RP-HPLC法測定大鼠尿及糞中異甘草素含量

楊燕云，許亮，郝淞瑤，張振秋

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

分析測試

RP-HPLC法測定大鼠尿及糞中異甘草素含量

楊燕云，許亮，郝淞瑤，張振秋*

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

大鼠空腹12h后，灌胃給藥異甘草素（劑量4.0mg·kg-1），按擬定時(shí)間間隔收集尿液和糞便，HPLC法測定尿和糞便中異甘草素的含量，研究大鼠口服異甘草素以后排泄規(guī)律。結(jié)果顯示異甘草素在尿和糞便中的累積排泄率分別為2.34±0.13%和5.23±0.54%；異甘草素在尿與糞便中的回收率很低，表明異甘草素在體內(nèi)極易發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化。

異甘草素；高效液相色譜法；尿；糞

異甘草素（Isoliquiritigenin，ILG）是甘草黃酮中的一種查爾酮[1]，具有抗腫瘤、抗病毒、抗自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等生物活性，能抑制肺癌乳腺癌前列腺癌和宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖[2，3]，是一種極具開發(fā)前景的抗腫瘤藥物。因此，鑒于異甘草素較強(qiáng)的藥理活性和藥用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)對異甘草素進(jìn)行排泄研究，為異甘草素新藥和含異甘草素的中藥新劑型的研制提供一定的體內(nèi)過程數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀、紫外檢測器帶色譜工作站（安捷倫科技有限公司）；電子分析天平（傲豪斯公司））；TGL-16C高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；WX-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）。

異甘草素（純度＞98%西安小草植物科技有限公司）；異甘草素、槲皮素對照品均購自中國藥品生物制品檢驗(yàn)所；色譜純乙腈、甲醇和分析純磷酸、乙酸均購自山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司；色譜用水是娃哈哈純凈水。

實(shí)驗(yàn)動物：雌性SD大鼠，清潔Ⅱ級，體重180～220g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 色譜條件

Diamonsil C18（150mm×4.6mm，5μm）色譜柱；以甲醇（含乙酸1%）-水（含乙酸1%）（65∶35）為流動相；流速1.0mL·min-1；檢測波長370nm；柱溫為室溫。

1.3 給藥方案與尿糞樣品采集

取健康SD大鼠6只，分別置于代謝籠中，收集空白尿樣和糞樣，禁食24h后灌胃給于異甘草素溶液（4.0mg·kg-1），分別收集0～4，4～8，8～12，12～24，24～36，36～48，48～60和60～72h各時(shí)間段的尿樣糞樣，尿樣記錄體積，糞樣低溫干燥后稱重，-20℃冷凍保存至分析測定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

異甘草素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制取異甘草素對照品20.00mg，精密稱定，置于25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻即得異甘草素濃度為800μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。精密取適量儲備液，用甲醇逐級稀釋得到異甘草素濃度分別為0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0和20.0μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱取槲皮素適量，用甲醇溶解配置成2000μg·mL-1的儲備液。取0.1mL內(nèi)標(biāo)儲備液至10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成20.00μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，置4℃冰箱中保存。

1.5 樣品處理

1.5.1 尿樣樣品處理取尿樣0.2mL，加入甲醇溶液50uL，加入內(nèi)標(biāo)溶液20uL（20.00μg·mL-1），加入乙腈-磷酸（95∶5）溶液1mL，渦旋混勻1min，加氯仿1.0mL，渦旋混勻1min，離心5min（10000×10-6），分離上清液，于40℃空氣流下?lián)]干，殘留物于50uL甲醇溶解，取20μL進(jìn)樣。

1.5.2 糞樣樣品處理干燥后糞樣研細(xì)混勻，稱取約0.1g，加甲醇100μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液50μL（20.00μg· mL-1），加入甲醇溶液1.00mL，超聲提取30min，離心5min（10000r·min-1），分離上清液，取20μL進(jìn)樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 部分分析方法確證

方法專屬性:在本實(shí)驗(yàn)條件下，尿液、糞便中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾異甘草素測定，見圖1。

圖1 典型色譜圖Fig.1 Typical HPLC chromatograms of the isoliquiritigenin in rat urine and feces（1-Quercetin，2-isoliquiritigenin）

A1是尿樣空白尿樣色譜圖，A2是空白尿樣加標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，A3是大鼠灌胃異甘草素單體的尿樣色譜圖；B1是糞樣空白尿樣色譜圖，B2是空白糞樣加標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，B3是大鼠灌胃異甘草素單體的糞樣色譜圖。由圖譜可以看出，空白尿液中內(nèi)源性物質(zhì)不影響尿液中異甘草素和槲皮素的測定，而給藥后收集的大鼠尿樣經(jīng)處理后得到的色譜圖顯示尿液中其他代謝產(chǎn)物也不影響異甘草素（2號峰）和內(nèi)標(biāo)槲皮素（1號峰）的測定。同樣，糞便中內(nèi)源性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物也不影響糞便中異甘草素和內(nèi)標(biāo)槲皮素的測定。

工作曲線制備取空白尿樣0.2mL，加入異甘草素對照品系列溶液20μL，配制成相當(dāng)于異甘草素尿樣濃度分別為0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00 μg·mL-1的尿樣標(biāo)準(zhǔn)系列樣品，除加入50μL甲醇外，按“尿樣樣品處理”項(xiàng)下操作，建立工作曲線。

