超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時測定酒類產(chǎn)品中多種人工合成甜味劑

周 彬，呂任一，肖麗恒，李 萍，何學(xué)梅，楊 芩，楊麗娜

（楚雄州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 楚雄 675000）

酒是糧食或水果經(jīng)發(fā)酵而成的飲料，富含人體需要的營養(yǎng)成分，適量飲用能預(yù)防多種疾病。隨著我國人民生活水平的提高，酒的消費(fèi)量呈現(xiàn)了快速增長的趨勢，酒中添加人工合成甜味劑的安全性備受消費(fèi)者的關(guān)注[1-3]。為了保障酒的飲用安全，GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對酒中允許添加的食品添加劑種類和濃度作了明確規(guī)定，其中規(guī)定不允許人工合成甜味劑添加到蒸餾酒酒中[4]。然而，一些不法生產(chǎn)者向酒中非法添加人工合成甜味劑的情況卻時有發(fā)生[5]，因此建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏地測定酒中多種甜味劑同時檢測的分析方法，對于保障酒的飲用安全尤為重要。

目前食品中經(jīng)常使用的人工合成甜味劑包括糖精鈉（saccharin sodium，SA）、甜蜜素（sodium cyclamate，SC）、安賽蜜（acesulfame-K，AK）、三氯蔗糖（sucralose，SL）、阿斯巴甜（aspartame，ASP）、阿力甜（alitame，ALT）和紐甜（neotame，NTM）等。隨著儀器分析技術(shù)的發(fā)展，針對這些甜味劑的檢測方法，已報(bào)道的有高效液相色譜-紫外分光光度法[6-15]、高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測法[16-18]、薄層色譜法、離子色譜法[19-22]、氣相色譜法[23-26]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[27-36]等。其中高效液相色譜-紫外分光光度法較為常用，主要檢測的甜味劑有安賽蜜和糖精鈉，但由于受到紫外分光光度法靈敏度的限制，部分甜味劑可能因含量較低而無法檢出；而且該方法不能提供結(jié)構(gòu)信息，在實(shí)際樣品分析時容易受到基質(zhì)干擾而產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法檢測人工合成甜味劑，檢測靈敏度不高，對酒中低含量的人工甜味劑不能檢出。氣相色譜法檢測甜味劑需要衍生化，操作繁瑣。近來，采用高效液相色譜-質(zhì)譜法對食品中的甜味劑進(jìn)行分析已有一些報(bào)道，但是這些方法尚存在分析種類少、消耗時間長、分離度差等不足[27-32]。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)建立了一種檢測酒中多種人工合成甜味劑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS）檢測方法。該方法處理樣品方式簡單，分析速度快，靈敏度高，適用于酒類產(chǎn)品中人工合成甜味劑的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒、黃酒、啤酒、葡萄酒 市購；糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、甜蜜素、阿力甜、紐甜（標(biāo)準(zhǔn)品純度＞95%） 美國Sigma公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Tedia公司；甲酸、甲酸銨、乙酸、乙酸銨（均為色譜純） 美國Mreda公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型超高效液相色譜-6460三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀、液相色譜儀（配有G1367E自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1322A在線脫氣機(jī)）、質(zhì)譜（電噴霧離子源（elector spray ionization，ESI） 美國Agilent公司；LA204、CPA225D分析天平 美國梅特勒-托利多公司；離心機(jī)（最大轉(zhuǎn)速10 000 r/min） 湖南省凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；AS20500AT超聲波提取機(jī) 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；PGC-01D氮吹儀 德州市昊誠實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；純水儀 美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 貯備溶液

準(zhǔn)確稱取安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜10 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇-水（1∶1，V/V）溶液溶解并定容，阿斯巴甜用甲醇和pH值為4.5的甲酸溶液溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的單標(biāo)貯備溶液。

1.3.2 使用標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確移取儲備液100 μL混合于10 mL容量瓶中，用甲醇-水（1∶1，V/V）溶液稀釋配制成10 mg/L的中間標(biāo)準(zhǔn)工作液。阿斯巴甜用甲醇和pH值為4.5的甲酸水溶液稀釋定容，精密量取適量的中間標(biāo)準(zhǔn)工作液，根據(jù)色譜峰響應(yīng)值用流動相配制成不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Z O R B A X E c l i p s e X D B-C18柱（100 mm×4.6 mm，1.8 μm）；柱溫：50 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：A相為甲醇，B相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸和20 mmol/L甲酸銨溶液，pH 4.0；流速：0.5 mL/min；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI負(fù)離子模式；干燥氣流速：11 L/min；噴霧器：45 psi；干燥氣溫度：300 ℃；毛細(xì)管電壓：4 000 V；碰撞誘導(dǎo)解離電壓：可變電壓200 V；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測。實(shí)驗(yàn)中所用的氣體均為液氮和高純氮?dú)狻?/p>

1.3.5 樣品處理方法

1.3.5.1 白酒和黃酒

用分析天平準(zhǔn)確稱取均勻白酒和黃酒樣品10 g于10 mL比色管中，用水浴加熱氮吹儀除去乙醇，用10 mL的容量瓶中，用水定容至10 mL，然后用0.22 μm濾膜過濾，濾液待上機(jī)分析。

1.3.5.2 啤酒

啤酒樣品10 g置于50 mL比色管中，超聲脫氣10 min，用水定容至10 mL，然后用0.22 μm濾膜過濾，濾液待上機(jī)分析。

1.3.5.3 葡萄酒

準(zhǔn)確稱取葡萄酒10 g于50 mL離心管中，使用超聲波超聲排氣，然后用離心機(jī)以6 000 r/min 速率離心5 min去除大分子物質(zhì)，上層清液用0.22 μm的針頭過濾器過濾，濾液待上機(jī)分析。

