劉瑩關(guān)玲 徐烜峰 邊磊
(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 北京100871)
薄層色譜法(又稱為薄層層析,thin-layer chromatography,簡稱TLC)是以涂布于支持板上的支持物作為固定相,以合適的溶劑為流動(dòng)相,對(duì)混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。
TLC是大學(xué)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)課中的重要基本操作實(shí)驗(yàn)。掌握TLC技術(shù)有助于學(xué)生儲(chǔ)備未來工作需要的色譜層面的知識(shí)。在教學(xué)中,我們根據(jù)授課對(duì)象(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部的學(xué)生)的專業(yè)特點(diǎn),選擇與醫(yī)學(xué)科學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,如通過實(shí)驗(yàn)分析解熱鎮(zhèn)痛藥復(fù)方乙酰水楊酸藥片(Compound Aspirin Tablets,APC;一種用于感冒發(fā)熱、頭痛、神經(jīng)痛等治療的常用藥)的組分;通過多步合成制備乙內(nèi)酰脲(其鈉鹽是抗癲癇藥Dilantin)等;安排了3次TLC實(shí)驗(yàn)促進(jìn)學(xué)生掌握TLC技術(shù),包括:TLC鑒定APC組分,TLC監(jiān)測安息香制備二苯乙二酮的反應(yīng)進(jìn)程,TLC輔助柱色譜分離乙酰苯胺和二苯乙二酮。
對(duì)于TLC鑒定APC組分實(shí)驗(yàn),最初我們沿用學(xué)院多年使用的展開劑[1]:由二氯甲烷(2mL)、無水乙醚(5mL)和冰醋酸(5~7滴)組成的混合溶劑,此條件對(duì)APC的3個(gè)主要成分非那西丁、阿司匹林和咖啡因給出較好的分離。溶劑的沸點(diǎn)為:乙醚34.6℃,二氯甲烷39.8℃,冰醋酸117.9℃,按比例配好后,在操作過程中因?yàn)榈头悬c(diǎn)溶劑揮發(fā)快,會(huì)使剩余展開劑的極性增加,若不更換展開劑依次展開幾塊板時(shí),后面展開板的Rf數(shù)值將呈現(xiàn)增大趨勢,有時(shí)只顯示兩個(gè)色斑,影響學(xué)生準(zhǔn)確觀察各個(gè)組分的顯色情況;與此同時(shí),實(shí)驗(yàn)室中有機(jī)溶劑的濃度會(huì)增大(特別是高溫天氣更明顯)?;趯?shí)驗(yàn)效果與環(huán)保的雙重考慮,我們嘗試對(duì)TLC鑒定復(fù)方乙酰水楊酸藥片組分的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。
展開劑(自己配制):石油醚(AR,北京化工廠),乙酸乙酯(AR,北京化工廠),冰醋酸(AR,北京化工廠),乙醚(AR,北京化工廠),二氯甲烷(AR,北京化工廠)。
薄層色譜板(自己制備):硅膠GF254(CP,青島海洋化工有限公司),0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液(實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一配制,羧甲基纖維素鈉800~1200,CP,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),玻璃片25.4mm×76.2mm,玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管(內(nèi)徑0.5mm,管長100mm,華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠),紫外線分析儀(ZF-I,上海顧村電光儀器廠)。
樣品:復(fù)方乙酰水楊酸片(APC,山東新華制藥股份有限公司,每片含阿司匹林0.22g,非那西丁0.15g,咖啡因35mg),用95%乙醇(AR,北京化工廠)溶解。
各組分標(biāo)樣:3%阿司匹林乙醇溶液,0.5%非那西丁乙醇溶液,1%咖啡因乙醇溶液(實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一配制)。
原理:薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法,它利用各成分對(duì)同一吸附劑吸附能力不同,使在流動(dòng)相(溶劑)流過固定相(吸附劑)的過程中,連續(xù)地產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附,從而達(dá)到各成分相互分離的目的。比移值Rf=溶質(zhì)移動(dòng)的距離/溶液移動(dòng)的距離,表示物質(zhì)移動(dòng)的相對(duì)距離,在條件固定的情況下,Rf對(duì)每一種化合物來說是一個(gè)特定數(shù)值。
薄層板制備:稱取5g薄層層析硅膠(GF254),加入13mL 0.5%的羧甲基纖維素鈉水溶液,混合并攪拌成均勻的糊狀物,將糊狀物均勻倒在8塊潔凈干燥的玻璃片上,用玻璃棒滾動(dòng)涂布,使其平均涂滿整個(gè)玻璃板,然后輕輕振動(dòng)玻璃板,促使其平整均勻,自然干燥后,根據(jù)需要可在烘箱中110℃條件下活化30分鐘。
