草魚冷藏期間ATP關(guān)聯(lián)物含量及新鮮度變化

劉 焱，陳桂平，張繼紅，盧 君

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)所，湖南 長(zhǎng)沙 410002）

魚肉味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等優(yōu)點(diǎn)，營(yíng)養(yǎng)平衡性好，是人體攝取動(dòng)物蛋白質(zhì)的重要來(lái)源之一。我國(guó)淡水魚資源豐富，但生產(chǎn)季節(jié)性強(qiáng)，并且魚肉極易腐敗變質(zhì)，所以魚肉的保鮮貯藏顯得尤其重要。魚肉在貯藏過(guò)程中新鮮度會(huì)不斷降低，發(fā)生蛋白質(zhì)變性、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）降解、脂肪氧化等，魚肉風(fēng)味的損失、苦味的增加、口感品質(zhì)的降低與這些變化密切相關(guān)[1]。

ATP代謝關(guān)聯(lián)物是魚肉中重要的呈味物質(zhì)。魚在死后會(huì)發(fā)生酶催化ATP的降解反應(yīng)，依次降解為腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）、次黃嘌呤核苷（inosine，HxR）和次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）。其中，肌苷酸是一種鮮味化合物，目前已作為衡量肉質(zhì)鮮味的重要指標(biāo)，最終產(chǎn)物次黃嘌呤會(huì)產(chǎn)生苦味影響口味，而AMP有壓抑苦味的特性，是種良好的風(fēng)味增強(qiáng)劑[2-4]。目前淡水魚貯藏過(guò)程中品質(zhì)變化研究都集中于魚肉蛋白質(zhì)的變性和揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化，關(guān)于呈味核苷酸的研究很少且不完善，對(duì)草魚肉中呈味核苷酸的分析研究更是空白。因此本研究通過(guò)分析草魚冷藏期間呈味核苷酸含量的變化，結(jié)合新鮮度指標(biāo)揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量的檢測(cè)和綜合感官評(píng)價(jià)，找出草魚肉中各核苷酸的含量與其新鮮度的相關(guān)性，以期能為草魚在冷藏期間風(fēng)味品質(zhì)的保證提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮草魚兩條，2 kg左右，體長(zhǎng)約60 cm，購(gòu)于長(zhǎng)沙高橋菜市場(chǎng)。

ATP-2Na、ADP-2Na、IMP-2Na、AMP-Na、HxR、Hx標(biāo)準(zhǔn)品 德國(guó)Ruibio公司；甲醇為色譜純；高氯酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氧化鎂、硼酸、鹽酸、乙醇、甲基紅、次甲基藍(lán)（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

FSH-2A高速勻漿機(jī) 金壇市國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；TMP-510電子分析天平 湘儀天平儀器公司；LD5-2A離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；1100高效液相色譜 美國(guó)Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將新鮮的草魚去頭、尾、鱗、內(nèi)臟后，去骨采背部肉，制成魚塊置于4 ℃冰箱中保存待用。分別于冷藏后2、4、6 d取樣，進(jìn)行高效液相色譜分析和TVB-N含量檢測(cè)。

1.2.2 ATP關(guān)聯(lián)物含量的測(cè)定

1.2.2.1 草魚ATP關(guān)聯(lián)物的提取與轉(zhuǎn)化[5-8]

取新鮮草魚肉與冷藏后2、4、6 d的樣品，切碎后取10 g放入離心管，加入預(yù)冷后的5%高氯酸溶液20 mL，勻漿后預(yù)冷10 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液。沉淀用5%高氯酸洗滌重新離心取上清液。合并上清液，用NaOH飽和溶液調(diào)pH值為7.8[9]，靜置5 min后過(guò)濾至100 mL容量瓶，超純水定容后過(guò)0.45 μm待用。

1.2.2.2 ATP關(guān)聯(lián)物梯度質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制

單樣標(biāo)準(zhǔn)品（1 mg/mL）：稱取25 mg分別定容至25 mL容量瓶中定容；混合標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL）：吸取6 種單樣標(biāo)準(zhǔn)品各1 mL至10 mL容量瓶中定容；混合標(biāo)準(zhǔn)品（50、20、10、5 μg/mL）：分別吸取100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品5、2、1、0.5 mL至10 mL容量瓶中定容。

