實驗獼猴生殖道電生理學(xué)研究

李志雄 范春梅＊ 王 梅 徐 昕

（1.福建省人口和計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所 福州 350013；2.國家衛(wèi)計委非人靈長類生育調(diào)節(jié)技術(shù)評價重點實驗室 福州 350013）

生殖醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，要求對實驗獼猴排卵情況做出準確監(jiān)測，現(xiàn)有的獼猴排卵監(jiān)測手段在精確性和可操作性方面存在局限性，難以滿足最新科研的需要。動物排卵測定儀對排卵的監(jiān)測具有簡便易行、準確、快速等可操作性優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用在家畜和野生動物的排卵監(jiān)測，但在獼猴上尚未見報道。本研究目的在于探索獼猴陰道分泌物電阻值在月經(jīng)周期中變化規(guī)律，并通過與血清E2比較，評價陰道分泌液電阻值作為預(yù)測獼猴排卵指標的價值，為建立獼猴的監(jiān)測排卵方法提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 實驗動物

1.1.1 實驗雌猴的選擇 選擇月經(jīng)周期正常、健康狀況良好、有正常生育史、年齡在6～10歲、性皮膚變化明顯的雌猴33只。

1.1.2 實驗動物的飼養(yǎng)管理 對實驗所選的實驗猴單籠飼養(yǎng)。在配種繁殖期間適當增加蛋白質(zhì)及維生素E的飼料供應(yīng)。實驗獼猴由福建省人口和計劃生育科研所提供，實驗猴生產(chǎn)許可證（SCXK（閩）2010-0002）,使用許可證分別為(SYXK（閩）2010-0005）。

1.2 儀器設(shè)備 DRANINSKI狗排卵測定儀；貝克曼ACCESS全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀；OLYMPUS高級生物顯微鏡。

1.3 試劑 貝克曼公司試劑批號：雌二醇935172；質(zhì)控品：美國伯樂（批號：45232）。

2 方法

2.1 獼猴生殖道電阻值的測定

2.1.1 電阻值測定儀的準備與消毒 在空氣中檢測確保電池的電量。準備消毒劑，按消毒步驟的指示給探針消毒。清洗擦干實驗猴陰道周圍皮膚。

2.1.2 測定方法 固定獼猴，從陰道徐徐插入探針5～6 cm處，數(shù)秒后讀取數(shù)據(jù)，探針旋轉(zhuǎn)3周后再讀數(shù)據(jù)，共讀取3次，取其平均值；拔出探針后消毒。

2.1.3 測定時間 在繁殖季節(jié)里，月經(jīng)周期的第2 d開始，每天檢測實驗猴生殖道電阻值，直至下次月經(jīng)周期的到來或止于月經(jīng)周期的第28 d。

2.2 雌二醇激素分泌水平的測定

2.2.1 Access測定原理 雌二醇的檢測是一種使用了延時加入酶結(jié)合物的競爭結(jié)合的酶免疫檢測。樣品和包被了羊抗兔抗體：兔抗雌二醇捕捉抗體的磁性顆粒，以及含蛋白的Tris緩沖液一起被加入到反應(yīng)管中，20 min以后，加入雌二醇-堿性磷酸酶酶結(jié)合物。樣品中的雌二醇與雌二醇-堿性磷酸酶酶結(jié)合物競爭結(jié)合有限的特異性雌二醇抗體的結(jié)合位點，最后抗原-抗體復(fù)合物通過捕捉抗體結(jié)合到磁性顆粒表面。而后，反應(yīng)管被傳送到磁性分離區(qū)域進行多次沖洗，去除未和固相結(jié)合的其他成分。最后在反應(yīng)管中加入化學(xué)發(fā)光底物（Lumi-Phos*530），該反應(yīng)所產(chǎn)生的光子并被光電比色計所檢測。光子的產(chǎn)量與樣品中的雌二醇的濃度呈反比，最后，對照儀器中儲存的多點定標曲線中所描繪的光量子與標準品雌二醇的對應(yīng)關(guān)系而計算出樣品中的雌二醇濃度。2.2.2 測定時間 在實驗猴月經(jīng)周期第8～12 d，每天上午9：00～10：00進行上肢隱靜脈抽血、分離出血清，-80℃保存，全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測E2。

3 結(jié) 果

3.1 獼猴不同月經(jīng)周期生殖道電阻值檢測結(jié)果33只實驗用猴檢測結(jié)果，見圖1-圖2。

圖1 利用排卵測定儀檢測猴生殖道電阻值檢測結(jié)果

圖2 按月經(jīng)周期中所測電阻值最低值的時間為0 d，其前后時間里的檢測結(jié)果

3.2 血清雌二醇的檢測結(jié)果 33只實驗用猴在月經(jīng)周期的第8～12 d測定血清雌二醇的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 血清E2檢測結(jié)果

3.3 電阻值最低日與E2高峰日天數(shù)之差實驗猴例數(shù)所占總例數(shù)的百分率 33個月經(jīng)周期中，實驗猴陰道電阻值最低日與E2高峰日天數(shù)之差的實驗猴例數(shù)百分率，見表1、圖4。

