分泌抗金黃色葡萄球菌細(xì)菌素乳酸菌的分離鑒定

王全溪 許麗惠 鄧紅玉 吳雪珍 莊育彬 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 福州 350002

分泌抗金黃色葡萄球菌細(xì)菌素乳酸菌的分離鑒定

王全溪 許麗惠 鄧紅玉 吳雪珍 莊育彬 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 福州 350002

為分離和篩選產(chǎn)抗金黃色葡萄球菌乳酸菌素的優(yōu)勢乳酸菌，利用乳酸菌分離培養(yǎng)基MRS從收集的各種腌制菜汁中分離培養(yǎng)乳酸菌，通過細(xì)菌培養(yǎng)特性、革蘭氏染色特點(diǎn)、生理生化特性初步鑒定，同時(shí)根據(jù)Genbank中乳酸菌的16S rDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR方法進(jìn)一步鑒定，并以金黃色葡萄球菌為指示菌對乳酸菌的發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌特性研究。結(jié)果表明，從腌漬菜汁中分離獲得90株產(chǎn)酸菌，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性和PCR鑒定，結(jié)果73株產(chǎn)酸菌為乳酸桿菌；分泌產(chǎn)物抑菌試驗(yàn)表明，有10株菌具有抑制金黃色葡萄球菌活性，經(jīng)酸排除和過氧化氫排除試驗(yàn)，仍然有5株乳酸菌的分泌產(chǎn)物具有抑制金黃色葡萄球菌活性。可見，從腌漬菜汁分離到的乳酸菌具有抑制金黃色葡萄球菌活性的特性，主要是通過分泌乳酸菌素來發(fā)揮作用。

腌漬菜汁 乳酸菌 乳酸菌素 金黃色葡萄球菌 抑菌性

抗生素作為畜禽抑菌藥物和促生長添加劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。然而長期使用抗生素不但影響動(dòng)物疾病的防治效果，還會產(chǎn)生抗藥性和殘留，造成嚴(yán)重的畜產(chǎn)品污染，有的甚至?xí)T發(fā)人和動(dòng)物產(chǎn)生癌變和畸變，危及人類的健康與安全，如超級細(xì)菌[1]。因此，研制一種能改善畜禽健康、提高生產(chǎn)性能且安全無毒的能替代抗生素的飼料添加劑已成為動(dòng)物營養(yǎng)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

乳酸菌普遍存在于人和動(dòng)物消化道、發(fā)酵食品中的一類兼性厭氧菌。乳酸菌除了利用其產(chǎn)生的有機(jī)酸外，現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)它可以產(chǎn)生一種具有抑菌或殺菌作用的細(xì)菌素（bacteriocin）。20世紀(jì)中葉，Jacob[2]建議將細(xì)菌所產(chǎn)生的這種代謝物統(tǒng)稱為細(xì)菌素，并且根據(jù)其產(chǎn)生菌來進(jìn)行不同細(xì)菌素的命名。乳酸菌素是在乳酸菌代謝過程中，合成并分泌到環(huán)境中的一類對革蘭氏陽性菌(尤其是親緣性較近的細(xì)菌)和革蘭氏陰性菌具有抑制作用的蛋白或多肽，也常稱其為抗菌肽[3]。由于抗生素濫用引起的抗藥性也已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問題[4]，人們開始熱衷于研究其他可能的抗菌劑。細(xì)菌素的治療潛力引起了人們對這一領(lǐng)域的關(guān)注。研究者發(fā)現(xiàn)lacticin3147有治療金黃色葡萄球菌引起的牛乳房炎的效果[5]。Svetoch等發(fā)現(xiàn)鏈球菌S760產(chǎn)生的乳酸菌素對因感染沙門氏菌的雛雞有很好的療效。Christine Beecher（2009）把乳酸菌素Lactococcus lactis DPC 3147注射進(jìn)乳牛乳房中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳牛乳房中IL-1和IL-8表達(dá)大大增加，乳酸菌素具有調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答的能力[6]?？梢?，乳酸菌素可以起到抑菌并提高機(jī)體免疫力的作用。

乳酸菌種類繁多，而各種乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素各不相同，目前已有40多種，其成分和抗菌譜各不相同。同時(shí)，目前對乳酸菌素的研究主要集中在食品行業(yè)，而針對畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中致病菌的乳酸菌素的研究極少。因此，本研究以本實(shí)驗(yàn)室分離的具有高耐藥的致病菌金黃色葡萄球菌作為指示菌，篩選分泌抑制致病性金黃色葡萄球菌乳酸菌素的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 菌株金黃色葡萄球菌由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.2 試劑腌漬菜汁：農(nóng)家自家腌漬菜汁、市銷腌漬菜汁。培養(yǎng)基：改良MRS液體培養(yǎng)基，改良MRS培養(yǎng)基，普通肉湯培養(yǎng)基，普通瓊脂培養(yǎng)基。試劑：革蘭氏染色液配套試劑盒，細(xì)菌微量生物反應(yīng)管（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；DNA Marker（大連寶生物工程有限公司）。

