三種 HLA-A / 0201 限制性表位肽尤文肉瘤樹突狀細胞疫苗的抗腫瘤免疫作用

彭 偉 黃迅悟 趙偉鵬 趙 銘 楊大志

. 論著 Original article .

三種 HLA-A / 0201 限制性表位肽尤文肉瘤樹突狀細胞疫苗的抗腫瘤免疫作用

彭 偉 黃迅悟 趙偉鵬 趙 銘 楊大志

目的比較不同 EWS / FLI-1 蛋白 HLA-A / 0201 限制性表位肽對尤文肉瘤樹突狀細胞( dendritic cell，DC ) 疫苗的抗腫瘤作用。方法綜合運用 BIMAS、SYFPEITHI 軟件篩選與人白細胞抗原HLA-A / 0201 結合力強的 EWS / FLI-1 蛋白 9 肽表位，并合成其表位肽。采用 4 h 標準51Cr 釋放實驗檢測刺激細胞毒性 T 淋巴細胞 ( cytotoxic T lymphocytes，CTLs ) 對腫瘤細胞的殺傷效應。應用酶聯免疫斑點法 ( enzyme linked immunospot assay，ELISPOT ) 檢測表位肽對 DC 疫苗刺激的效應細胞 γ-干擾素 ( interferon，IFN-γ ) 的釋放。在此基礎上，進行免疫治療的動物實驗，比較其體內抗腫瘤作用。結果篩選出 EWS 306、EWS 289 及EWS 401 與 HLA-A / 0201 具較強的結合性，其合成出的表位肽分別為：QLWQFLLEL ( EWS 306 )、ILGPTSSRL ( EWS 289 ) 和 SMYKYPSDI ( EWS 401 )。3 組表位肽均有較強的殺傷力，當效－靶比為 50∶1 時，殺傷率 EWS 306 組 ( 20.2±1.8 ) %、EWS 289 組 ( 12.6±0.3 ) %、EWS 401 組 ( 11.9±0.2 ) %，而對照組為 ( 6.7±0.1 ) %；當效－靶比為 100∶1 時，表位肽的三組殺傷作用明顯提升，殺傷率 EWS 306 組最高為 ( 51.2±3.7 ) %、EWS 289組 ( 24.6±2.1 ) %、EWS 401 組 ( 17.8±0.9 ) %，對照組為 ( 7.2±0.2 ) %。EWS 306 組同其它組比較，差異有統(tǒng)計學 ( P＜0.05 )。EWS 306 組分泌的 IFN-γ 為 ( 118.3±3.6 ) 個點明顯高于 EWS401 組 ( 35.1±1.0 ) 個和 EWS 289 組 ( 34.2±0.9 ) 個，對照組為 ( 5.0±0.1 ) 個 ( P＜0.05 )。EWS 306 組腫瘤的體積 ( 978.9±28.2 ) mm3明顯小于陰性對照組 ( 1992.9±16.1 ) mm3和空白對照組 ( 2001.9±12.3 ) mm3( P＜0.05 )。接種后第 35 天，EWS 306 組存活率為 80% 大于空白對照組為 0%、陰性對照組為 10% ( P＜0.05 )；接種后第 40 天，空白對照組降為 0%，EWS 306 組為 80% 明顯大于和 2 個對照組 ( P＜0.05 )。結論EWS / FLI-1 蛋白表位肽中 EWS 306 較 EWS 289和 EWS 401 對 DC 的抗腫瘤作用更強，能夠有效激活 CTLs 對腫瘤細胞的殺傷效應，為尤文肉瘤的免疫治療提供了新的方向。