表1 實驗猴陰道電阻值最低日與E2高峰日天數(shù)之差的例數(shù)百分率

4 結(jié)果分析

1）根據(jù)對實驗獼猴陰道電阻值的檢測，結(jié)果顯示月經(jīng)周期第11 d出現(xiàn)最低值。在猴卵泡期初始，月經(jīng)周期的第4 d陰道電阻值由587±184Ω逐步下降至排卵期第11 d的213±179Ω，最低值在100Ω左右；隨著黃體期的到來，電阻值又急速上升，到第16 d上升至 365±148Ω，第 22 d平穩(wěn)在 390±140Ω水平。排卵期電阻值與卵泡期及黃體期的電阻值差異非常顯著。以電阻值最低點均值76±33Ω與其前后1 d的電阻值均值194±32Ω和208±29Ω差異也非常明顯（P＜0.01）。

圖4 例數(shù)百分率餅狀圖

2）本實驗血清E2高峰日出現(xiàn)在月經(jīng)周期第10 d，濃度為187.8±123.3 pg/mL與張惠云等[1]報道相似（卵泡期 E2濃度為 245±193 pg/mL），E2的分泌高峰日與李沛等[2]通過針刺對雌性獼猴生殖內(nèi)分泌影響的研究，發(fā)現(xiàn)雌性獼猴E2峰值出現(xiàn)在月經(jīng)周期的第9±1 d相符合。陰道電阻值最低日與E2峰日吻合率為36.4%，提前1 d的例數(shù)占總數(shù)的18.2%，提前2 d的例數(shù)有21.2%，以上三者相加占總數(shù)的75.8%，說明生殖道分泌物電阻值最低日主要出現(xiàn)在E2峰日或在其后2 d內(nèi)。劉宏偉[3]在排卵監(jiān)測各指標的意義中認為血液中的E2主要來自優(yōu)勢卵泡，在卵泡發(fā)育進入活躍期后上升，并成倍遞增，排卵前24～36 h 達峰值（雌激素第一峰＞732 pmo1/L），提示卵泡發(fā)育成熟；排卵后快速下降，約為峰值的50%。據(jù)報道，在排卵前雌激素峰值期，宮頸黏液的鋸齒形變化現(xiàn)象最為顯著，此系黏液素的存在形成的氯化鈉晶體，排卵臨近時，宮頸黏液中不僅氯化鈉含量增加，而且體積增加10～12倍[4]。由于排卵前宮頸黏液稀薄，分泌量明顯增加，易流入陰道內(nèi)，與陰道內(nèi)少量分泌液混合，排卵前氯化鈉濃度增加，所測定的陰道電阻值必然減小。因獼猴陰道口小，陰道皺折多，位于胼胝底之間，難以應(yīng)用擴張器械探查、采集宮頸黏液，因此，難以用宮頸黏液的評分方法來預(yù)測獼猴排卵。

3）使用排卵測定儀來監(jiān)測動物（狐、羊、牛等）發(fā)情與排卵已得以證實。李滌非等[5]在北極狐發(fā)情陰道分泌物電阻值變化規(guī)律的觀察中認為，“黏液電測法”完全可以用來進行雌狐的發(fā)情鑒定，當雌狐陰道分泌物電阻值達到最高峰，并開始急劇下降的第1～2 d放對，可很快達成交配。秦新等[6]用電阻測定母羊最適授精時間提高受孕率實驗觀察，用電阻測定法確定發(fā)情母羊最適配種，可使發(fā)情母羊凍配受孕率提高43%。根據(jù)吳元昌等[7]在發(fā)情鑒定儀測定母牛適宜配種時機實驗結(jié)果證實，母牛發(fā)情前期電阻值最高，隨著發(fā)情旺盛的出現(xiàn)電阻值逐漸下降，發(fā)情后期電阻值開始回升。

4）通過對獼猴的實驗研究，揭示了月經(jīng)周期內(nèi)生殖道電阻值隨著E2分泌水平的變化而呈現(xiàn)出有規(guī)律性變化。該法簡便易行、無創(chuàng)傷、無副作用，適于在獼猴繁殖和相關(guān)科研中使用?？捎肂型超聲儀監(jiān)測獼猴卵泡發(fā)育及排卵動態(tài)情況，進一步研究與探索陰道電阻值與排卵的關(guān)系。

[1]張惠云,喬明,陳雨振,等.正常獼猴性周期相關(guān)指標的檢測[J].中藥藥理與臨床,2002,189(1):46-47.

[2]李沛,王訓(xùn)立.針刺對雌性恒河猴生殖內(nèi)分泌抑制性影響的研究[J].中國針炙,1999,19(8):486-488.

[3]劉宏偉.排卵監(jiān)測各指標的意義 [J].實用婦產(chǎn)科雜志,2008,24(8):457-460.

[4]Monghissi K S.Prediction and detection[J].Fertil Steril,1980,34:89.

[5]李滌非,耿孝媛,吳曉民,等.北極狐發(fā)情期陰道分泌物電阻值變化規(guī)律的觀察[J].經(jīng)濟動物學(xué)報,2003,7(2):11-14.

[6]秦新,南朝俊,牛海昌,等.用電阻測定母羊最適授精時間提高受孕率[J].黑龍江動物繁殖,2004,12(1):29.

[7]吳元昌,鄭羽,高建新.發(fā)情鑒定儀測定母牛適宜配種時機[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2008,27(2):92-93.