APC樣品的制備:取半片APC,用研缽研成粉末,將粉末轉(zhuǎn)移到錐形瓶,加2.5mL 95%乙醇,搖動(dòng),過濾;用另一錐形瓶中保留濾液(不用時(shí)加塞子);用濾液進(jìn)行實(shí)驗(yàn),教學(xué)中4人公用。
展開劑的配備:本實(shí)驗(yàn)用到含有石油醚、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、冰醋酸不同組分的混合溶劑。各試劑在通風(fēng)櫥中量取,加入展開缸中混勻,及時(shí)加蓋子以減少溶劑揮發(fā)。
點(diǎn)樣:每塊板中間點(diǎn)APC,左、右側(cè)分別點(diǎn)標(biāo)樣非那西丁、阿司匹林或咖啡因。
將板放在展開缸中展開。
用紫外燈觀察,有色斑點(diǎn)處用鉛筆畫出,分別計(jì)算APC每個(gè)點(diǎn)的Rf。
實(shí)驗(yàn)用硅膠表面的硅羥基呈弱酸性,極性強(qiáng)的分子與硅膠吸附較強(qiáng),Rf較小。APC的3個(gè)主要組分非那西丁、阿司匹林、咖啡因的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1。阿司匹林含酸性基團(tuán)羧基,咖啡因的互變異構(gòu)體含弱堿性基團(tuán)亞氨基。極性次序?yàn)?阿司匹林>咖啡因>非那西丁;推測Rf為:阿司匹林<咖啡因<非那西丁。
圖1 APC 3個(gè)主要組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
在實(shí)驗(yàn)中觀察到的Rf就是這個(gè)次序,但阿司匹林從基線開始顯現(xiàn)連續(xù)的色帶,難以確定Rf(圖2A左、B左、C左)。據(jù)此,我們?cè)谡归_劑中加入冰醋酸以增加展開劑的極性,希望抑制阿司匹林與硅膠的作用進(jìn)而得到更集中的顯色斑點(diǎn)。從圖2(A右、B右、C右)可見,加了醋酸后,非那西丁、咖啡因的斑點(diǎn)依次升高,Rf略有增加,阿司匹林則顯色斑點(diǎn)集中且Rf增加為3個(gè)組分中最大的。對(duì)硅膠鑒定其他含酸性基團(tuán)的有機(jī)化合物,在展開劑中加醋酸也可得到集中的顯色斑點(diǎn),說明醋酸的作用在于:影響含酸性基團(tuán)的化合物在TLC實(shí)驗(yàn)過程的吸附與解吸。
由二氯甲烷、無水乙醚和冰醋酸組成的混合溶劑,對(duì)APC 3個(gè)主要組分非那西丁、阿司匹林和咖啡因給出的分離如圖2A右所示,咖啡因呈現(xiàn)橢圓形色斑,Rf=0.16;非那西丁呈現(xiàn)橢圓形色斑,Rf=0.59;阿司匹林呈現(xiàn)月牙形色斑,Rf=0.81。
圖2 展開劑優(yōu)化前后的分離效果
為了得到與這個(gè)分離相同或更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們用可安全使用的石油醚和乙酸乙酯試劑,選擇不同條件進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)。首先做替代乙醚的嘗試,成功后又做了替代二氯甲烷的嘗試(表1),最后以石油醚(3mL)、乙酸乙酯(4mL)、冰醋酸(6滴)的混合溶劑獲得最佳結(jié)果(圖2B右)。在此配比下,咖啡因呈現(xiàn)橢圓形色斑,Rf=0.14;非那西丁呈現(xiàn)橢圓形色斑,Rf=0.49;阿司匹林呈現(xiàn)圓形色斑,Rf=0.66。
表1 展開劑選擇實(shí)驗(yàn)*
有報(bào)道用乙酸乙酯單一溶劑分離APC的3個(gè)組分,通過碘熏2~30分鐘顯色[2]。我們用自制的薄板,對(duì)乙酸乙酯單一溶劑(7mL)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),在紫外燈下觀察到分離出很好的咖啡因、非那西丁的色斑,但阿司匹林顯示從起點(diǎn)到與咖啡因參比點(diǎn)等高的色帶(圖2C左),而用乙酸乙酯(7mL)、冰醋酸(6滴)的混合溶劑展開時(shí),非那西丁和阿司匹林幾乎重疊(圖2C右),兩種情況都不利于計(jì)算Rf,因此不在教學(xué)中使用。
我們探索成功的新展開劑石油醚(3mL)-乙酸乙酯(4mL)-冰醋酸(6滴),不僅能使APC藥片中的3個(gè)組分顯色清楚,而且提高了溶劑沸點(diǎn),減少了揮發(fā),使學(xué)生可以更從容地操作。更重要的是,減少使用有生物毒性的乙醚和二氯甲烷,在環(huán)境保護(hù)方面也有意義。本優(yōu)化操作經(jīng)近400名學(xué)生驗(yàn)證,教學(xué)效果良好。
[1]北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院有機(jī)化學(xué)研究所.有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn).第2版.關(guān)燁第,李翠娟,葛樹豐修訂.北京:北京大學(xué)出版社,2002
[2]路平.醫(yī)學(xué)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo).武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社,2007