肽類；藥物篩選試驗，抗腫瘤；抗腫瘤藥；限制性表位肽；尤文肉瘤

尤文肉瘤是發(fā)生率僅次于骨肉瘤，好發(fā)于青少年兒童的惡性腫瘤，約占兒童腫瘤發(fā)生率的1%[1-3]。雖然放療、化療聯合手術治療使生存率有了明顯提高，但仍有 30%～40% 的患者復發(fā)，23%以上的患者死于復發(fā)和全身轉移[4-6]。因此尋求新興的免疫治療方法成為尤文氏肉瘤的研究熱點[7-9]。郭義等[10]實驗證實，EWS / FLI-1 基因修飾的樹突狀細胞疫苗對尤文肉瘤細胞具有殺傷效果。曹凱等[11]通過分子模擬實驗證明，不同的表位肽與HLA-A / 0201 的結合能力有所差異，而人類白細胞抗原 HLA-A / 0201 在抗原提呈和細胞毒性 T 淋巴細胞識別過程中起關鍵作用。因此，本研究將對EWS / FLI-1 蛋白進行 HLA-A / 0201 限制性細胞毒性 T 淋巴細胞表位進行預測和篩選，并進一步比較結合力好的表位肽對尤文肉瘤的樹突狀細胞疫苗的抗腫瘤作用，為臨床應用提供理論依據。

資料與方法

一、細胞株和實驗動物

人類 TAP 缺陷的 T2細胞株、BB7.2 細胞株 ( 可產生抗 HLA-A2 的單克隆抗體 )、人尤文肉瘤細胞株A673 購買于美國菌種保藏中心 ( ATCC，Manassas，VA，USA )。細胞采用含 10% 胎牛血清和含 1% 青霉素＋鏈霉素溶液 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，孵育于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。

實驗動物選用非肥胖型糖尿病 / 重癥聯合免疫缺陷 ( NOD / SCID ) 小鼠和 BALB / c ( H-2d ) 小鼠，6～10 周齡，購自軍事醫(yī)學科學院動物所。動物的飼養(yǎng)采用 SPF 級飼養(yǎng)，所有動物實驗遵守動物倫理委員會原則。

二、表位肽的篩選及合成

從 Genbank 檢索獲得 EWS / FLI-1 蛋白氨基酸序列全長，應用 BIMAS 和 SYFPEITHI 軟件[12-13]對EWS / FLI-1 蛋白 476 個氨基酸序列進行 HLA-A / 0201 限制性細胞毒性 T 淋巴細胞表位進行分析，篩選出得分最高的 3 組 9 肽表位。通過表位肽親和力檢測試驗，比較篩選出的表位肽與 HLA-A / 0201 的親合力大小。其親和力結果采用熒光系數( FI，Fluorescence index ) 表示，當 IF≥1.5 時，兩者親和力較強；當 1≤FI＜1.5 時，親和力中等；當0.5≤FI＜1 時，親和力較低；當 IF＜0.5 時，兩者無親和力。

應用標準 Fmoc 方案合成篩選出的表位多肽，并對表位肽進行純化處理，以供后續(xù)試驗用 ( 由世紀亞光公司完成 )。

三、樹突狀細胞 ( dendritic cell，DC ) 的培養(yǎng)

從健康人 ( HLA-A2+ ) 外周抗凝血 200 ml 血膜的 20 ml 處，應用淋巴細胞分離液 Ficoll-Hypaque梯度離心分離外周血單核細胞 ( peripheral blood mononuclear cells，PBMC )。吸棄上清，用預熱的無血清 RPMI1640 洗取非貼壁細胞，貼壁細胞用RPMI1640＋10% 胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。加入 75 cm2培養(yǎng)瓶中 ( corning )，在 37 ℃、5% ( V / V ) CO2孵育 2 h。培養(yǎng)后第 5 天，加入 1000 U / ml 粒－巨噬細胞集落刺激因子 hGM-CSF ( R & D Systems，Minneapoils，MN，美國 ) 和 1000 U / m 白細胞介素( interleukin-4，IL-4 ) ( R & D Systems，Minneapoils，MN，美國 )，隔日半量換液并補充細胞因子。培養(yǎng)后第 7 天加入腫瘤壞死因子 α ( tumor necrosisfactor α，TNF-α ) ( R & D Systems，Minneapoils，MN，美國 ) 1000 U / ml，繼續(xù)培養(yǎng) 2 天促進其成熟。對成熟的 DC 表型采用流式細胞儀進行檢測。