1.3 乳酸菌的分離、鑒定與篩選無菌生理鹽水稀釋收集的各類菜汁，涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，然后挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行分離、純化。然后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，革蘭氏染色及顯微觀察，細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)。

分子生物學(xué)檢測：水煮法提取細(xì)菌DNA：根據(jù)已發(fā)表的相關(guān)乳酸菌16S rDNA序列及文獻(xiàn)，選用乳桿菌種群一特異性PCR引物：5′-ATGTGTAGCGGTGAAATGCG-3′和5′-GGCGGCTGGCTCCTAAAAG-3′。預(yù)設(shè)片段大小為765 bp。PCR反應(yīng)體系：0.5 μL上引物，0.5 μL下引物，10 μL2×PCR Master，1 μL模板，補(bǔ)足雙蒸水20 μL；擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行37個(gè)循環(huán)；再72℃延伸7 min。擴(kuò)增完畢后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。最后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送由上海生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果用NCBI的BLAST工具軟件進(jìn)行同源性檢索分析。

1.4 乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌試驗(yàn)

1）乳酸菌上清液的制備：將所分離的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，活化后取培養(yǎng)液，4℃、11 000 r/min，離心20 min取上清液，備用。

2）金黃色葡萄球菌液的制備：將金黃色葡萄球菌接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，活化后將細(xì)菌濃度調(diào)至1×108cfu/mL，備用。

3）乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用：試驗(yàn)采用牛津杯法。用無菌L棒將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物100 uL均勻涂抹在普通瓊脂培養(yǎng)基上，待干后放置牛津杯。將乳酸菌上清液各200 uL按順序加入牛津杯內(nèi)（注意做好標(biāo)記）后，放入4℃冰箱擴(kuò)散24 h，再放入37℃溫箱培養(yǎng)16 h，觀察有無抑菌環(huán)并測量其直徑。

1.5 酸對金黃色葡萄球菌的抑菌作用的排除用無菌L棒將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物100 uL均勻涂抹在普通瓊脂培養(yǎng)基上，待干后放置牛津杯。將調(diào)好pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0的改良MRS液體培養(yǎng)基各200 uL按順序加入牛津杯內(nèi)（注意做好標(biāo)記）后，放入4℃冰箱擴(kuò)散24 h，再放入37℃溫箱培養(yǎng)16 h，觀察有無抑菌圈并測量其直徑。

1.6 過氧化氫對金黃色葡萄球菌的抑菌作用的排除為排除過氧化氫對金黃色葡萄球菌抑制作用的影響，將乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌具有抑菌作用的菌株發(fā)酵上清液用過氧化氫酶處理，未經(jīng)處理的發(fā)酵上清為對照，金黃色葡萄球菌為指示菌，用牛津杯法驗(yàn)證上清液的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的培養(yǎng)特性和革蘭氏染色特性從腌漬菜汁中共分離獲得90株產(chǎn)酸菌，分別進(jìn)行培養(yǎng)特性、形態(tài)染色特性、生化特性和PCR鑒定。結(jié)果表明，分離菌菌落形態(tài)均為圓形，濕潤，表面光滑且凸起，不透明或半透明，顏色為白色或灰白色，邊緣整齊(見圖1-A)。在培養(yǎng)液中生長物混濁，兼性厭氧。革蘭氏染色，油鏡觀察所分離菌為革蘭氏陽性菌，菌體為短桿狀或球狀，單個(gè)、成雙、鏈狀或成堆排列（見圖1-B）。

2.2 菌株的生理生化特性分離菌進(jìn)行生理生化檢驗(yàn),結(jié)果表明，接觸酶陰性，不液化明膠，不還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚、硫化氫，不分解尿素，MR反應(yīng)陽性，VP反應(yīng)陽性；能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和乳糖產(chǎn)酸。

圖1 乳酸菌的分離鑒及藥敏試驗(yàn)[A：MRS培養(yǎng)基菌落特點(diǎn)；B：革蘭氏染色；C：16S的PCR結(jié)果（1：乳酸菌陰性；2-5：乳酸菌陽性）；D：乳酸菌上清液抑制金黃色葡萄球菌試驗(yàn)]

