天麻素改變大鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心房肌細(xì)胞的電生理活動(dòng)

王 飛，位 凱，沈 兵，王烈成，孔德虎，胡金蘭

天麻素改變大鼠竇房結(jié)細(xì)胞和心房肌細(xì)胞的電生理活動(dòng)

王 飛，位 凱，沈 兵，王烈成，孔德虎，胡金蘭

目的記錄大鼠心肌細(xì)胞生物電活動(dòng)并觀察天麻素對(duì)大鼠心肌細(xì)胞生物電活動(dòng)的影響。方法選用健康SD大鼠，應(yīng)用心肌細(xì)胞內(nèi)生物電記錄的方法，了解正常竇房結(jié)及心房肌細(xì)胞的生物電活動(dòng)情況，觀察并分析天麻素對(duì)大鼠竇房結(jié)和心房肌細(xì)胞生物電活動(dòng)的影響。結(jié)果在目前實(shí)驗(yàn)條件下，能真實(shí)記錄到竇房結(jié)和心房肌細(xì)胞電活動(dòng)，在此基礎(chǔ)上觀察到天麻素能加快大鼠竇房結(jié)細(xì)胞Vmax 4，縮短心房肌細(xì)胞APD90，其余的電生理參數(shù)變化不明顯。結(jié)論記錄離體心肌細(xì)胞生物電活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)條件相對(duì)成熟；天麻素能影響離體心肌細(xì)胞生物電活動(dòng)，可能與天麻素增強(qiáng)TCa2＋通道通透性，促進(jìn)KATP的開放有關(guān)。

天麻素；心房肌細(xì)胞；竇房結(jié)細(xì)胞；動(dòng)作電位

天麻作為我國常用的名貴中藥有著巨大的藥用價(jià)值，天麻素是其有效成分之一，化學(xué)結(jié)構(gòu)為4-羥甲基苯甲醇-β-D吡喃葡萄糖苷。研究［1－2］表明，天麻素具有鎮(zhèn)靜、催眠，對(duì)腦細(xì)胞損傷有保護(hù)作用；對(duì)于循環(huán)系統(tǒng)，天麻素能降低外周血管阻力、降低血壓和增加動(dòng)脈血管順應(yīng)性［3］，尤其可以增加外周及冠狀動(dòng)脈血流量，對(duì)心臟具有一定的保護(hù)作用［4］。實(shí)驗(yàn)室前期研究［5］表明天麻素預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，能加快大鼠心率，降低在體大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)心律失常的發(fā)生。因此該研究擬從電生理學(xué)的角度，探索天麻素對(duì)大鼠離體心肌細(xì)胞電活動(dòng)的影響，進(jìn)而了解天麻素對(duì)心肌細(xì)胞的離子作用機(jī)制，這也將成為研究天麻素降低心律失常發(fā)生的必要前提。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用健康成年SPF級(jí)SD大鼠（安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄不拘，體重（230± 10）g，動(dòng)物置于聚丙乙烯塑料大鼠籠內(nèi)，所有大鼠自由進(jìn)食飲水，自然采光，室溫維持在（24±1）℃。在實(shí)驗(yàn)過程中，其中有5只大鼠記錄不到竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位而舍棄。部分細(xì)胞可以記錄到動(dòng)作電位，但由于不穩(wěn)定，不能給藥用作藥物灌流前后數(shù)據(jù)的分析。

1.2 方法

1.2.1 大鼠離體心肌組織的制備 將大鼠擊昏，頸部放血，四肢固定，迅速開胸取右心房連同上下腔靜脈，置于4℃的充氧Krebs’液［118×10－3mol/L NaCl，4.7×10－3mol/L KCl，2.5×10－3mol/L CaCl2，1.2×10－3mol/L KH2PO4，1.2×10－3mol/L MgSO4（7 H2O），25.2×10－3mol/L NaHCO3，11.1 ×10－3mol/L glucose］中，按心臟跳動(dòng)節(jié)律輕擠壓以排除心房內(nèi)的積血。切取部分上下腔靜脈連同部分心房肌，用不銹鋼針將標(biāo)本固定在容積為4 ml標(biāo)本槽中，固定標(biāo)本過程中注意不能損傷竇房結(jié)，并以心肌標(biāo)本的自然長度固定在光滑的瓊脂表面。用正常Krebs’液灌流［（36±0.5）℃，95%O2、5%CO2的混合氣），恒速灌流（5×10－3L/min）。適應(yīng)灌流30 min后，記錄竇房結(jié)及心房肌細(xì)胞生物電各參數(shù)。