四、表位肽沖擊致敏 DC 疫苗和 DC 遞呈抗原、效應細胞的制備

在 3 組 DC 細胞中分別加入 100 μg / ml 的QLWQFLLEL ( EWS 306 )，ILGPTSSRL ( EWS 289 )和 SMYKYPSDI ( EWS 401 ) 表位多肽，孵育 4 h，經20 Gy 照射后 15 min，洗滌 2 次，加入復蘇的淋巴細胞，進行肽沖擊，然后加入 20 U / ml 的 IL-2，如此每周 1 次，共 3 次后收集效應細胞。

五、4 h 標準51Cr 釋放實驗

檢測和比較各組 DC 疫苗刺激產生特異性細胞毒性 T 淋巴細胞 ( cytotoxic T lymphocyte，CTL )的體外殺傷效果。以 A673 細胞為靶細胞, 與51Cr ( 100 μCi / 106個細胞 ) 于 37 ℃ 水浴箱內共同溫育2 h，磷酸鹽緩沖液 ( PBS ) 洗滌細胞 3 次，用 RPM I-1640 重懸并按不同效－靶比 ( 25∶1、50∶1 以及 100∶1 ) 與效應細胞混合。設置負載病毒 HBcAg 18-27 組作為對照組。孵育后 4 h 收集上清液，利用γ 放射免疫計數器測定各孔的每分鐘脈沖值，計算公式如下：特異性殺傷率 ( % )＝( 試驗孔 cpm－自然釋放孔 cpm ) / ( 最大釋放孔 cpm－自然釋放孔 cpm ) ×100%。

六、酶聯免疫斑點法 ( enzyme linked immunospot assay，ELISPOT ) 檢測表位肽負載的 DC 疫苗效應細胞釋放 IFN-γ 的實驗。操作步驟按照說明書進行。

七、體內抗腫瘤免疫作用的檢測

6 周齡非肥胖型糖尿病 / 重癥免疫缺陷 ( NOD / SCID ) 小鼠 30 只，隨機分成 3 組：EWS 306 組為實驗組，HBcAg18-27 組為陰性對照組，PBS 組為空白對照組，每組 10 只。A673 細胞以 1×106個 / 100 μl 在小鼠左腋窩皮下接種，構建人尤文肉瘤小鼠模型。EWS 306 組：接種后 3 天，以 100 μl 肽沖擊 DC 細胞懸液 ( 1×106) 通過尾根部注射，每 5 天重復注射 1 次，共 4 次。陰性對照組接種同樣數量和體積的細胞懸液，空白對照組接種相同體積的PBS。瘤體可觸及后，用游標卡尺測量腫瘤最長徑( a ) 和最短徑 ( b )。腫瘤體積 ( mm3) 計算公式為：腫瘤體積 ( V )＝1 / 2a×b2，繪制腫瘤生長曲線。觀察小鼠生存情況，并繪制生存曲線。

八、統(tǒng)計學方法

結 果

一、表位肽的篩選及合成

篩選出了 3 組 9 肽表位和 HLA-A / 0201 的有較強的親合力，分別為 EWS 306、EWS 289 及 EWS 401。其合成的表位肽序列分別為：QLWQFLLEL ( EWS 306 )、ILGPTSSRL ( EWS 289 ) 和 SMYKYPSDI ( EWS 401 ) ( 表 1 )。

表1 3種 EWS / FLI-1 蛋白 HLA-A / 0201 限制性表位肽Tab.1 Three kinds of HLA-A / 0201-restricted epitope peptides of EWS / FLI-1 protein

