳距離, 對(duì)西藏17個(gè)牦牛類群進(jìn)行聚類分析, 根據(jù)NJ和UPGMA 聚類關(guān)系, 可將西藏地區(qū)的17個(gè)牦牛類群劃分為兩大類, 即類烏齊牦牛為一類, 其余牦牛類群為一類(圖1, 圖2). 研究發(fā)現(xiàn)西藏牦牛類群的劃分和地理位臵并不呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性, 不能單一的通過區(qū)域分布來劃分, 可能與牦牛的“單一起源有關(guān)”[12]. 西藏傳統(tǒng)的三大優(yōu)勢(shì)牦牛類群為: 嘉黎牦牛、帕里牦牛和斯布牦牛. 本研究的分類結(jié)果和傳統(tǒng)的這種劃分有一定差異, 不完全一致. 在其他基于西藏牦?；虻难芯拷Y(jié)果中, 姬秋梅基于mtDNA cytb基因?qū)⑽鞑仃笈澐譃?大類: 巴青牦牛、嘉黎牦牛、工布江達(dá)牦牛、江達(dá)牦牛聚為一類, 帕里牦牛、康布牦牛、斯布牦牛聚為一類、類烏齊牦牛、丁青牦牛劃分為一類, 桑桑牦牛和桑日牦牛為一類[10]; 張成福等根據(jù)mtDNAD-loop區(qū)全序列將康布牦牛和嘉黎牦牛分為一類, 其余劃分為另一類; 柴志欣等[13-14]利用RAPD遺傳標(biāo)記將西藏牦牛分為2大類: 帕里牦牛為一類, 其余10個(gè)牦牛群體為一類; 郭松長等[15]對(duì)家牦牛mtDNA D-loop區(qū)研究中, 將斯布牦牛單獨(dú)劃分一類, 嘉黎牦牛和帕里牦牛在同一類. 本研究中類烏齊牦牛的遺傳多樣性最豐富, 這與鐘金城等的研究結(jié)果基本一致. 以上分類結(jié)果之間有較多的不同, 這可能可能是由于自然或人工選擇壓力下, 不同DNA序列的進(jìn)化速率存在一定差異造成的, 還有待于進(jìn)一步的深入研究.

3.3 西藏牦牛遺傳資源的保護(hù)與利用

總體上西藏牦牛遺傳資源十分豐富, 牦牛是稀有的高海拔畜種, 能適應(yīng)高原生態(tài)環(huán)境, 產(chǎn)乳、肉性能好, 繁殖能力強(qiáng), 幾乎沒有發(fā)生過流行性疫病. 作者建議對(duì)西藏每個(gè)地區(qū)尤其是優(yōu)勢(shì)種的數(shù)量、性狀指標(biāo)(生長發(fā)育、產(chǎn)乳、產(chǎn)肉、繁殖性能、抗病力、適應(yīng)性等)進(jìn)行系統(tǒng)研究分析, 成立保護(hù)區(qū), 進(jìn)行保種選育, 并由專家對(duì)保種的效果進(jìn)行監(jiān)督、檢測(cè), 預(yù)防出現(xiàn)新的有害性狀, 在保持遺傳資源多樣性不減少、不丟失的同時(shí)提高牦牛的生產(chǎn)性能, 適當(dāng)?shù)拈_展選育、雜交利用等工作. 合理的利用現(xiàn)有的牦牛品種資源, 達(dá)到開發(fā)利用與保護(hù)的雙重目標(biāo).

4 結(jié)論

西藏牦牛具有較豐富的mtDNA COⅠ遺傳多樣性, 西藏17個(gè)牦牛類群可分為2大類, 即錯(cuò)那牦牛(CN)、仲巴牦牛(ZB)、嘉黎(JL)牦牛、斯布牦牛(SB)、江達(dá)牦牛(JD)、工布江達(dá)牦牛(GB)、丁青牦牛(DQ)、康布牦牛(KB)、日多牦牛(RD)、巴青牦牛(BQ)、桑日牦牛(SR)、聶榮牦牛(NR)、隆子牦牛(LZ)、帕里牦牛(PL)、申扎牦牛(SZ)、桑桑(SS)牦牛為一類, 類烏齊(LWQ)牦牛單獨(dú)成一類.

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Evolution relationship and genetic diversity of Tibetan yaks inferred from mtDNA COⅠ

GUO Jiao1, XIN Jin-wei2, JI Qiu-mei2, ZHANG Cheng-fu2, CHAI Zhi-xin1, ZHONG Jin-cheng1
(1. Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education, Southwest University
for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2. Institute of Animal Science and Veterinary, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Lhasa 850000, P.R.C.)

This paper investigated the genetic diversity, clustering relationships and genetic differentiation of Tibetan yak populations and fully sequenced on mtDNACOⅠof 170 units which came from 17 Tibetan yak populations. MEGA5.0, DNASP5.0 and other softwares were used to analyze the nucleotide components, haplotype diversities and nucleotide diversities. The Kimura-2-Parameter model was used, NJ and UPGMA phylogenetic tree was constructed to analyze the genetic diversities, phylogenies and classifications of different groups of yak.①The total sequences of the mtDNACOⅠcoming form 17 Tibet yak groups were 1 545 bp in length, with no gene intron. And the initiation codon was AUG (ATG), and the finial codon was TAA, which encoded 514 amino acids. The average ratios of 4 kinds (T, C, A ,G ) of nucleotides were respectively 29.5%(29.3%～29.8%), 25.5%(25.2%～25.6%), 28.7%(28.6%～28.9% and 16.3%(16.2%～16.5%); the average content of G+C was 41.8% and the average content of A+T was 58.2% as well, with an obvious base bias.② The mtDNACOⅠof the 17 Tibetan yak groups had a total number of 25 haplotypes, and the haplotype diversity values changed between in 0～0.978, while the average haplotype diversity and the nucleotide diversity values were 0.566 and 0.00326, showing that the Tibetan yak genetic diversities are so rich .③ The average content of leucine in the Tibet yak cytochrome C oxidase subunit Ⅰ was most of all(11.496%), the least average content was cysteine (0.1946%). Contents of basic amino acids, acidic amino acids were respectively 6.6171%, 4.8627%. Hydrophilic amino acid, hydrophobic amino acids were respectively 57.39%, 42.61%.④ The clustering relationship and analysis of molecular variance also suggested that Tibetan yak could be divided into two species．

Tibetan yak; mtDNACOⅠ; genetic diversity

S813; S823

: A

: 1003-4271(2014)03-0336-08

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.03

2014-04-02

鐘金城(1963-), 男, 哈尼族, 云南綠春人, 教授, 博士, 研究方向: 動(dòng)物遺傳學(xué), E-mail: zhongjincheng518@126.com.

國家科技支撐計(jì)劃課題資助(編號(hào): 2012BAD03B02)