華蟾素和順鉑對(duì)骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞聯(lián)合殺傷作用的研究

宋科官 張濤 嚴(yán)峰 孫遠(yuǎn)新 王海 周永飛

華蟾素和順鉑對(duì)骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞聯(lián)合殺傷作用的研究

宋科官 張濤 嚴(yán)峰 孫遠(yuǎn)新 王海 周永飛

目的探討比較華蟾素 ( cinobufagin ) 協(xié)同順鉑 ( cisplatin ) 對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株 MG-63 的殺傷作用。方法體外培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞株 MG-63 細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；采用 MTT 比色法測(cè)定MG-63 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用并計(jì)算細(xì)胞抑制率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡率和細(xì)胞周期，觀察細(xì)胞凋亡率的變化情況和藥物對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用；原位末端標(biāo)記法 ( TUNEL ) 觀察骨肉瘤細(xì)胞的凋亡情況并檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；相差顯微鏡觀察骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及形態(tài)學(xué)上的改變。結(jié)果華蟾素和順鉑均對(duì)骨肉瘤細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用，華蟾素組、順鉑組及華蟾素＋順鉑組在藥物濃度不同時(shí)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用各不相同，在藥物濃度低于 80 μg / ml 時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用隨藥物濃度的增加而上升；當(dāng)藥物濃度達(dá)到 80 μg / ml 時(shí)，華蟾素組和順鉑組藥物對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用不再增加，但華蟾素＋順鉑組藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用在藥物濃度達(dá)到 160 μg / ml 時(shí)，抑制作用仍強(qiáng)于其濃度為 80 μg / ml 時(shí)。各實(shí)驗(yàn)組在藥物濃度相同時(shí)華蟾素＋順鉑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用華蟾素或者順鉑。結(jié)論華蟾素＋順鉑對(duì)骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞的聯(lián)合殺傷作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用順鉑或者華蟾素；在抑制骨肉瘤 MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)方面，華蟾素協(xié)同順鉑對(duì)細(xì)胞的殺傷作用效果顯著，并且具有時(shí)間和濃度依賴性。

骨肉瘤；順鉑；細(xì)胞凋亡；骨腫瘤

華蟾素系傳統(tǒng)中藥中華大蟾蜍皮的水制劑，其主要成分為吲哚生物堿、還原糖、氨基酸以及蟾蜍毒素等。華蟾素具有清熱解毒，利水消腫，化瘀潰堅(jiān)等作用，已列為國(guó)家級(jí)的中藥保護(hù)品種。近年來(lái)隨著對(duì)華蟾素的藥理作用和臨床應(yīng)用的深入研究，已證實(shí)華蟾素具有強(qiáng)心 、抗腫瘤、抗病毒、麻醉、止痛、促進(jìn)骨髓增生等作用，并可調(diào)節(jié)腫瘤患者的細(xì)胞免疫和體液免疫功能[1]。華蟾素作為抗腫瘤中藥制劑，在腫瘤治療方面應(yīng)用很廣，對(duì)肝癌[2]、胃癌[3]、肺癌[4]等多種腫瘤都有一定的治療作用[5-6]。毒理試驗(yàn)及臨床實(shí)踐證明其具有毒副作用小、使用安全可靠等優(yōu)點(diǎn)。本研究主要通過(guò)體外培養(yǎng)骨肉瘤MG-63 細(xì)胞，分別將不同濃度的順鉑和華蟾素作用于該細(xì)胞株，并將二者協(xié)同對(duì) MG-63 細(xì)胞的殺傷作用的效果同單獨(dú)應(yīng)用華蟾素或順鉑的效果作比較，為華蟾素在骨肉瘤化療中的應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

材料與方法

一、材料

小牛血清 ( 杭州四季青生物工程材料研究所 )、二甲基亞砜 ( DMSO ) ( 江蘇洪聲化工廠 )、RPMI 1640培養(yǎng)粉 ( GIBCOBRL 公司 )、MTT ( 美國(guó) Sigma 公司 )、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 ( 碧云天生物科技研究所 )、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒 ( 碧云天生物科技研究所 )、Tunel 試劑盒 ( 普利來(lái)生物工程材料研究所 )、華蟾素注射液 [ 安徽金蟾藥業(yè)公司，皖衛(wèi)藥準(zhǔn)字 ( 1996 )，第 201597 號(hào)，藥物批號(hào)：9803031 ]、順鉑注射液 ( 江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司 )、流式細(xì)胞儀 ( 美國(guó) Becton Dickinson 公司 )。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：將 MG-63 骨肉瘤細(xì)胞株 ( 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室李呼倫教授提供 )，培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液中，置37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2. 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：相差顯微鏡下觀察分別由華蟾素＋順鉑、華蟾素及順鉑作用后的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及形態(tài)學(xué)上的改變。

3. MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 MG-63 細(xì)胞，制備細(xì)胞數(shù)為 4×104個(gè) / ml的細(xì)胞懸液，設(shè)華蟾素組、順鉑組、華蟾素＋順鉑組及空白對(duì)照組，接種于 96 孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 200 μl，每組 5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜。于第 2 天上午分別加入 100 μl 含不同濃度的華蟾素、順鉑、華蟾素＋順鉑 ( 20 μg / ml，40 μg / ml，80 μg / ml，160 μg / ml ) 及生理鹽水，在加入藥物后 48 h 后終止培養(yǎng)。各孔加入濃度為 5 mg / ml 的 MTT 20 μl 并繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，之后加入二甲基亞砜 ( DMSO ) 150 μl，37 ℃ 下避光置于搖床低速振蕩 15 min，使結(jié)晶充分溶解。將 96 孔板放入酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中，以空白孔調(diào)零，測(cè)各孔 OD 490 nm 的吸光度值 ( A490 )。計(jì)算細(xì)胞抑制率：抑制率＝ ( 1 一實(shí)驗(yàn)孔測(cè)定 A 值 / 對(duì)照孔測(cè)定 A 值 ) ×100%。

4. Annexin V-FITC 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：將 MG-63骨肉瘤細(xì)胞濃度調(diào)整至 5×105個(gè) / ml，用普通細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，各個(gè)培養(yǎng)瓶中加入 1 ml 細(xì)胞懸液，并設(shè)華蟾素組、順鉑組、華蟾素＋順鉑組及空白對(duì)照組。細(xì)胞貼壁蓋度達(dá) 50% 左右時(shí)進(jìn)行藥物處理，分別在藥物處理 12、24、48、96 h 后終止培養(yǎng)，收集對(duì)照組和處理組細(xì)胞。取 10～50 萬(wàn)重懸的細(xì)胞液，1500 r / min 離心 5 min，離心半徑 16 cm，棄上清，用 195 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液懸浮細(xì)胞，加入 5 μl Annexin V-FITC，輕輕搖勻后于 20～25 ℃ 避光條件下孵育 10 min。再將細(xì)胞液 1500 r / min 離心5 min，離心半徑 16 cm，棄上清，加入 190 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液懸浮細(xì)胞，之后加入 10 μl 碘化丙啶染色液，冰浴避光放置，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。計(jì)算并對(duì)比細(xì)胞凋亡率。

5. 細(xì)胞周期檢測(cè)：將 MG-63 細(xì)胞以 5×105個(gè) / ml 的濃度接種于 24 孔板中，每孔 100 μl 細(xì)胞懸液，并分為華蟾素組、順鉑組、華蟾素＋順鉑組及空白對(duì)照組。置 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組換上新鮮培養(yǎng)液，處理組換上濃度為 80 μg / ml 的華蟾素、順鉑、華蟾素＋順鉑培養(yǎng)液。分別繼續(xù)培養(yǎng) 6、12、24、48 h 后，收集對(duì)照組和處理組細(xì)胞。分別用 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，再將細(xì)胞重懸于 75% 冰凍乙醇中 -20 ℃ 固定 1 h。之后用冷 PBS 洗滌細(xì)胞 1 次，再用 200～500 μl 冷PBS 重懸細(xì)胞，加入 RNase A 溶液 20 μl，37 ℃ 水浴 30 min，200 目篩網(wǎng)過(guò)濾，加入 400 μl 碘化丙啶( PI ) 染液，輕輕混勻后 4 ℃ 避光孵育 10～30 min。隨即流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布，最大激發(fā)波長(zhǎng)為 488 nm。