二、DC 疫苗殺傷實驗

三組表位肽 DC 疫苗誘導的 CTL 都能對 A673進行特異性殺傷：當效－靶比為 25∶1 時作用不太明顯，殺傷率 EWS 306 組 ( 6.8±0.2 ) %、EWS 289 組 ( 6.6±0.1 ) %、EWS 401 組 ( 6.4±0.1 ) %、對照組為 ( 6.2±0.1 ) %；當效－靶比為 50∶1 時，表位肽的三組殺傷作用提升，殺傷率 EWS 306 組( 20.2±1.8 ) %、EWS 289 組 ( 12.6±0.3 ) %、EWS 401 組 ( 11.9±0.2 ) %，而對照組為 ( 6.7±0.1 ) %，且 EWS 306 組同其它組比較，差異有統(tǒng)計學意義( P＜0.05 )；當效－靶比為 100∶1 時，表位肽的三組殺傷作用明顯提升，殺傷率 EWS 306 組最高為( 51.2±3.7 ) %、EWS 289 組 ( 24.6±2.1 ) %、EWS 401 組 ( 17.8±0.9 ) %，對照組殺傷作用變化不大，為 ( 7.2±0.2 ) %，EWS 306 組同其它組比較，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 ) ( 圖 1 )。

三、效應細胞 IFN-γ 釋放的檢測

用 ELISPOT 方法比較不同表位肽沖擊 DC 疫苗刺激效應細胞分泌 IFN-γ 的差異。EWS 306 組分泌的 IFN-γ 為 ( 118.3±3.6 ) 個點明顯高于 EWS 401 組( 35.1±1.0 ) 個和 EWS 289 組 ( 34.2±0.9 ) 個，對照組為 ( 5.0±0.1 ) 個。EWS 306 組同其它三組比較，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0. 05 ) ( 圖 2 )。

四、腫瘤生長抑制

EWS 306 組腫瘤的體積 ( 978.9±28.2 ) mm3明顯小于陰性對照組 ( 1992.9±16.1 ) mm3和空白對照組( 2001.9±12.3 ) mm3，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 ) ( 圖 3a )。接種后第 35 天，空白對照組存活率為0%，陰性對照組為 10%，EWS 306 組為 80%；接種后第 40 天，空白對照組和陰性對照組均為 0%，EWS 306 組為 80%。無論是接種后第 35 天，還是接種后第 40 天，EWS 306 組同陰性對照組和空白對照組比較，腫瘤因受到抑制而生長明顯減慢，其存活率得以提高，且存活時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義 ( P＜0.05 ) ( 圖 3b )。

圖1 不同表位肽免疫激活 CTL 的殺傷效應Fig.1 Immune activation of lethal effects of CTLs by different epitope peptides注：a代表 EWS 306 與其它各組比較 ( P ＜ 0.05 )；b代表 EWS 289 與其它各組比較 ( P ＜ 0.05 )；c代表 EWS 401 與其它各組比較 ( P ＜ 0.05 )Note：aReferred to the comparison between EWS 306 group and the other groups ( P＜0.05 );bReferred to the comparison between EWS 289 group and the other groups ( P＜0.05 );cReferred to the comparison between EWS 401 group and the other groups ( P＜0.05 )

圖2 a不同表位肽沖擊 DC 疫苗刺激效應細胞 IFN-γ 釋放的影響Fig.2aIFN-γ releasing of effector cells induced by DC vaccines of different epitope peptides注：a代表 EWS 306 與其它各組比較 ( P ＜ 0.05 )Note：aReferred to the comparison between EWS 306 group and the other groups ( P＜0.05 )