若樣品中所檢測的人工合成甜味劑質(zhì)量濃度過高，應(yīng)將溶液用超純水進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)的稀釋，使其在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)進(jìn)行測定。

1.3.6 樣品測定方法

將處理好的待測液放入自動進(jìn)樣器的樣品盤上，進(jìn)樣器自動進(jìn)樣10 μL，數(shù)據(jù)采集采用Agilent Mass Hunter Data Acquisition工作站進(jìn)行采集處理。采用QQQ Quantitative Analysis軟件，使用外標(biāo)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出樣品溶液中人工合成甜味劑的質(zhì)量濃度。再根據(jù)下列公式得出檢測結(jié)果。

結(jié)果計(jì)算公式：

式中：W為試樣中各檢測組分的含量/（mg/kg）；V為樣品提取液的總體積/mL；ρ為由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得進(jìn)樣液中所測得量/（mg/L）；m為試樣的質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

表2 7 種甜味劑檢測的質(zhì)譜條件Table 2 MS-MS conditions for the detection of 7 synthetic sweeteners

將一定質(zhì)量濃度的待測物標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別通過注射進(jìn)樣泵連續(xù)注入質(zhì)譜，在ESI負(fù)離子方式下采用不同的碎裂電壓對各分析物進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，得到各分析物的分子離子峰和最佳的碎裂電壓，然后使用碰撞氣使其分子離子被碰撞活化解離，使用二級質(zhì)譜掃描其子離子，得到各分析物的子離子。確定每種待測物的監(jiān)測離子對，再采用多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）方式監(jiān)測各離子對，調(diào)節(jié)質(zhì)譜參數(shù)使各信號最強(qiáng)，得最佳質(zhì)譜條件見表2。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用乙腈-體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水體系作為流動相，進(jìn)行梯度洗脫分析時，安賽蜜、糖精鈉以及三氯蔗糖和阿斯巴甜不能達(dá)到良好的分離效果；采用乙腈-5 mmol/L乙酸銨體系和甲醇-5 mmol/L乙酸銨體系下7 種甜味劑能分離。但是分析時間太長，安賽蜜、糖精鈉以及三氯蔗糖色譜峰拖尾嚴(yán)重；當(dāng)采用甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸體系作為流動相，進(jìn)行梯度洗脫分析，7 種人工合成甜味劑的峰形對稱良好，響應(yīng)強(qiáng)度高，分離度好，在優(yōu)化的色譜與質(zhì)譜條件下7 種人工合成甜味劑的多重反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖1。

圖1 7種人工合成甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixed solution of 7 synthetic sweetener standards

2.3 樣品處理?xiàng)l件的選擇

7 種人工合成甜味劑都能很好的溶于水中，因?yàn)闃悠返膹?fù)雜性，根據(jù)樣品的不同采用不同的提取方法。

白酒和黃酒的主要成分是水和乙醇，在進(jìn)行直接進(jìn)樣批量檢測時，乙醇會縮短目標(biāo)物從色譜柱上洗脫出來的時間，從而使保留時間不穩(wěn)定，會發(fā)生向前移動，為了消除乙醇對檢測結(jié)果的影響，于是就將白酒和黃酒中的乙醇用氮吹儀50 ℃加熱氮吹去除，用超純水定容，用0.45 μm的針頭過濾器過濾進(jìn)行檢測。

對于啤酒開蓋后，產(chǎn)生大量的泡沫，也不能進(jìn)行直接檢測，在進(jìn)行檢測前，要采用超聲波超聲排除氣泡，再過針頭過濾器后進(jìn)行檢測。

葡萄酒成分復(fù)雜，含有大量的天然色素和有機(jī)物，在樣品處理時，使用超聲波超聲排氣，在用離心機(jī)離心去除大分子物質(zhì)，上清液過0.22 μm的針頭過濾器過濾，濾液供UPLC-MS-MS進(jìn)行檢測，效果良好。

2.4 添加回收率和方法精密度

采用建立的方法在檢測樣品中添加10、20、30 μg/kg的7 種食品添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個添加水平重復(fù)測定6 次，計(jì)算添加平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。7 種食品添加劑的平均回收率在88.3%～98.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）為2.1%～6.7%。方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析的要求。

表3 樣品中7種甜味劑的添加回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 7 synthetic sweeteners in spiked samples (n=6)

2.5 方法的線性范圍和檢出限

表4 7種目標(biāo)分析物的線性關(guān)系和定量限（RSN=3）Table 4 Linear relationships and limits of quanti fication (LOQ, RSN =3)of 7 synthetic sweeteners

對7 種人工合成甜味劑的質(zhì)量濃度在0.01～5 mg/L之間的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，得到一系列不同質(zhì)量濃度的色譜圖，并以目標(biāo)組分的峰面積y對相應(yīng)的質(zhì)量濃度x（mg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)（r）都在0.999以上。用信噪比（RSN）為3時，作為方法的定量限（limit of detection，LOQ）、線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表4。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了同時測定酒類產(chǎn)品中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜7種人工合成甜味劑的方法。將該方法用于酒類產(chǎn)品中低含量的人工合成甜味劑的測定，樣品前處理步驟簡單、分離度好、靈敏度高、精密度好、準(zhǔn)確度高。在實(shí)際檢測過程中發(fā)現(xiàn)，在一些酒中的人工合成甜味劑有糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、紐甜。該法的建立為酒類產(chǎn)品提供可靠而準(zhǔn)確的分析方法，為酒類產(chǎn)品的質(zhì)量控制和安全評價提供科學(xué)依據(jù)，在保障食品安全方面有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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