6. 原位末端標(biāo)記法 ( TUNEL ) 觀察骨肉瘤細(xì)胞凋亡：將 MG-63 骨肉瘤細(xì)胞數(shù)調(diào)整至 5×105個(gè) / ml，分別用華蟾素、順鉑及華蟾素＋順鉑 ( 濃度均為160 μg / ml ) 及生理鹽水作用于骨肉瘤 MG-63 細(xì)胞，并分別于 12、24、48、96 h 后取樣，染色步驟按Tunel 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。光鏡下觀察細(xì)胞染色呈棕褐色者為凋亡細(xì)胞，隨機(jī)選擇 5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)至少800 個(gè)細(xì)胞，觀察單位面積內(nèi)細(xì)胞凋亡情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1. 相差顯微鏡下觀察對(duì)照組細(xì)胞及藥物作用：48 h 后不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及形態(tài)學(xué)的改變。對(duì)照組：細(xì)胞形態(tài)呈梭形，細(xì)胞核呈圓形，細(xì)胞曾單層貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)良好 (圖1A )；華蟾素＋順鉑組：細(xì)胞大部分變小，變圓，染色質(zhì)固縮且較多細(xì)胞發(fā)生死亡 (圖1B )；順鉑組可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變形，呈不規(guī)則狀，部分細(xì)胞脫壁發(fā)生死亡 (圖1C )；華蟾素組可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)改變較順鉑組類似，但死亡細(xì)胞的數(shù)量少于順鉑組 (圖1D )。

2. MTT 檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用：較空白對(duì)照組比較，華蟾素和順鉑均對(duì)骨肉瘤 MG-63細(xì)胞具有抑制作用，順鉑的抑制作用較華蟾素強(qiáng)；華蟾素＋順鉑對(duì)細(xì)胞抑制作用明顯強(qiáng)于華蟾素或順鉑。不同濃度藥物的抑制作用各不相同，在藥物濃度低于 80 μg / ml 時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組的抑制作用隨藥物濃度的上升而抑制作用增加，在藥物濃度達(dá)到 80 μg / ml，華蟾素和順鉑的抑制作用不再增加，但華蟾素＋順鉑組的抑制作用在藥物濃度為 160 μg / ml時(shí)，其抑制作用仍強(qiáng)于 80 μg / ml (表1～3 )。

表1 不同濃度華蟾素作用于 MG-63 細(xì)胞 48 h 后的 A 值和抑制率 (±s )Tab.1 A values and inhibitory rates of cinobufagin- at various concentrations on MG-63 cells 48hr after the treatment (±s )

華蟾素 μg/ml A490 抑制率 ( % ) 0 0.738±0.012 0 20 0.531±0.016 30±2.22 40 0.352±0.013 51±1.81 80 0.283±0.009 59±1.25 160 0.275±0.006 63±0.84

表2 不同濃度順鉑作用于 MG-63 細(xì)胞 48 h 后的 A 值和抑制率(±s )Tab.2 A values and inhibitory rates of cisplatin- at various concentrations on MG-63 cells 48hr after the treatment (±s )

順鉑組 μg/ml A490 抑制率 ( % ) 0 0.742±0.013 0 20 0.529±0.008 32±1.11 40 0.288±0.007 58±0.97 80 0.206±0.012 72±1.66 160 0.185±0.009 74±1.25

表3 不同濃-度華蟾素 + 順鉑作用于 MG-63 細(xì)胞 48 h 后的 A 值和抑制率 (±s )Tab.3 A values and inhibitory rates of cinobufagin + cisplatin at various concentrations on MG-63 cells 48hr after the treatment (±s )

表3 不同濃-度華蟾素 + 順鉑作用于 MG-63 細(xì)胞 48 h 后的 A 值和抑制率 (±s )Tab.3 A values and inhibitory rates of cinobufagin + cisplatin at various concentrations on MG-63 cells 48hr after the treatment (±s )

華蟾素＋順鉑組 μg/ml A490 抑制率 ( % ) 0 0.740±0.007 0 20 0.524±0.007 35±0.97 40 0.216±0.006 68±0.84 80 0.113±0.014 82±1.93 160 0.098±0.009 89±1.25