取空白糞樣0.1g，加入異甘草素對照品系列溶液100μL，配制成相當(dāng)于異甘草素尿樣濃度分別為0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.0，20.0μg·g-1的糞樣系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，除加入100μL甲醇外，按“糞樣樣品處理”項(xiàng)下操作，建立工作曲線。

以待測物濃度為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行計(jì)算回歸運(yùn)算，求得尿樣直線回歸方程Y=5.252X+0.001，r=0.9969；糞樣直線回歸方程為Y=0.497X+0.001，r=0.9933。

提取回收率取空白尿樣0.2mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍”項(xiàng)下的方法配制異甘草素低、高兩個(gè)濃度（分別為0.05、1.6μg·mL-1）的質(zhì)量控制樣品（QC）分析，按“尿樣樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，每一個(gè)濃度進(jìn)行三樣本分析，進(jìn)樣20μL。峰面積和相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積的比值計(jì)算提取回收率。經(jīng)測定，異甘草素在低、高兩個(gè)濃度的提取回收率分別為：68.5±8.3%，72.4±6.7%。

取空白糞樣0.1g，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍”項(xiàng)下的方法配制異甘草素低、高兩個(gè)濃度（分別為0.5、16μg·g-1）的質(zhì)量控制樣品（QC）分析，按“糞樣樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作，每一個(gè)濃度進(jìn)行三樣本分析，進(jìn)樣20μL。峰面積和相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積的比值計(jì)算提取回收率。經(jīng)測定，異甘草素在低、高兩個(gè)濃度的提取回收率分別為：92.5±6.1%，89.4±5.5%。

2.2 未知樣品測定

按“樣品處理”項(xiàng)下操作，每個(gè)分析批制備一條工作曲線，同時(shí)做高、低兩個(gè)濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行三樣本分析。根據(jù)每1個(gè)分析批的工作曲線計(jì)算QC樣品的濃度，6個(gè)QC樣品中最多允許2個(gè)不同濃度的樣品超出理論值的15%（最低點(diǎn)為20%），否則此批數(shù)據(jù)不被接受。

2.3 大鼠給藥后尿樣、糞樣中異甘草素的排泄

大鼠灌胃給藥異甘草素單體后，異甘草素在尿樣和糞樣中的累計(jì)排泄量占劑量百分比數(shù)據(jù)及平均曲線見表1和圖2A、2B。

表1 大鼠灌胃異甘草素單體后異甘草素在尿、糞中的累計(jì)排泄量Tab.1 Accumulated elimination results of isoliquiritigenin in rat urine and feces

由表1可知，給大鼠灌胃異甘草素后72h后，由尿中排出的異甘草素的量僅達(dá)到給藥量的2.34± 0.13%，而從糞便中排出的異甘草素的量也僅達(dá)到給藥量的5.23±0.54%。

圖2 異甘草素在尿、糞中的累計(jì)排泄率

由圖2可知，異甘草素在尿液中排泄到36h時(shí)，達(dá)到排泄坪值，達(dá)到了排泄總量的95%以上，在糞便中經(jīng)36h排泄總量也達(dá)到糞便中排泄總量的90%以上，大鼠給藥后36h，異甘草素原型基本排泄出體外。

3 結(jié)論

（1）樣品處理時(shí)加入磷酸溶液，使異甘草素和槲皮素以游離形式存在，利于氯仿的提取。

（2）尿樣研究結(jié)果表明，大鼠灌胃異甘草素單體后，尿樣累計(jì)排泄量在48h基本達(dá)到坪值。

（3）異甘草素是查爾酮類，在體內(nèi)的極易轉(zhuǎn)化代謝，因此，在尿液和糞便中的排泄的總量還不到占給藥量的8%。在糞便中排泄量大于在尿中的排泄量，說明，異甘草素可能存在Ⅱ相代謝產(chǎn)物[4]，經(jīng)膽汁排泄入腸道，經(jīng)腸道菌群代謝后，以原形排出體外。

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Determination of contents of isoliquiritigenin in rat urine and feces by RP-HPLC

YANG Yan-yun，XU Liang，HAO Song-yao，ZHANG Zhen-qiu*
（College of Pharmacy，Liaoning University of TCM，Dalian 116600，China）

The rats were fasted for 12h but allowed water ad libitum before the isoliquiritigenin was orally administered at a dose of 4.0mg·kg-1，and urine and feces were collected after an proposed interval.An HPLC method was applied to determine the contents of isoliquiritigenin in rat urine and feces，the elimination law of isoliquiritigenin was studied.The results showed that rate of accumulation elimination of isoliquiritigenin in rat urine and feces were 2.34±0.13%and 5.23±0.54%respectively and showed the isoliquiritigenin was metabolism or conversion highly in vivo.

isoliquiritigenin；RP-HPLC；urine；feces

O657.7

A

1002-1124（2014）03-0021-03

2014-01-08

楊燕云（1978-），博士，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，講師，主要從事藥物分析工作。

張振秋（1964-），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥質(zhì)量控制和復(fù)方配伍機(jī)制研究。