限進(jìn)材料的制備及其應(yīng)用*
——介紹一個(gè)儀器分析綜合實(shí)驗(yàn)

王超展李溟 衛(wèi)引茂

(西北大學(xué)合成與天然功能分子化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 陜西西安710069)

限進(jìn)材料的制備及其應(yīng)用*
——介紹一個(gè)儀器分析綜合實(shí)驗(yàn)

王超展**李溟 衛(wèi)引茂

(西北大學(xué)合成與天然功能分子化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 陜西西安710069)

介紹一個(gè)儀器分析綜合實(shí)驗(yàn),利用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合技術(shù)制備反相限進(jìn)材料;以該材料為基礎(chǔ),建立牛奶中4種塑化劑的固相萃取-高效液相色譜分析方法。

儀器分析實(shí)驗(yàn) 限進(jìn)材料 高效液相色譜 牛奶 塑化劑

隨著生命科學(xué)、食品科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展,相關(guān)樣品分析已成為分析化學(xué)非常重要的任務(wù)。目前,色譜法是復(fù)雜樣品分析中最常用的方法,在生物、食品和環(huán)境分析中得到了非常廣泛的應(yīng)用。然而,在分析上述樣品之前,必須對樣品進(jìn)行前處理。首先,這些樣品一般都含蛋白質(zhì)、核酸、腐殖酸等物質(zhì),它們會吸附在固定相表面,造成色譜柱污染甚至堵塞,嚴(yán)重影響分離效率和色譜柱使用壽命;其次,對于痕量和超痕量分析而言,待分析物含量可能遠(yuǎn)低于儀器檢測水平,必須對其進(jìn)行富集;另外,這些樣品中的基質(zhì)非常復(fù)雜,很容易對分析造成干擾,因此需要對樣品進(jìn)行凈化。簡單、快速、高效、綠色的樣品前處理方法對于提高樣品分析的準(zhǔn)確度、精密度和分析效率具有重要意義[1]。下面結(jié)合我們的科研工作介紹一個(gè)儀器分析綜合實(shí)驗(yàn),該實(shí)驗(yàn)涉及吸附分離材料制備、生物樣品前處理、高效液相色譜分析方法建立等方面的內(nèi)容。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程需要130小時(shí)。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1)了解生物樣品的特殊性并掌握生物樣品分析的全過程。

(2)認(rèn)識生物樣品前處理的重要性,熟悉限進(jìn)材料的原理。

(3)了解限進(jìn)材料的制備方法和應(yīng)用。

2 實(shí)驗(yàn)原理

固相萃取(SPE)技術(shù)是一種由柱色譜和液固萃取技術(shù)相結(jié)合的樣品前處理技術(shù)。其基本原理與液相色譜相似,根據(jù)待分析物在溶液和吸附劑兩相間的作用強(qiáng)度或分配能力不同,與吸附劑作用力強(qiáng)的或者分配系數(shù)大的物質(zhì)會被優(yōu)先吸附,作用力很弱的或者分配系數(shù)很小的物質(zhì)作為不保留組分流出,從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的分離、純化和富集。與液液萃取相比,固相萃取具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)溶劑耗費(fèi)小;(2)操作簡單、快速;(3)易于收集目標(biāo)組分;(4)可處理微量試樣;(5)可在線或離線操作,可與其他儀器聯(lián)用。然而,在處理生物樣品時(shí),蛋白質(zhì)、腐植酸和核酸等會與待分析物同時(shí)吸附在固相萃取柱上,從而造成干擾。

限進(jìn)材料是近年來生物分析中廣泛采用的一類樣品前處理材料,它能有效吸附小分子化合物,而排除(不吸附)蛋白質(zhì),因此能夠有效去除或降低蛋白質(zhì)對小分子分析的干擾。限進(jìn)材料的出現(xiàn)極大地提高了生物樣品分析的速度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性,并有利于分析過程自動化[1]。限進(jìn)材料一般具有雙層結(jié)構(gòu):內(nèi)層為小分子結(jié)合層;外層為親水性的大分子屏蔽層,多為具有抗蛋白吸附性能的二醇基親水性聚合物[2]或蛋白質(zhì)[3]。限進(jìn)材料對蛋白質(zhì)的排除作用就是通過親水層的化學(xué)擴(kuò)散屏障或化學(xué)擴(kuò)散屏障與孔徑限制的物理屏障相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。