3. 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率變化情況：將華蟾素組、順鉑組、華蟾素＋順鉑組 ( 濃度均為 80 μg / ml ) 及空白對(duì)照組進(jìn)行比較，觀察在不同時(shí)間點(diǎn) MG-63 細(xì)胞株的凋亡情況。華蟾素組和順鉑組在 12、24、48、96 h，細(xì)胞凋亡率均高于空白對(duì)照組；華蟾素＋順鉑組的作用效果在12 h 時(shí)，并不強(qiáng)于華蟾素或順鉑組；在 24 h 時(shí)華蟾素＋順鉑組作用效果強(qiáng)于華蟾素或順鉑組 ( P＝0.03 )；在 48、96 h 時(shí)華蟾素＋順鉑組的效果明顯強(qiáng)于空白對(duì)照組 ( P＝0.00 ) (表4 )。

4. 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期：將華蟾素組、順鉑組、華蟾素＋順鉑組 ( 濃度均為 80 μg / ml ) 及空白對(duì)照組進(jìn)行比較，觀察在 6、12、24、48 h 等不同時(shí)間后細(xì)胞周期阻滯與凋亡的關(guān)系。流式細(xì)胞儀分析表明 80 μg / ml 的華蟾素與 MG-63 細(xì)胞株共培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞周期的 S 期有抑制作用，與空白對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＝0.000 )；順鉑對(duì)細(xì)胞抑制作用發(fā)生在 G0/ G1期，其抑制率較空白對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＝0.000 )；而華蟾素＋順鉑共同作用下的 MG-63 細(xì)胞在 G0/ G1、S 期均受抑制，其中 G0/ G1期抑制作用較空白對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＝0.001 )，S 期抑制作用較空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＝0.011 ) (表5 )。

5. 原位末端標(biāo)記法 ( TUNEL ) 檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞凋亡率：光鏡下 ( Tunel×200 ) 用數(shù)字法隨機(jī)選擇 5 個(gè)視野進(jìn)觀察細(xì)胞凋亡情況，其中凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被染成為深棕色，陰性細(xì)胞則為淡綠色。將 MG-63骨肉瘤細(xì)胞分別用 160 μg / ml 濃度的華蟾素、順鉑及華蟾素＋順鉑進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò) 96 h 后，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的數(shù)量 ( 深棕色細(xì)胞 ) 隨時(shí)間變化而出現(xiàn)不同。三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞數(shù)量均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。在 12 h 時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)少量凋亡，但視野下的細(xì)胞仍以陰性細(xì)胞為主，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞的數(shù)量并沒(méi)有明顯的差異。在 48 h 時(shí)，華蟾素＋順鉑組細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增多，凋亡率達(dá)到＞56%，其余兩實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡數(shù)量亦出現(xiàn)較多，但其凋亡分別為 41%、36%。在 96 h 時(shí)，華蟾素＋順鉑組的細(xì)胞基本全部凋亡 ( 凋亡率為 96% )，細(xì)胞核全部染成深棕色，視野下未見(jiàn)淡綠色的陰性細(xì)胞，而其余兩組仍可見(jiàn)部分陰性細(xì)胞被染成淡綠色，其凋亡率分別為 86% ( 順鉑組 )、80% ( 華蟾素組 ) (圖2 )。

討 論

圖2 TUNEL 法分別檢測(cè)華蟾素和順鉑作用下 12、24、48、96 h 各個(gè)時(shí)間點(diǎn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡情況 A～D：為華蟾素 + 順鉑；E～H：分別為順鉑；I～L：為華蟾素；M～P：為陰性對(duì)照組 ( Tunel ×200 )Fig.2 The osteosarcoma apoptosis under the effects of cinobufagin and cisplatin were detected by TUNEL at 12, 24 48 and 96 hr A-D: Showed the effects of cinobufagin + cisplatin; E-H: Showed the effects of cisplatin; I-L: Showed the effects of cinobufagin; M-P: Was the negative control group ( Tunel ×200 )

骨肉瘤是最常見(jiàn)的骨骼系統(tǒng)惡性腫瘤之一，易發(fā)于青少年，不僅惡性程度高，而且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移早。盡管早期手術(shù)治療結(jié)合新的輔助化療已很大程度提高患者的 5 年生存 ( 50%～65% )，但目前仍有20%～40% 的患者死于骨肉瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。對(duì)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前化療是唯一有效的方法[7-8]。目前臨床上主要的化療藥物有順鉑、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺、阿霉素等，但這些藥物均存在一定的副作用，長(zhǎng)期化療對(duì)患者機(jī)體造成較大的傷害。此外，這些化療藥物還具有耐藥性的特點(diǎn)。因此，尋找一種新的藥物，其能夠協(xié)助或者替代這些化療藥物促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，以減少化療藥物的使用時(shí)間和使用劑量，從而提高骨肉瘤患者的長(zhǎng)期生存率顯得尤為重要。