1.2.2 主要試劑及記錄裝置 天麻素（C13H18O7，批號(hào)：20100801，純度：99.2%，江蘇寶澤堂醫(yī)藥科技有限公司），其它試劑均為分析純。適應(yīng)灌流30 min后（LEAD-2蠕動(dòng)泵，保定蘭格恒流泵有限公司），在顯微鏡下用微操縱儀將玻璃微電極（玻璃微電極由P-97微電極拉制儀（美國Sutter公司）拉制，尖端充以3 mol/L KCl，電極尖端電阻：10～40 MΩ）推進(jìn)至心肌細(xì)胞表面，再改用步進(jìn)式微電極推進(jìn)器（MO-81，日本Narishiger科學(xué)儀器公司）以每步1 μm的步速將微電極刺入細(xì)胞。一旦刺入細(xì)胞，膜電位會(huì)突然下降，同時(shí)記錄到生物電信號(hào)。生物電信號(hào)經(jīng)過Intra 767型微電極放大器（日本Narishiger科學(xué)儀器公司）放大后，輸入計(jì)算機(jī)信號(hào)采集分析系統(tǒng)（Powerlab/4sp，澳大利亞ADInstruments公司）來記錄和分析竇房結(jié)及心房肌細(xì)胞生物電的變化［6］。

1.2.3 觀察指標(biāo) 先記錄正常的細(xì)胞電活動(dòng)，包括竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位的自發(fā)頻率（APF）、閾電位（TP）、最大復(fù)極化電位（MDP）、靜息膜電位（RP）、動(dòng)作電位幅度（APA）、0期去極化速度（Vmax 0）、4期自動(dòng)去極化速度（Vmax 4）以及心房肌細(xì)胞的APF、RP、APA、Vmax 0和動(dòng)作電位時(shí)程（APD50、APD90）。然后予以天麻素（2×10－5mol/L）［7］持續(xù)灌流10 min后，觀察竇房結(jié)和心房肌細(xì)胞的上述生物電指標(biāo)的變化；沖洗后，再繼續(xù)記錄生物電信號(hào)并觀察上述指標(biāo)的變化。通過竇房結(jié)細(xì)胞的生物電變化觀察天麻素對(duì)自律細(xì)胞的影響；通過心房肌細(xì)胞的生物電變化觀察天麻素對(duì)工作細(xì)胞的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，藥物干預(yù)前后的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 正常大鼠竇房結(jié)細(xì)胞生物電活動(dòng)將玻璃微電極推進(jìn)至上腔靜脈與右心房交界處，并把微電極的探頭電位調(diào)至零電位水平，通過步進(jìn)式微電極推進(jìn)器將微電極逐步刺入細(xì)胞，一旦入胞內(nèi)即可引出竇房結(jié)細(xì)胞動(dòng)作電位。見圖1中的Pre-Gastrodin。實(shí)驗(yàn)中所記錄到的竇房結(jié)細(xì)胞生物電活動(dòng)的各指標(biāo)為APF：（256.64±32.97）bpm；TP：（－46.49± 7.32）mV；MDP：（－54.09±2.14）mV；APA：（52.34±11.14）mV；Vmax 0：（2 008.25± 1 056.77）mV/s；Vmax 4：（99.27±37.36）mV/s，n＝113個(gè)竇房結(jié)細(xì)胞。

2.2 正常大鼠心房肌細(xì)胞生物電活動(dòng)將玻璃微電極推進(jìn)至心房肌表面，以上述同樣方法引出心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位。如圖2中的Pre-Gastrodin。實(shí)驗(yàn)中所記錄到的心房肌細(xì)胞生物電活動(dòng)的各指標(biāo)為APF：（241.35±39.68）bpm；RP：（－67.60±7.77）mV；APA：（74.68±8.90）mV；Vmax：（17 349.41± 3 740.14）mV/s；APD50：（0.172±0.006 8）s；APD90：（0.547±0.016 4）s，n＝291個(gè)心房肌細(xì)胞。

2.3 天麻素對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞生物電活動(dòng)的影響找到竇房結(jié)細(xì)胞后穩(wěn)定5 min，記錄竇房結(jié)細(xì)胞正常電活動(dòng)，然后予以天麻素（2×10－5mol/L）持續(xù)灌流10 min后，觀察并記錄竇房結(jié)細(xì)胞生物電的變化，沖洗后再記錄相應(yīng)指標(biāo)（實(shí)驗(yàn)結(jié)果在同一細(xì)胞上獲得）。與天麻素灌流前比較，天麻素灌流后，大鼠竇房結(jié)細(xì)胞AP發(fā)放頻率明顯加快（t＝－8.371），心動(dòng)周期縮短，Vmax 4明顯加快（t＝－6.161），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），沖洗后上述參數(shù)均恢復(fù)，APA、Vmax 0及其余參數(shù)變化不明顯，結(jié)果表明天麻素可以提高竇房結(jié)細(xì)胞的自律性，見圖1、表1。