討 論

尤文肉瘤好發(fā)于 20 歲以下青少年，95% 以上的尤文肉瘤具有特異性的染色體易位 t ( 11；22 ) ( q24；q12 )，由 22 號染色體 EWS 基因 5’ 氨基末端與 11 號染色體 FLI1 基因 3’ 羧基末端融合從而形成一種新的融合基因 EWS-FLI1，并表達融合蛋白EWS-FLI1。EWS-FLI1 是尤文肉瘤發(fā)生、發(fā)展的關鍵，是診斷和預后的標志物，同時也治療尤文肉瘤的理想的靶點[14-16]。本研究選用 A673 細胞系，其具有尤文肉瘤特有的特征，即染色體易位 t ( 11；22 )和融合基因 EWS-FLI1 的表達。

圖3 EWS 306 表位肽抑制腫瘤生長情況 a：腫瘤生長情況；b：荷瘤小鼠的存活率Fig.3 Tumor growth inhibited by EWS 306 a: Tumor growth; b: Survival rates of tumor-burdened mice

免疫疫苗對尤文肉瘤細胞的殺傷效應產生的機理是由表位肽刺激、活化 CTL 產生的效應[17-19]。樹突細胞是目前已知的體內功能最強大的抗原呈遞細胞，也是公認最具有潛力的免疫疫苗。然而，在應用過程中發(fā)現免疫效果欠佳[20]。這可能和很多因素有關，如傳代過程中腫瘤抗原的丟失、MHC 表達的減少等[21-23]。因此，研究表位肽結構對樹突疫苗的免疫治療效果有重要的意義。在本研究中首先綜合運用 BIMAS、SYFPEITHI 對 EWS-FLI1 蛋白進行HLA-A / 0201 限制性細胞毒性 T 淋巴細胞表位進行篩選，通過親和力實驗檢測出 QLWQFLLEL ( EWS 306 )，ILGPTSSRL ( EWS 289 ) 和 SMYKYPSDI ( EWS 401 ) 表位肽與 HLA-A / 0201 結合較好。

我們通過 4 h51Cr 釋放實驗和 IFN-γ 釋放實驗對每一個表位肽進行檢測。結果發(fā)現，EWS 306 的特異性殺傷率最高，并且能夠明顯提高 IFN-γ 的釋放量，增強了機體的非特異性抗腫瘤能力。本研究通過體外實驗表明 EWS 306 表位在體外細胞試驗中具有較強免疫原性和抗腫瘤的作用；通過動物試驗發(fā)現，EWS 306 肽沖擊樹突疫苗能夠有效阻止腫瘤的生長和提高小鼠的生存期。

總之，EWS 306 是一個重要的表位肽，具有較強激活 CTLs 的潛力，能夠有效殺死腫瘤細胞，為我們研究尤文氏肉瘤的免疫治療提供了新思路和新方法。

[1]Kilic-Eren M, Boylu T, Tabor V. Targeting PI3K/Akt represses Hypoxia inducible factor-1α activation and sensitizes Rhabdomyosarcoma and Ewing’s sarcoma cells for apoptosis. Cancer Cell Int, 2013, 13:36.doi:10.1186/1475-2867-13-36.

[2]Morris P, Dickman PS, Seidel MJ. Ewing’s sarcoma/primitive neuroectodermal tumor of the proximal humeral epiphysis. Orthopedics, 2013, 36(1):113-116.

[3]Pirker-Frühauf UM, Friesenbichler J, Urban EC, et al. Osteoporosis in children and young adults: a late effect after chemotherapy for bone sarcoma. Clin Orthop Relat Res, 2012, 470(10):2874-2885.

[4]Hong AM, Millington S, Ahern V, et al. Limb preservation surgery with extracorporeal irradiation in the management of malignant bone tumor: the oncological outcomes of 101 patients. Ann Oncol, 2013, 24(10):2676-2680.

[5]Zhu Q, Zhang J, Xiao J. Primary dumbbell-shaped Ewing’s sarcoma of the cervical vertebra in adults: Four case reports and literature review. Oncol Lett, 2012, 3(3):721-725.