表4 華蟾素和順鉑在不同時(shí)間點(diǎn)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率 ( %,±s, n = 4 )Tab.4 Apoptosis rates caused by cinobufagin and cisplatin at different time points ( %,±s, n=4 )

分組 凋亡率12 h 24 h 48 h 96 h空白組 12.21±0.63 15.21±0.56 16.24±0.78 14.25±0.56順鉑 23.61±1.73 36.09±1.21 44.91±1.62 35.32±1.23華蟾素 25.21±0.23 30.22±0.56 31.24±1.53 24.26±1.23華蟾素+順鉑 27.32±0.56 41.54±0.89 58.59±1.24 51.32±0.51

表5 華蟾素和順鉑在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì) MG-63 細(xì)胞周期的影響(±s )Tab.5 Effects of cinobu-fagin and cisplatin on the MG-63 cell cycle at different time points (±s )

表5 華蟾素和順鉑在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì) MG-63 細(xì)胞周期的影響(±s )Tab.5 Effects of cinobu-fagin and cisplatin on the MG-63 cell cycle at different time points (±s )

分組 細(xì)胞周期G0/ G1phage ( % ) G2/ M phage ( % ) S phage ( % )空白組 60.29±0.54 33.20±0.68 6.51±0.97順鉑 80.54±0.32 13.21±0.56 6.25±0.94華蟾素 52.12±0.17 7.38±0.17 40.50±0.98華蟾素+順鉑 80.42±1.25 4.26±2.13 15.32±0.56

華蟾素作為抗腫瘤中藥制劑，在腫瘤治療方面應(yīng)用很廣，對(duì)肝癌[2]、胃癌[3]、肺癌[4]等多種腫瘤都有一定的治療作用[5-6]。此外，相關(guān)毒理研究還證實(shí)其具有副作用小，使用安全的特點(diǎn)。在應(yīng)用華蟾素治療骨肉瘤的研究方面，相關(guān)研究較少，目前有研究[9]證實(shí)華蟾素能夠?qū)?MG-63 細(xì)胞阻斷在 S 期，從而誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。本研究首先通過(guò) MTT檢測(cè)法發(fā)現(xiàn)，華蟾素抑制骨肉瘤細(xì)胞的作用弱于順鉑，但其對(duì)順鉑具有共同抑制骨肉瘤細(xì)胞的作用，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性；華蟾素＋順鉑的共同作用效果明顯強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用華蟾素或者順鉑。因此，在順鉑藥物濃度相同的情況下，添加華蟾素可達(dá)到更佳的腫瘤抑制效果。此外，我們推測(cè)在華蟾素共同作用的條件下，亦可適當(dāng)減少順鉑的藥物濃度而達(dá)到相同的臨床化療效果，從而減少順鉑的毒副作用，但這需要進(jìn)一步的相關(guān)毒理研究。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)，在順鉑、華蟾素藥物濃度達(dá)到 80 μg / ml，華蟾素和順鉑對(duì) MG-63 細(xì)胞的抑制作用不再增加，但華蟾素＋順鉑組的抑制作用在藥物濃度為 160 μg / ml 時(shí)，其抑制作用仍強(qiáng)于80 μg / ml。因此，在順鉑藥物濃度達(dá)到一定的情況下，其化療效果不再增加，而在這種情況下，加入華蟾素能使其化療效果在其原有的基礎(chǔ)上繼續(xù)上升。這就可能為順鉑的耐藥性問(wèn)題提供一定的解決方法，但二者相互作用下毒性作用是否增加仍有待于進(jìn)一步研究。