1.2.2.3 ATP關(guān)聯(lián)物的高效液相色譜檢測(cè)[5,10-12]

高效液相色譜（highper for manceliquid chromatography，HPLC）條件：色譜柱Capcellpak C18（4.6 mm×150 mm），0.05 mol/L磷酸二氫鉀-甲醇（90∶10，V/V）等度洗脫，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，流速0.8 mL/min，上樣量10 μL。通過(guò)比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時(shí)間和峰面積來(lái)確定ATP關(guān)聯(lián)物的種類和含量。

1.2.2.4 計(jì)算公式

式中：m為樣品核苷酸鈉鹽的檢測(cè)含量/（mg/kg）；M核苷酸、M核苷酸鈉鹽分別為核苷酸和核苷酸鈉鹽的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.3 TVB-N含量的測(cè)定

按GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[13]規(guī)定的方法檢測(cè)，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行，計(jì)算其平均值。

1.2.4 感官評(píng)價(jià)

參考楊文鴿等[14]的方法略作修改。感官評(píng)價(jià)以草魚肉塊的色澤、氣味、組織結(jié)構(gòu)和彈性，水煮魚塊的氣味、滋味和湯汁形態(tài)作為指標(biāo)。感官評(píng)定人員由隨機(jī)抽取15 名人員組成，分別對(duì)生魚塊和水煮魚塊6 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)定人員需在感官評(píng)定半小時(shí)前鹽水漱口。每一指標(biāo)取平均分后按生魚塊和水煮魚塊分別統(tǒng)計(jì)后再按總分10 分制計(jì)分。水煮魚塊定量25 g肉加250 mL純凈水加蓋煮沸8 min[15]。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 ATP關(guān)聯(lián)物混合標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

表1 冷藏草魚塊感官評(píng)定表Table 1 Criteria for sensory evaluation of grass carp

圖1 ATP關(guān)聯(lián)物混合標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程Fig.1 Standard curves and regression equations for ATP-related compounds

2.2 ATP關(guān)聯(lián)物混合標(biāo)準(zhǔn)品和魚肉樣品的HPLC圖譜

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品（20 μg/mL）HPLC圖譜Fig.2 HPLC pro file of mixed standards (20 μg/mL)

圖2為含有6 種標(biāo)準(zhǔn)化合物ATP-2Na、ADP-2Na、IMP-2Na、AMP-Na、HxR、Hx的高效液相色譜圖譜，出峰的先后順序?yàn)锳TP-2Na（3.580 min）、IMP-2Na（3.867 min）、ADP-2Na（4.113 min）、AMP-Na（6.066 min）、Hx（6.736 min）、HxR（7.150 min）。在本色譜條件下，ATP系列關(guān)聯(lián)物8 min內(nèi)就能得到有效分離，楊文鴿[14]、劉亞[12]等的分離時(shí)間為35 min，戚曉玉[16]、伍彬[17]等的分離時(shí)間在30 min左右?？梢妼⒉环€(wěn)定的ATP系列化合物轉(zhuǎn)化成其鈉鹽形式，不僅方便其檢測(cè)并且大大縮短了分離時(shí)間，其重現(xiàn)性效果也好。

圖3 新鮮草魚肉樣品HPLC圖譜Fig.3 HPLC pro file of ATP-related compounds from fresh grass carp meat

經(jīng)過(guò)圖3峰值計(jì)算，新鮮草魚肉中ATP含量為273.17 mg/kg、ADP含量為95.22 mg/kg、IMP含量為504.34 mg/kg、AMP含量為62.38 mg/kg、HxR含量為51.76 mg/kg、Hx含量為8.62 mg/kg。從圖3可以看出，新鮮草魚肉中IMP含量明顯高于其他關(guān)聯(lián)物。IMP的含量對(duì)肉的滋味和香味都有重要影響，是畜、禽和魚肉中的主要鮮味化合物[18-20]，新鮮草魚肉質(zhì)鮮美與高含量的IMP密切相關(guān)。

圖4 新鮮煮制草魚肉樣品HPLC圖譜Fig.4 HPLC pro file of ATP-related compounds from cooked fresh grass carp meat