圖1 天麻素對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞生物電活動(dòng)的影響

表1 天麻素對(duì)大鼠竇房結(jié)細(xì)胞AP各參數(shù)的影響（±s）

表1 天麻素對(duì)大鼠竇房結(jié)細(xì)胞AP各參數(shù)的影響（±s）

與灌流前比較：*P＜0.05

項(xiàng)目APF（bpm）TP（mV）MDP（mV）APA（mV）Vmax 0（mV/s）Vmax 4（mV/s）灌流前251.99±29.99－47.08±7.30－54.09±8.8156.28±10.702 281.20±1 160.1494.76±30.67灌流后264.41±30.55*－45.31±8.05－53.82±7.8155.45±11.542 419.34±1 187.99125.02±31.05*洗脫252.66±30.19－45.47±8.35－52.86±8.6055.04±11.142 240.61±1 103.2490.85±22.83

表2 天麻素對(duì)大鼠心房肌細(xì)胞AP各參數(shù)的影響（±s）

表2 天麻素對(duì)大鼠心房肌細(xì)胞AP各參數(shù)的影響（±s）

與灌流前比較：*P＜0.05

項(xiàng)目APF（bpm）RP（mV）APA（mV）Vmax 0（mV/s）APD50（s）APD90（s）灌流前258.87±47.96－67.89±6.9877.81±7.0019 451.79±1 751.190.184±0.010.588±0.02灌流后273.21±41.49*－66.67±8.2377.96±5.5918 508.33±2 332.690.176±0.010.543±0.02*洗脫262.40±49.04－64.93±7.7676.96±6.2119 239.58±1 551.300.173±0.010.544±0.01

2.4 天麻素對(duì)心房肌細(xì)胞生物電活動(dòng)的影響記錄心房肌細(xì)胞生物電活動(dòng)，觀察用天麻素灌流前，灌流后及沖洗后的生物電變化，（實(shí)驗(yàn)結(jié)果在同一細(xì)胞上獲得）。與天麻素灌流前比較，天麻素灌流后，APF加快（t＝－4.101），心房肌細(xì)胞APD90明顯縮短（t＝2.916），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），沖洗后上述參數(shù)均恢復(fù)，APD50及其余參數(shù)變化不明顯，結(jié)果提示天麻素能縮短心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程，尤其是APD90，這可能與天麻素促進(jìn)心房肌細(xì)胞3期K＋外流有關(guān)，見圖2、表2。

圖2 天麻素對(duì)心房肌細(xì)胞生物電活動(dòng)的影響

3 討論

心律失常多由于心肌細(xì)胞膜離子活動(dòng)的異常活動(dòng)所致，本課題組前期研究［5］表明天麻素預(yù)處理可以減少在體大鼠心肌缺血再灌注損傷時(shí)心律失常的發(fā)生，加快大鼠心率，因此考慮天麻素可能會(huì)對(duì)心肌細(xì)胞膜離子通道活動(dòng)有影響并能影響竇房結(jié)細(xì)胞的自律性。那么天麻素是否能直接影響心肌細(xì)胞生物電活動(dòng)，國內(nèi)外尚無這方面的報(bào)道，因此本課題組應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)生物電記錄技術(shù)，在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件下，客觀真實(shí)地記錄到了竇房結(jié)細(xì)胞和心房肌細(xì)胞電活動(dòng)，包括APF、RP、APA、Vmax和APD等，并通過灌流天麻素了解到天麻素對(duì)離體心肌細(xì)胞生物電活動(dòng)的影響。離體細(xì)胞的記錄可以排除神經(jīng)及體液因素對(duì)心肌細(xì)胞活動(dòng)的影響，使對(duì)其離子機(jī)制的分析更加簡(jiǎn)單直接。

本研究表明天麻素可以明顯加快離體竇房結(jié)細(xì)胞4期自動(dòng)去極化速度，從而提高竇房結(jié)細(xì)胞的自律性，這與在體實(shí)驗(yàn)下天麻素使大鼠心率加快的結(jié)果是一致的。