2.3 PCR檢測結(jié)果引物設(shè)計(jì)和PCR反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1-C。在765 bp有特異的條帶。綜上，初步確定本次試驗(yàn)共分離到的90株產(chǎn)酸菌中有73株為乳酸菌。

2.4 基因檢測和測序結(jié)果分離菌16S rDNA PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司序列測定。測序結(jié)果在NCBI的BLAST進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示所分離的菌株與NCBI上登記的乳桿酸菌同源性達(dá)98%以上，進(jìn)一步說明所分離菌株為乳桿菌。

2.5 乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌試驗(yàn)牛津杯法抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，73株乳酸菌中有10株乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌有明顯抑菌作用（見表1和圖1-D）。

表1 乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.6 酸排除試驗(yàn)結(jié)果由于乳酸菌的分泌產(chǎn)物中有一定量的有機(jī)酸如乙酸，有機(jī)酸對細(xì)菌的生長有重要的影響。為此，設(shè)計(jì)不同pH值來測定酸對金黃色葡萄球菌的影響試驗(yàn)。由表2可知，不同酸度對金黃色葡萄球菌生長均無影響，特別是酸度達(dá)2.0時(shí)，仍然不能抑制金黃色葡萄球菌生長?？梢?，金黃色葡萄球菌具有耐酸的作用。同時(shí)也說明乳酸菌培養(yǎng)液對金黃色葡萄球菌的抑制作用并非由于酸的作用。

表2 不同酸度對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.7 過氧化氫排除試驗(yàn)結(jié)果過氧化氫是乳酸菌的分泌產(chǎn)物之一，為了證實(shí)本次分離的乳酸菌是通過細(xì)菌素來抑制金黃色葡萄球菌生長，設(shè)計(jì)了本試驗(yàn)。結(jié)果見表3，10株分離鑒定的對金黃色葡萄球菌有抑制效果的乳酸菌上清液經(jīng)過氧化氫酶處理后，其中有5株已失去了抑制作用，說明這些菌株與其分泌的過氧化氫有關(guān)，而還有5株分離菌其抑菌圈直徑和原上清液的抑菌圈直徑相比變化不大，說明這5株乳酸菌是通過其分泌產(chǎn)物如細(xì)菌素來抑制金黃色葡萄球菌的生長。

表3 過氧化氫排除試驗(yàn)的影響

2.8 乳酸菌的測序鑒定結(jié)果本試驗(yàn)將5株經(jīng)酸排除和過氧化氫排除試驗(yàn)后仍然對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制效果的乳酸菌進(jìn)行測序，經(jīng)基因遺傳進(jìn)化樹分析表明，該5株分離菌均為植物乳桿菌。

3 討論

1）乳酸菌種類繁多，而各種乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素各不相同。本次試驗(yàn)通過從農(nóng)家自制各種腌制的咸菜中分離并鑒定了73株乳酸菌，經(jīng)過酸排除試驗(yàn)和過氧化氫試驗(yàn)，最終確定5株乳酸菌其主要通過細(xì)菌素來抑制金黃色葡萄球菌的生長，測序分析表明，該5株菌為植物乳桿菌。

2）每種乳酸菌至少應(yīng)該能夠分泌一種乳酸菌素，甚至一種乳酸菌可能產(chǎn)生幾種乳酸菌素[7]。我國擁有豐富的乳酸菌資源庫，但是如何在如此豐富復(fù)雜的乳酸菌資源庫中快速有效地篩選出廣譜高效的乳酸菌素高產(chǎn)菌株，這是面臨的一個(gè)重要的難題[8]。建立高通量篩選模型是新型乳酸菌開發(fā)的重要方法之一。易華西建立了Colony-PCR高能量篩選方法，從275株乳酸菌中獲得1株Class 2a抗菌肽產(chǎn)生菌株[9]。本次試驗(yàn)沒能應(yīng)用高能量篩選方法，所以在篩選過程耗費(fèi)了大量的人力和時(shí)間，在今后的試驗(yàn)中應(yīng)該改進(jìn)試驗(yàn)方法，提高篩選效率。

3）乳酸菌素是由乳酸菌分泌的一種具有殺菌功能的多肽或蛋白質(zhì)，它對腐敗菌和致病菌都有一定的抑制作用，但是細(xì)菌素本身卻被消化道中的酶降解，所以現(xiàn)在普遍認(rèn)為乳酸菌素是一種無毒安全的食品添加劑[8]。因此，篩選廣譜抗菌功能乳酸菌素是未來的趨勢。本次試驗(yàn)分離的乳酸菌，通過酸排除和過氧化氫排除試驗(yàn)，基本能夠確定，其抑菌物質(zhì)是乳酸菌素，然而該細(xì)菌素是否具有廣譜抑菌功能，將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步探討。同時(shí)，如何更好地把乳酸菌素應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中也是廣大畜牧工作者的一個(gè)重要的研究方向。因?yàn)?，抗生素的弊端在畜牧生產(chǎn)中已經(jīng)不斷體現(xiàn)出來，如細(xì)菌的高度耐藥、抗生素殘留對人體健康的影響等。健康養(yǎng)殖、食品安全仍然是當(dāng)前畜牧生產(chǎn)中的一大難題。