原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)是近年發(fā)展起來的一種高分子合成技術(shù),它在吸附分離材料制備方面的應(yīng)用也逐漸引起了廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采用ATRP技術(shù)制備反相限進(jìn)材料,并用于牛奶中4種塑化劑的分析。

3 儀器與試劑

3.1 儀器

傅立葉變換紅外光譜儀(布魯克,德國),紫外-可見分光光度計(jì)(島津,日本),高效液相色譜儀(島津,日本),固相萃取裝置(Sigma-Aldrich,美國),SinoChrome ODS-BP色譜柱(4.6mm×200mm,5μm,依利特,大連)。

3.2 試劑

HF254型薄層硅膠(青島海洋化工廠),甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(上海晶純試劑有限公司),(對-氯甲基)-苯基三氯硅烷(百靈威科技有限公司),十八烷基三氯硅烷(百靈威科技有限公司);牛血清白蛋白和溶菌酶購自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司,葛根素(安康市天源植物提取有限公司)、對羥基苯甲醛(阿拉丁試劑)、氯雷他定、硝苯地平和地西泮購自中國藥品生物制品檢定所,吡啶、溴化亞銅、2,2-聯(lián)二吡啶、甲苯、鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丙酯(DPrP)和鄰苯二甲酸二異丁酯(DiBP)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,脫脂牛奶購自本地超市(使用前分別用濾紙和濾膜過濾)。

4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.1 反相限進(jìn)材料的制備

4.1.1 硅膠活化

將薄層硅膠分別過200目和320目篩,取中間粒徑硅膠。取2.0g篩分后的硅膠,加入到50mL圓底燒瓶,再加入30mL 6mol/L鹽酸,超聲10min。攪拌下110℃回流4h。用砂芯漏斗抽濾,并用蒸餾水洗滌至中性。120℃下真空干燥8h。

4.1.2 硅膠硅烷化

稱取1.0g活化硅膠,置于50mL三頸燒瓶中,加入20mL無水甲苯,超聲15min。將0.1mL對-氯甲基-苯基三氯硅烷和0.4mL十八烷基三氯硅烷溶解在5mL無水甲苯中,用滴液漏斗緩慢滴加。120℃回流攪拌24h。抽濾,依次用甲苯、甲醇、丙酮洗滌改性硅膠。60℃真空干燥8h。

4.1.3 在硅膠表面接枝聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(pGMA)

稱取0.2g硅烷化硅膠,置于50mL三口燒瓶中,加入10mL異丙醇,再加入1mL甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA),超聲3min。通氮?dú)?0min,冷凍—抽真空—解凍—通氮?dú)庋h(huán)3次,迅速加入40mg溴化亞銅和128mg 2,2-聯(lián)二吡啶。再次冷凍—抽真空—解凍—通氮?dú)?。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下,40℃下反應(yīng)24h,通入空氣終止反應(yīng)。抽濾,依次用異丙醇、甲醇、水、丙酮洗滌產(chǎn)物。將改性硅膠轉(zhuǎn)移至50mL圓底燒瓶中,加入20mL 0.2mol/L EDTA溶液,60℃下絡(luò)合4h,以去除吸附的銅離子。再依次用水、甲醇洗滌。60℃真空干燥8h。

4.1.4 環(huán)氧基水解

將表面接枝pGMA的改性硅膠置于50mL圓底燒瓶中,加入20mL 30%四氫呋喃水溶液,再加入2mL 0.25mol/L硫酸,60℃水解8h。依次用水、甲醇洗滌,40℃真空干燥8h,即得到反相限進(jìn)材料。

4.1.5 限進(jìn)材料的紅外光譜表征

采用KBr壓片法分別測定活化硅膠、硅烷化硅膠和反相限進(jìn)材料的紅外光譜圖,分析并對比譜圖,推斷材料制備是否成功。

4.2 分析方法的建立與驗(yàn)證

4.2.1 HPLC條件

色譜條件如下:色譜柱:SinoChrome ODS-BP色譜柱(4.6mm×200mm,5μm);流動相:65%乙腈水溶液;流速:1mL/min;檢測波長:240nm;進(jìn)樣體積:20μL。

4.2.2 固相萃取條件

稱取200mg反相限進(jìn)材料,裝填于10mL空柱管中,制成固相萃取小柱。將待處理樣品上樣至用50mmol/L PBS(pH7.4)平衡過的固相萃取柱,用2mL 30%甲醇淋洗,再用3mL甲醇洗脫,用氮?dú)獯蹈上疵摻M分,將殘留物溶于0.20mL 65%乙腈。圖1是牛奶加標(biāo)樣在固相萃取前后的色譜圖。可以看出,經(jīng)過固相萃取后,牛奶樣品中的蛋白和其他基質(zhì)對塑化劑分析的干擾大大降低,同時(shí)塑化劑得到了富集,大大提高了檢測靈敏度。