竇房結(jié)自律性的高低主要與4期自動(dòng)去極化速度、MDA水平有關(guān)，竇房結(jié)4期自動(dòng)去極化的離子機(jī)制包括外向電流的減弱和內(nèi)向電流的增強(qiáng)［8］，其中IK是竇房結(jié)4期自動(dòng)去極化的最重要的離子基礎(chǔ)，其次If離子流和T-Ca2＋通道開放引起的Ca2＋內(nèi)流也是4期自動(dòng)去極化必不可少的離子基礎(chǔ)。而實(shí)驗(yàn)所測(cè)的天麻素對(duì)大鼠竇房結(jié)MDP無影響，因此初步認(rèn)為天麻素抑制竇房結(jié)細(xì)胞K＋外流的可能性不大，若要明確需進(jìn)一步通過膜片鉗技術(shù)來證明；If離子流是一種超極化激活的內(nèi)向離子流［9］，If通道的最大激活電位為－100 mV左右，而實(shí)驗(yàn)所測(cè)的大鼠竇房結(jié)MDP在－50 mV左右，因此考慮If在大鼠4期自動(dòng)去極化過程中所起的作用不大；ICa-T參與起搏的機(jī)制是通過觸發(fā)肌漿網(wǎng)鈣釋放從而增加鈉鈣交換電流，由此產(chǎn)生的內(nèi)向電流驅(qū)使細(xì)胞膜進(jìn)一步去極至閾電位水平［10］。當(dāng)4期自動(dòng)去極化至－50 mV時(shí)，ICa-T被激活，綜合以上考慮天麻素增加竇房結(jié)4期自動(dòng)去極化速度可能與增強(qiáng)T-Ca2＋通道通透性有關(guān)，這一假設(shè)還將通過應(yīng)用T-Ca2＋通道拮抗劑Miberfradi來進(jìn)一步研究。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)天麻素對(duì)竇房結(jié)細(xì)胞0期去極化速度及APA影響不大，推測(cè)天麻素可能不影響L-Ca2＋通道。

本研究顯示天麻素可以從而對(duì)抗心肌缺血引起的心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的延長，對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。另外，天麻素對(duì)心房肌細(xì)胞0期去極化速度及APA的影響不大，提示天麻素對(duì)電壓門控式Na＋通道無影響，但是天麻素可以明顯縮短心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程，尤其是APD90，但不影響APD50，該結(jié)果提示天麻素能加快心房肌細(xì)胞3期K＋的外流，這可能與促進(jìn)KATP的開放有關(guān)，從而對(duì)抗心肌缺血時(shí)APD的延長［11］，對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。這點(diǎn)也與本課題組的在體研究［5］結(jié)果相一致。至于是否促進(jìn)KATP的開放還需在后期的研究中通過應(yīng)用KATP拮抗劑來進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)室在現(xiàn)有條件下記錄離體心肌細(xì)胞生物電活動(dòng)的技術(shù)已相對(duì)成熟。在此基礎(chǔ)上研究天麻素對(duì)離體心肌細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)天麻素能加快竇房結(jié)細(xì)胞4期自動(dòng)去極化速度，并縮短心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程，這可能與天麻素增強(qiáng)T-Ca2＋通道通透性，促進(jìn)KATP的開放有關(guān)。

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Changes of electrophysiological profiles of rat myocardial cells after perfusing with Gastrodin

Wang Fei，Wei Kai，Shen Bing，et al
（Dept of Physiology，School of Basic Medical Science of Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo record the myocardial cell bioelectric activities and explore electrophysiological profiles of Gastrodin on rat myocardial cells.MethodsSinoatrial node cells and atrial myocytes isolated from 50 SD rats were used in this study to characterize the effect of Gastrodin on their electrophysiological profiles with intracellular recording approaches.ResultsIn the present experimental conditions，the bioelectric activities of sinoatrial node and atrial myocytes were truly recorded and we found that Gastrodin significantly accelerated AP frequency and Vmax 4 of sinoatrial node cells and shortened APD90of atrial myocytes.ConclusionThe experimental conditions of recording the bioelectric activities of myocardial cells in vitro are relatively mature.Gastrodin can affect the electrical activity of myocardial cells in vitro and the effects of Gastrodin may be related to inhance the permeability of T-Ca2＋channels and promote the opening of KATP.

Gastrodin；atrial myocytes；sinoatrial node cells；action potential

R 33-33；R 932

A

1000－1492（2014）03－0287－04

2013－08－26接收

安徽省教育廳科研課題（編號(hào)：2006KJ362b）；校級(jí)優(yōu)秀青年教師后備人選基金資助（編號(hào)：2009A028）

安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，合肥 230032

王 飛，女，碩士研究生；胡金蘭，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hjlan1872＠163.com