由圖4經(jīng)過(guò)峰面積計(jì)算，煮制的新鮮草魚肉中ATP含量為281.62 mg/kg、ADP含量為177.68 mg/kg、IMP含量為654.35 mg/kg、AMP含量為80.99 mg/kg、HxR含量為34.44 mg/kg、Hx含量為4.84 mg/kg。煮制的新鮮草魚肉中IMP含量也明顯高于其他關(guān)聯(lián)物。與未煮制的新鮮草魚肉相比較，ATP含量稍有增加，ADP含量增加了86.60%、IMP含量增加了29.74%、AMP含量增加29.83%、HxR含量減少33.46%、Hx含量減少43.85%。經(jīng)過(guò)煮制的草魚肉中促進(jìn)風(fēng)味作用的ATP關(guān)聯(lián)物含量都有所增加，產(chǎn)生苦味的Hx含量則明顯下降，說(shuō)明加工過(guò)程可以影響魚肉風(fēng)味物質(zhì)含量的變化從而改變魚肉的口感。

2.3 草魚冷藏期間ATP關(guān)聯(lián)物含量的變化

圖5 草魚冷藏期間ATP、ADP、IMP（A）和AMP、Hx、HxR（B）含量的變化Fig.5 Changes in the levels of ATP, ADP, IMP, AMP, Hx, and HxR in grass carp meat during cold storage

從圖5可看出，冷藏過(guò)程中含量下降最快、下降幅度最大的為ATP和IMP。ATP只在新鮮的魚肉中檢測(cè)到，冷藏第2天就已檢測(cè)不出其含量。ATP含量的快速下降跟魚死后其合成受阻和高活性的ATP酶快速降解有關(guān)，并且Watabe等[21]研究認(rèn)為，在較低的貯藏溫度條件下肌漿網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的鈣吸收能力下降，肌原纖維內(nèi)鈣濃度增加，鈣離子能激活肌原纖維Mg2+-ATP酶，加速ATP的降解。在冷藏第2天，IMP從504.34 mg/kg下降到36.48 mg/kg，下降幅度達(dá)92.77%，此后一直呈緩慢下降趨勢(shì)。有研究[2]以雞肉為例，屠宰后在4 ℃保存約8 h時(shí)，IMP含量最多，此后逐漸減少，與本研究含量變化基本一致。IMP與谷氨酸鈉對(duì)鮮味有相乘效應(yīng)，混合存在時(shí)增味效果明顯增強(qiáng)。作為重要的鮮味化合物，新鮮魚肉和冷藏魚肉中IMP含量的巨大差異可以從風(fēng)味方面解釋冷藏魚肉口味為何不如新鮮魚肉。

圖5還顯示，ADP在冷藏周期內(nèi)含量先上升后下降，總體變化不大。AMP的含量一直維持在一個(gè)平穩(wěn)的水平。這都與ATP的降解有關(guān)。伍彬等[17]認(rèn)為，AMP有壓抑苦味的特性，能使食物產(chǎn)生理想的甜味和咸味，是種良好的風(fēng)味增強(qiáng)劑。圖5顯示在冷藏第2天，Hx含量從8.62 mg/kg上升84.64 mg/kg，上升幅度達(dá)到89.82%，此后一直維持較高的含量。HxR的含量則一直呈下降趨勢(shì)，從新鮮魚51.76 mg/kg一直下降到24.17 mg/kg。Hx為ATP降解途徑中的最終產(chǎn)物，前體物質(zhì)的快速降解導(dǎo)致了Hx含量的快速上升，這與魚體開始出現(xiàn)細(xì)菌腐敗分解密切相關(guān)[22-23]。Hx被認(rèn)為可導(dǎo)致食物苦味，使魚的風(fēng)味變差[24]。

2.4 草魚冷藏期間總TVB-N含量的變化

圖6 草魚冷藏期間TVB-N含量的變化Fig.6 Changes in TVB-N contents in grass carp meat during cold storage