4）在細(xì)菌素的研究中仍存在許多問題，主要體現(xiàn)在：細(xì)菌素的產(chǎn)量較低、細(xì)菌素的抑菌譜較窄、細(xì)菌素在不同介質(zhì)中的溶解性和穩(wěn)定性較差。因此，在今后一段時(shí)間，乳酸菌素的研究重點(diǎn)是根據(jù)已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)全新的氨基酸序列，人工合成新型細(xì)菌素或?qū)ΜF(xiàn)有的細(xì)菌素進(jìn)行改造,提高乳酸菌細(xì)菌素的應(yīng)用潛力，利用DNA重組技術(shù)合成滿足人們要求的活性多肽或蛋白質(zhì)，提高乳酸菌素產(chǎn)量水平，拓寬乳酸菌素抑菌譜，提高乳酸菌素穩(wěn)定性，提高乳酸菌素抑菌活力，探討細(xì)菌素產(chǎn)生菌株的自身免疫性機(jī)制[10]。

[1]朱蓓蕾.動(dòng)物性食品藥物殘留[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1994.

[2]Jacob F,Siminovitchl,Wollmane.Biosynthesis of a colicin and its mode of action[J].Ann Inst Pasteur(Paris),1952,83(3): 295-315.

[3]還連棟,賈士芳,莊增輝,等.乳鏈菌肽(NISIN)的殺菌作用機(jī)制[J].中國食品添加劑,1997(4):21-22.

[4]唐忠有.應(yīng)用乳酸菌素與抗生素類藥物預(yù)防畜禽腸道細(xì)菌性疾病的分析[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2008(3):45.

[5]Clare Piper,Pat G.Casey,Colin Hill,et al.The Lantibiotic lacticin 3147 prevents systemic spread of staphylococcus aureus in a murine infection model[J].International Journal of Microbiology,2012:1-6.

[6]Christine Beecher,Mairéad Daly,Donagh P Berry,et al.Administration of a live culture of Lactococcus lactis DPC 3147 into the bovine mammary gland stimulates the local host immune response,particularly IL-1 beta and IL-8 gene expression[J].Journal of Dairy Research,2009,76:340-348.

[7]蔣志國,杜琪珍.乳酸菌素研究進(jìn)展[J].中國釀造,2008(18): 1-4.

[8]牟光慶,李霞,李慧,等.廣譜乳酸菌素的研究[J].食品科學(xué), 2008,29(11):469-472.

[9]易華西.分泌廣譜抗菌肽乳酸菌的篩選及高效表達(dá)的調(diào)控研究[D].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué),2010:1-2.

[10]陳靜,張玉蒼,何連芳.乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(4):1925-1927.

Isolation and identification of lactic acid bacteria producing anti-Staphylococcus aureus bacteriocin

Wang Quanxi Xu Lihui Deng Hongyu Wu Xuezhen Zhuang Yubin
(College of Animal Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002)

The study was carried out to separate the lactic acid bacteria which could produce the bacteriocin against S.aureus.In this experiment,the lactic acid bacteria were isolated from the salted and preserved vegetables with the MRS medium.Identification was done by bacterial culture characteristics,Gram stain characteristics,physiological and biochemical characterization,And the bacteria was identified by PCR.The antibacterial properties of lactic acid bacteria fermentation supernatant was studied.The results showed that 73 strains acid-producing bacteria were isolated,and were identified to Lactobacillus by morphological characteristics,biochemical characteristics and PCR.The antibacterial test showed that there were ten strains Lactobacillus which secretory products could inhibit staphylococcus aureus.Ruled out by acid and hydrogen peroxide exclusion experiments,there were still 5 strains of lactic acid bacteria which secretion can inhibit staphylococcus aureus.Therefore,in this experiment the lactic acid bacterium that isolated from the salted and preserved vegetables have the activity of anti-Staphylococcus aureus,which is mainly through the secretion of lactic acid bacteria.

Pickled vegetable juice Lactic acid bacteria lactobacillus Staphylococcus aureus antimicrobial activity

A

1003-4331（2014）06-0009-04

福建省教育廳科技項(xiàng)目B類（JB12054）資助。