[6]Tural D, Molinas Mandel N, Dervisoglu S, et al. Extraskeletal Ewing’s sarcoma family of tumors in adults: prognostic factors and clinical outcome. Jpn J Clin Oncol, 2012, 42(5):420-426.

[7]Pahl JH, Ruslan SE, Buddingh EP, et al. Anti-EGFR antibody cetuximab enhances the cytolytic activity of natural killer cells toward osteosarcoma. Clin Cancer Res, 2012, 18(2):432-441.

[8]Ahn YO, Weigel B, Verneris MR. Killing the killer: natural killer cells to treat Ewing’s sarcoma. Clin Cancer Res, 2010, 16(15):3819-3821.

[9]Mackall CL, Rhee EH, Read EJ, et al. A pilot study of consolidative immunotherapy in patients with high-risk pediatric sarcomas. Clin Cancer Res, 2008, 14(15):4850-4858.

[10]郭義, 郭衛(wèi), 湯小東, 等. 尤文肉瘤基因免疫治療的研究. 中華實驗外科雜志, 2004, 21(7):848-851.

[11]曹凱, 黃路, 林治華, 等. 分子模擬用于尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白HLA-A2.1限制性CTL表位的篩選. 化學學報, 2010, 68(13):1277-1284.

[12]Parker KC, Bednarek MA, Coligan JE. Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J Immunol, 1994, 152(1):163-175.

[13]Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, et al. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics, 1999, 50(3-4):213-219.

[14]Huang L, Kuwahara I, Matsumoto K. EWS represses cofilin 1 expression by inducing nuclear retention of cofilin 1 mRNA. Oncogene, 2014, 33(23):2995-3003.

[15]Gascoyne DM, Dunne J, Behjati S, et al. EWS/ETS proteins promote expression and regulate function of the homeodomain transcription factor BRN3A. Oncogene, 2010, 29(21): 3134-3145.

[16]Nagano A, Ohno T, Shimizu K, et al. EWS/Fli-1 chimeric fusion gene upregulates vascular endothelial growth factor-A. Int J Cancer, 2010, 126(12):2790-2798.

[17]Gerdemann U, Katari U, Christin AS, et al. Cytotoxic T lymphocytes simultaneously targeting multiple tumorassociated antigens to treat EBV negative lymphoma. Mol Ther, 2011, 19(12):2258-2268.

[18]Imai K, Hirata S, Irie A, et al. Identification of HLA-A2-restricted CTL epitopes of a novel tumour-associated antigen, KIF20A,overexpressed in pancreatic cancer. Br J Cancer, 2011, 104(2):300-307.

[19]Murao A, Oka Y, Tsuboi A, et al. High frequencies of less differentiated and more proliferative WT1-specific CD8+ T cells in bone marrow in tumor-bearing patients: an important role of bone marrow as a secondary lymphoid organ. Cancer Sci, 2010, 101(4):848-854.

[20]Kiessling A, Wehner R, Füssel S, et al. Tumor-associated antigens for specific immunotherapy of prostate cancer. Cancers (Basel), 2012, 4(1):193-217.

[21]Bhargava A, Mishra D, Banerjee S, et al. Engineered dendritic cells for gastrointestinal tumor immunotherapy: opportunities in translational research. J Drug Target, 2013, 21(2):126-136.

[22]Palma M, Hansson L, Choudhury A, et al. Vaccination with dendritic cells loaded with tumor apoptotic bodies (Apo-DC) in patients with chronic lymphocytic leukemia: effects of various adjuvants and definition of immune response criteria. Cancer Immunol Immunother, 2012, 61(6):865-879.

[23]Bray SM, Vujanovic L, Butterfield LH. Dendritic cell-based vaccines positively impact natural killer and regulatory T cells in hepatocellular carcinoma patients. Clin Dev Immunol, 2011, 2011:249281.doi:10.1155/2011/249281.