圖1 反相限進(jìn)材料對牛奶加標(biāo)樣的處理效果牛奶加標(biāo)樣中各種塑化劑均為15μg/L。a.固相萃取前;b.固相萃取后1.鄰苯二甲酸二甲酯;2.鄰苯二甲酸二乙酯;3.鄰苯二甲酸二丙酯;4.鄰苯二甲酸二丁酯

4.2.3 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

將一定體積的塑化劑混合溶液(含DMP、DEP、DPrP和DiBP質(zhì)量濃度均為100mg/L)加入到70mL牛奶中,分別配制含各種塑化劑質(zhì)量濃度為0.3、1.0、3.0、10.0、30.0、100和300μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液;每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液經(jīng)固相萃取處理后進(jìn)行HPLC分析,每次測定重復(fù)3次,以質(zhì)量濃度對峰面積平均值作圖,分別得到DMP、DEP、DPrP和DiBP的線性方程和線性范圍(表1)。

表1 分析方法的線性關(guān)系及線性范圍

4.2.4 回收率和重現(xiàn)性

取20mL牛奶3份,分別加入20μL(樣品1)、60μL(樣品2)、120μL(樣品3)塑化劑混合液(DMP、DEP、DPrP和DiBP的質(zhì)量濃度均為100mg/L),經(jīng)固相萃取處理后進(jìn)行HPLC分析,每次測定重復(fù)3～6次,計(jì)算加標(biāo)質(zhì)量回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 分析方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

4.2.5 最低檢測限和最低定量限

最低檢測限(LOD)定義為3.3(Sy/b),最低定量限(LOQ)定義為10(Sy/b)。Sy是將含各種塑化劑濃度均為10μg/L的牛奶樣品平行進(jìn)行6次SPE-HPLC分析后,所得峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差,b是標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。表3是所得各物質(zhì)的檢測限和定量限。

表3 檢測限和定量限

5 數(shù)據(jù)處理

(1)以質(zhì)量濃度對峰面積平均值作圖,分別得到DMP、DEP、DPrP和DiBP的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,包括線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)偏差。

(2)計(jì)算4種塑化劑的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

(3)計(jì)算LOD和LOQ。

6 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

(1)ATRP反應(yīng)中要充分除氧。

(2)硅烷化反應(yīng)中要采用無水甲苯。

(3)用液氮冷凍過程中要注意安全。

(4)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)采用滿環(huán)進(jìn)樣以提高進(jìn)樣精密度。

(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要對色譜柱和色譜儀進(jìn)行清洗。

7 總結(jié)

隨著生命科學(xué)發(fā)展以及人們對食品安全和環(huán)境保護(hù)的關(guān)注,生物分析、食品分析和環(huán)境分析已成為分析化學(xué)中的主要任務(wù)。“限進(jìn)材料的制備及其應(yīng)用”作為化學(xué)相關(guān)專業(yè)的儀器分析綜合實(shí)驗(yàn),能夠使學(xué)生通過吸附分離材料制備、樣品前處理、分析條件優(yōu)化、樣品分析測定以及數(shù)據(jù)分析處理等環(huán)節(jié)的學(xué)習(xí)和實(shí)踐,掌握復(fù)雜生物樣品分析的全過程。本實(shí)驗(yàn)對學(xué)生進(jìn)一步消化、吸收和運(yùn)用課堂所學(xué)理論知識具有重要作用,有利于提高學(xué)生解決復(fù)雜問題的能力。而且,實(shí)驗(yàn)中的樣品是與人們生活密切相關(guān)的,待分析物也是近年來各方頗為關(guān)注的污染物和非法添加物,可增強(qiáng)學(xué)生參與實(shí)驗(yàn)的積極性和主動性,調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

[1] Gil G C,Brennan J,Throckmorton D J,et al.JChromatog B,2011,879:1112

[2] Xu W,Su S,Jiang P,et al.JChromatog A,2010,1217(46):7198

[3] Wa C,Mallik R,Hage D S.Anal Chem,2008,80(22):8751

陜西省科技廳社發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目(No.2013K13-02-10,2013-2014);西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.CXY1344(1));西北大學(xué)本科教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程項(xiàng)目(No.JX12020,2013-2014)

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