如圖6所示，草魚冷藏過(guò)程中總TVB-N含量呈上升趨勢(shì)。新鮮時(shí)含量為5.52 mg/100 g，冷藏2 d時(shí)含量為10.32 mg/100 g，4 d時(shí)為17.24 mg/100 g，第6天為32.07 mg/100 g。TVB-N含量與魚肉蛋白質(zhì)自溶和細(xì)菌繁殖分解相關(guān)。冷藏過(guò)程中低溫有抑制酶活與細(xì)菌繁殖的作用，貯藏初期魚肉蛋白質(zhì)緩慢自溶水解。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其降解的大量產(chǎn)物為微生物的生長(zhǎng)提供了天然的培養(yǎng)基，細(xì)菌開始大量繁殖，使氨基酸脫羧基或氨基生成胺類、氨氣等異味物質(zhì)。因此冷藏6 d時(shí)，魚肉在內(nèi)外環(huán)境的作用下產(chǎn)生大量TVB-N。魚類TVB-N的量達(dá)到30 mg/100 g時(shí)[20]，即被認(rèn)為是變質(zhì)的標(biāo)志，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以認(rèn)為魚肉的冷藏周期在6 d以內(nèi)。

2.5 草魚冷藏期間的感官評(píng)定

圖7 冷藏期間生魚肉（A）和熟魚肉（B）感官評(píng)定Fig.7 Sensory evaluation of raw grass carp (A) and cooked grass carp meat (B) during cold storage

從圖7A可以看出，生魚肉在冷藏2 d后較新鮮魚感官有所下降，在冷藏2～4 d感官變化不太明顯，但在第4天后呈明顯下降。從圖7B可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魚肉煮制后的感官評(píng)定明顯下降趨勢(shì)。

剛宰殺的新鮮魚肉表面濕潤(rùn)光滑，顏色鮮白紅潤(rùn)，有清淡的青草味，些許腥味但氣味柔和，用手指輕壓后凹陷立即回復(fù)；經(jīng)水煮后肉香味濃郁，湯汁清澈，入口肉質(zhì)細(xì)嫩有彈性。冷藏2 d后魚肉表面開始發(fā)干，色澤正常但光澤度低；煮制后肉香味明顯但不如新鮮魚肉鮮美，湯汁清晰但表面有少許漂浮泡沫。冷藏4 d后，魚肉表面產(chǎn)生黏液，手觸黏稠，顏色稍微暗淡，手指輕壓后回復(fù)速度慢；水煮后湯汁漂浮少量碎肉，肉鮮味平淡，肌肉組織缺乏彈性造成口感明顯下降。到第6天感官評(píng)定時(shí)魚肉已有不愉快異味，表面大量黏液，腥臭味明顯；水煮后湯汁混濁，此時(shí)魚肉已輕微腐敗。

3 結(jié) 論

新鮮草魚肉含有較高含量的鮮味化合物IMP，但在冷藏過(guò)程中蓄積時(shí)間很短。冷藏后ATP含量快速下降但ADP、AMP保持穩(wěn)定未出現(xiàn)積累現(xiàn)象。ATP關(guān)聯(lián)物最終以Hx為主要蓄積物，說(shuō)明草魚為Hx生成型魚種。冷藏后草魚TVB-N含量一直上升，結(jié)合ATP關(guān)聯(lián)物變化趨勢(shì)和感官評(píng)定結(jié)果，高含量的IMP與肉質(zhì)鮮美密切相關(guān)，而Hx含量的蓄積則說(shuō)明魚肉細(xì)菌腐敗的程度。冷藏2 d的草魚處于一級(jí)品范圍，TVB-N＜13 mg/100 g，6 d后肉質(zhì)已腐敗，TVB-N＞30 mg/100 g[25]。低溫冷藏雖然能有效抑制細(xì)菌繁殖，延緩魚肉的腐敗，但不能很好地保持魚肉的鮮味和口感。因此研究草魚冷藏期間ATP關(guān)聯(lián)物含量的變化，探究其風(fēng)味物質(zhì)變化的機(jī)理，進(jìn)一步分析如何保持魚肉在貯藏過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的穩(wěn)定具有重要意義。

[1]夏松養(yǎng), 奚印慈, 謝超.水產(chǎn)食品加工學(xué)[M].北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008.

[2]黃梅麗, 王俊卿.食品色香味化學(xué)[M].北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2008.

[3]王述柏.雞肉肌苷酸沉積規(guī)律及營(yíng)養(yǎng)調(diào)控研究[D].北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2004.

[4]方燕, 過(guò)世東.棚養(yǎng)和塘養(yǎng)甲魚肌肉中呈味核苷酸的含量變化及比較[J].食品研究與開發(fā), 2006, 27(8): 17-21.