( 本文編輯：代琴 )

Antitumor immune response induced by three kinds of human leukocyte antigen-antigen / 0201-restricted epitope peptides in Ewing’s sarcoma dendritic cell vaccine

PENG Wei, HUANG Xun-wu, ZHAO Wei-peng, ZHAO Ming, YANG Da-zhi. Department of Orthopedics, the 309th Hospital of CPLA, Beijing, 100091, PRC

ObjectiveTo compare the antitumor effects of Ewing’s sarcoma protein ( EWS ) 306, EWS 289 and EWS 401 of human leukocyte antigen ( HLA )-antigen ( A ) / 0201-restricted epitope peptides against dendritic cells ( DCs ) of Ewing’s sarcoma.MethodsThe peptide 9 of EWS / FLI-1 protein, which was easily combined with HLA-A / 0201 of human cell antigen was screened by Operating software of BIMAS and SYFPEITHI. And then the corresponding epitope peptide was generated. The standard 4 h-51Cr release experiment was used to test the lethal effects of cytotoxic T lymphocytes ( CTLs ) against tumor cells. Enzyme linked immunospot assay ( ELISPOT ) was applied to detect the interferon-γ ( IFN-γ ) releasing of effector cells induced by DC vaccines of epitope peptides. Accordingly, the antitumor effects in vitro were compared in an animal experiment, and all these animals received immunotherapy.ResultsA strong binding force with HLA-A / 0201 was noticed in the screened EWS 306, EWS 289 and EWS 401, and the generated epitope peptides were QLWQFLLEL ( EWS 306 ), ILGPTSSRL ( EWS 289 ) and SMYKYPSDI ( EWS 401 ) respectively. A high lethality was noticed in EWS 306, EWS 289 and EWS 401 groups. When the effector /target cell ratio was 50 : 1, the lethalities in EWS 306, EWS 289 and EWS 401 groups were ( 20.2±1.8 ) %, ( 12.6±0.3 ) % and ( 11.9±0.2 ) % respectively. And while in the control group, the lethality was ( 6.7±0.1 ) %. When the effector / target cell ratio was 100:1, the lethalities in EWS 306, EWS 289, EWS 401 and the control groups were ( 51.2±3.7 ) %, ( 24.6±2.1 ) %, ( 17.8±0.9 ) % and ( 7.2±0.2 ) % respectively. There were statistically signifcant differences when the lethality between the EWS 306 group and the others was compared ( P＜0.05 ). The number of secreted IFN-γ in EWS 306 group was 118.3±3.6, which was obviously higher than 35.1±1.0 in EWS 401 group, 34.2±0.9 in EWS 289 group and 5.0±0.1 in the control group ( P＜0.05 ). The tumor volume was ( 978.9±28.2 ) mm3in EWS 306 group, which was obviously smaller than ( 1992.9±16.1 ) mm3in the negative control group and ( 2001.9±12.3 ) mm3in the blank control group. At the 35 day after inoculation, the survival rate in EWS 306 group was 80%, which was higher than 0% in the blank control group and 10% in the negative control group ( P＜0.05 ). At 40 day after inoculation, the survival rate in the blank control group was reduced to 0%, and 80% in EWS 306 group was obviously higher than that of the other control groups ( P＜0.05 ).ConclusionsStronger antitumor effects against DCs are noticed in EWS 306 when compared with that of EWS 289 and EWS 401. EWS 306 can effectively activate the lethal effects of CTLs against tumor cells and provide a new direction for the immunotherapy for Ewing's sarcoma.

Peptides; Drug screening assays, antitumor; Antineoplastic agents; Restrictive epitope peptide; Ewing's sarcoma

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.10.015

R738.1

國家自然科學基金 ( 81472183 )

100091 北京，解放軍第 309 醫(yī)院全軍骨科中心 ( 彭偉，黃迅悟，趙銘 )；300060 天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院( 趙偉鵬 )；400014 重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院重點實驗室 ( 楊大志 )

黃迅悟，Email: hxw309@163.com

2014-07-25 )