細(xì)胞凋亡 ( apoptosis ) 是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有很大關(guān)系，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤治療有重要意義。有研究表明華蟾素對(duì) HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過(guò) Bcl-2 和 PKC 途徑[10-11]，該機(jī)制可能與誘導(dǎo) p53 基因介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡有關(guān)[12]。盛秀勝等[13]研究認(rèn)為，華蟾素能提高 Caspase-3 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)白血病細(xì)胞 K562的凋亡，提示華蟾素可能通過(guò)改變凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。本研究通過(guò)原位末端標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)華蟾素、順鉑及華蟾素＋順鉑作用下的細(xì)胞其凋亡率均隨著時(shí)間的增加而升高，在 24 h 前，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率沒(méi)有明顯的差異，而在 48 h 后，華蟾素＋順鉑組細(xì)胞凋亡率明顯高于順鉑、華蟾素組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義。此外，我們通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)法亦證實(shí)了華蟾素＋順鉑、順鉑、華蟾素促 MG-63 細(xì)胞的凋亡作用均具有時(shí)間依賴性，并且在 24 h 時(shí)，較其它各實(shí)驗(yàn)組比較，華蟾素＋順鉑組的細(xì)胞凋亡率已有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在 48、96 h 時(shí)，結(jié)果有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，順鉑、華蟾素及華蟾素＋順鉑促骨肉瘤細(xì)胞的凋亡作用均有時(shí)間依賴性，但華蟾素＋順鉑促骨肉瘤細(xì)胞的凋亡作用隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)的幅度明顯高于華蟾素或者順鉑，這也證實(shí)了華蟾素具有協(xié)同順鉑促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，華蟾素作為一種中藥制劑，其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用，其效果次于順鉑。但如將華蟾素結(jié)合順鉑共同作用于骨肉瘤細(xì)胞，其抑制作用明顯增強(qiáng)，效果明顯優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用華蟾素或者順鉑，其抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。因此，我們認(rèn)為華蟾素可作為一種化療藥物的輔助治療藥物，能夠和順鉑起共同抑制骨肉瘤細(xì)胞的作用，從而增強(qiáng)其抗腫瘤效果。

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( 本文編輯：王永剛 )

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A study of combined killing effects of cinobufagin and cisplatin on osteosarcoma MG-63 cells

SONG Ke-guan, ZHANG Tao, YAN Feng, SUN Yuan-xin, WANG Hai, ZHOU Yong-fei. Department of Orthopedics, the frst Affliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin, Heilongjiang, 150001, PRC

ObjectiveTo investigate and compare killing effects of cinobufagin and cisplatin on human osteosarcoma MG-63 cell lines.MethodsOsteosarcoma MG-63 cell lines were cultured in vitro, and logarithmic growth phase cells were selected for experiments. The methyl thiazolyl tetrazolium ( MTT ) colorimetry assay was used to determine the growth inhibitory effects on MG-63 cells and to calculate the cell inhibitory rate. The flow cytometry was used to detect the apoptosis rate and cell cycle of osteosarcoma cells, and to observe the changes of cell apoptosis rates and the inhibitory effects of drugs on cell cycles. The in situ terminal deoxynucleotidyl transferase ( TdT ) - mediated dUTP-X nick end labeling ( TUNEL ) was used to observe the apoptosis rate of osteosarcoma cells and to detect the cell apoptosis rate. The osteosarcoma cell growth status and morphological changes were observed by the phase contrast microscope.ResultsBoth cinobufagin and cisplatin could inhibit the growth of osteosarcoma cells. In the cinobufagin group, cisplatin group and cinobufagin + cisplatin group, the inhibitory effects on the osteosarcoma cell growth were not identical at different drug concentrations. When the drug concentration was less than 80 μg/ml, the cell growth inhibitory effects in all experimental groups would become greater with the increase of drug concentration. When the drug concentration reached 80 μg/ml, the cell growth inhibitory effects in the cinobufagin group and cisplatin group would not increase. And when the drug concentration reached 160 μg/ml, the cell growth inhibitory effects in the cinobufagin + cisplatin group were greater than the effects at the concentration of 80 μg/ml. In all experimental groups, the growth inhibitory effects of drugs at the same concentration on osteosarcoma cells in the cinobufagin + cisplatin group were greater than that in the single cinobufagin or cisplatin group.ConclusionsThe combined killing effects of cinobufagin + cisplatin on osteosarcoma MG-63 cells are obviously greater than thatof the single cisplatin or cinobufagin. In the inhibition of osteosarcoma MG-63 cell growth, the cell killing effects of cinobufagin combined with cisplatin are signifcant, with a time- and concentration- dependence.

Osteosarcoma; Cisplatin; Apoptosis; Bone neoplasms

10.3969/j.issn.2095-252X.2014.03.016

R738.1

黑龍江省教育廳資助項(xiàng)目 ( 11521165 )

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2013-04-06 )