[5]溫泉, 吳軼.采用高效液相色譜法測(cè)定豬肉中的呈味核苷酸[J].現(xiàn)代食品科技, 2010(1): 117-119.

[6]鄺良德, 金素鈺, 鄭玉才, 等.高效液相色譜法檢測(cè)牦牛乳和牦牛酸奶中的核苷酸[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 34(6): 1178-1181.

[7]KHAN A W.Effect of temperature during post-mortem glycolysis and dephosphorylation of high energy phosphates on poultry meat tenderness[J].Journal of Food Science, 1971, 36(1): 120-121.

[8]文娜, 湯兆星, 李芳, 等.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定羊肉中肌酸、肌酸酐、肌苷酸、鳥甘酸[J].化學(xué)工程與裝備, 2008(5): 105-107.

[9]王榮海.核苷酸鈉鹽的制造方法: 中國(guó), 101560234[P].2009-10-21.

[10]邱偉強(qiáng), 陳剛, 陳舜勝, 等.離子對(duì)反相高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中6 種ATP關(guān)聯(lián)化合物[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2011, 35(11): 1745-1752.

[11]WANG Q, XUE C H, LI Z J.Changes in the contents of ATP and its related breakdown compounds in various tissues of oyster during frozen storage[J].Journal of Ocean University of China: English Edition, 2007, 6(4): 407-412.

[12]劉亞, 章超樺, 陸子鋒.高效液相色譜法檢測(cè)水產(chǎn)品中的ATP關(guān)聯(lián)化合物[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2010, 36(6): 137-140.

[13]GB/T 5009.44—2003 肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法[S].

[14]楊文鴿, 薛長(zhǎng)湖, 徐大倫, 等.大黃魚冰藏期間ATP關(guān)聯(lián)物含量變化及其鮮度評(píng)價(jià)[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2007, 23(6): 217-222.

[15]PONS-SáNCHEZ-CASCADO S, VIDAL-CAROU M C, MARINéFONT A, et al.Influence of the freshness grade of raw fish on the formation of volatile and biogenic amines during the manufacture and storage of vinegar-marinated anchovies[J].Agriculture Food Chemistry, 2005, 53(22): 8586-8592.

[16]戚曉玉, 李艷, 周培根.日本沼蝦冰藏期間ATP降解產(chǎn)物變化及鮮度評(píng)價(jià)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2001, 25(5): 482-484.

[17]伍彬, 章超樺, 吉宏武, 等.南美白對(duì)蝦蝦頭自溶產(chǎn)物主要呈味成分分析[J].食品科學(xué), 2010, 31(10): 184-187.

[18]TAKASHI K, MAYA F, HIDEYUKI G, et al.Effects of freshness on ATP-related compounds in retorted chub mackerel Scomber japonicas[J].Food Science and Technology, 2007, 40(7): 1186-1190.

[19]鄒耀洪.香菇中5'-核苷酸的高效液相色譜-質(zhì)譜分析[J].食品科學(xué),2005, 26(1): 196-198.

[20]張巖, 呂品, 王紅, 等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定濃縮棗汁中環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷的含量[J].食品科學(xué), 2009, 30(18): 321-322.

[21]WATABE S, USHIO H, WAMOTO M, et al.Temperaturedependency of rigor-mortis of fish muscle:myo fibrillar Mg2+-ATPcase activity and Ca2+uptake by sarcoplasmic reticulum[J].Food Science,1989, 54: 1107-1115.

[22]李永洙, 陳常秀.貯藏條件對(duì)蒙山草雞肌肉鮮味成分的影響[J].食品科學(xué), 2011, 32(22): 288-292.

[23]TERASAKI M, KAJIKAWA M, FUJITA E, et al.Studies on the fl avour of meats[J].Agriculture Biology Chemistry, 1965, 29(3): 208-215.

[24]楊文鴿, 徐大倫, 孫翠玲, 等.縊蟶冰藏保活期間成為物質(zhì)的變化[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2009, 9(3): 181-186.

[25]LIU Zhongyi, LI Zhonghai, ZHONG Pengpeng, et al.Improvement of the quality and abatement of the biogenic amines of grass carp muscles by fermentation using mixed cultures[J].Science Food Agriculture,2010, 90: 586-592.