蚯蚓抗菌肽的研究進展

杜明亮，李成會

（唐山師范學院 生命科學系，河北 唐山 063000）

生物科學與技術研究

蚯蚓抗菌肽的研究進展

杜明亮，李成會

（唐山師范學院 生命科學系，河北 唐山 063000）

蚯蚓抗菌肽是近年來發(fā)現的新一代抗菌劑，對蚯蚓的免疫起著重要的作用。對蚯蚓抗菌肽的研究進展、應用現狀及前景進行了總結。

蚯蚓；抗菌肽；理化性質；生物活性；研究進展

蚯蚓俗稱地龍，又名曲蟮，是環(huán)節(jié)動物門寡毛綱的代表性動物。蚯蚓是營腐生生活動物，生活在潮濕的環(huán)境中，以腐敗的有機物為食，生活環(huán)境內充滿了大量的微生物卻極少得病，這與蚯蚓體內獨特的抗菌與免疫系統有關。蚯蚓的免疫防御體系由防止異物侵入的外部屏障結構和防止侵入后進一步蔓延的內部免疫機制構成。后者又分為自然免疫和獲得性免疫，包括細胞免疫和體液免疫。蚯蚓的獲得性免疫并不像高等動物那樣發(fā)達。而體液免疫中抗菌肽發(fā)揮著重要的作用[1]。

抗菌肽（Anti-bacterial peptides）是在誘導的條件下動物免疫防御系統產生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性肽類活性物質，是動物免疫防御系統的重要組成部分[2]。對抗菌肽的研究始于1980年代，瑞典科學家G. Boman等人，用陰溝通桿菌和大腸桿菌刺激惜古比天蠶蛹誘導產生具有抗菌活性的物質，從血淋巴分離后得到的抗菌小肽即為天蠶素（Cecropins），這是人類首次發(fā)現的真正意義上的抗菌肽[3,4]。隨著抗菌肽研究的深入，人們發(fā)現抗菌肽廣泛分布于動植物和微生物中，這些多肽分子量小，熱穩(wěn)定性高，抗菌譜廣，還可以抗真菌，抗病毒，抗腫瘤，且不易產生抗藥性[5]，正是由于抗菌肽具有這么多的作用，所以抗菌肽的研究成為了國內外研究的熱點領域之一。

1 蚯蚓抗菌肽的分類

1.1 能溶血的抗菌肽

Alexandra Milochau[6]從蚯蚓體腔液里分離到了兩種具有抗菌、溶血和凝血功能的蛋白質，分子量分別為40 ku和45 ku，命名為Fetidins；Beschin[7]也發(fā)現了分子量為42 ku的體腔細胞溶解因子（CCF-1），與無脊椎動物體內存在的凝集因子G和革蘭氏陰性菌結合蛋白具有同源性，它們均參與無脊椎動物的防御機制，CCF-1具有溶血作用，在蚯蚓抗微生物侵襲方面發(fā)揮一定的作用。

1.2 不能溶血的抗菌寡肽

Chao[8]等從蚯蚓Lumbricus rubellus中得到抗菌肽Lumbricus I，體外實驗表明具有廣譜的抗菌活性，在100 mg·L-1時不具有溶血活性。劉艷琴[9]利用硫酸銨沉淀—超濾—DE52離子交換層析—Sephadex G-10凝膠過濾和C18反相高壓液相五個步驟從蚯蚓體腔液中分離純化出一種全新的抗菌寡肽ECP5-1，含有一個半胱氨酸并且無溶血特性。

1.3 具有抑菌作用的金屬蛋白

Dhainaut[10]等從N. diversicolor terrestris的體腔液中發(fā)現了一種能夠抑制大腸桿菌和微球菌的抗菌蛋（MP II），它是一種位于蚯蚓體腔內的G1粒細胞中，且具有抑菌作用的金屬蛋白，這種抗菌蛋白可能是競爭微生物生活所需的鐵離子而起作用的。對于未免疫的蚯蚓，其抗菌活性非常低，說明細菌免疫可激發(fā)強烈的抗菌活性。

1.4 其它抗菌肽

張希春等[11]經硫酸銨沉淀、超濾、陽離子交換分離和反向快速蛋白質液相色譜（FPLC）分析，得到了兩種新的抗菌肽F-1與F-2，經電噴霧離子源質譜（ESI-MS）測定，其相對分子質量為535.27和519.27。另外張希春等[12]同樣用硫酸銨沉淀、超濾、陽離子交換分離得到了一種蚯蚓抗菌肽EABP-1，該肽的最大紫外吸收在277.16 nm，精確的分子量沒有確定。崔東波等[13]以本地產蚯蚓為原料采用磷酸緩沖溶液浸提，硫酸銨沉淀，經過Sephadex G-100層析，Sephadex G-50和Sephadex G-25分離和抗菌活性篩選得到了一種相對分子量為5 500的抗菌活性肽。

2 蚯蚓抗菌肽的理化性質

天然的抗菌肽通常是由30多個氨基酸殘基組成的堿性小分子多肽，含有4個或4個以上帶正電荷的氨基酸如賴氨酸（Lys）和精氨酸（Arg），N端親水，C端疏水，且具有雙親性質。水溶性好，分子量大約為4 KD。大部分抗菌肽具有熱穩(wěn)定性性，在100 ℃加熱10-15 min仍能保持其活性。多數抗菌肽的等電點大于7，表現出較強的陽離子特性，對較大的離子強度和較高或較低的pH值均具有較強的抗性[14]。

例如鄭津輝等[15]對提取的蚯蚓抗菌肽進行熱處理（37 ℃、50 ℃、80 ℃）和pH值處理（4.0、7.0、9.0），證實蚯蚓具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。趙曉瑜等[16]研究表明蚯蚓的抗菌29肽在pH為2.2或11的環(huán)境中抑菌活性不變，而且在煮沸10 min后仍能保留80%以上的活性，證實其穩(wěn)定性強。

3 蚯蚓抗菌肽的生物活性

孫振鈞[17]等首次提出并驗證了蚯蚓抗病的兩個假設：（1）肽類物質可能是蚯蚓體液抗菌系統的抗菌成分；（2）蚯蚓抗菌肽（蛋白）可以誘導獲得并具有非專一性的免疫應答。劉艷琴[18]等利用細胞病變抑制法測定了蚯蚓寡肽的體外抗偽狂犬病毒（PRV）的作用，分別用AO/EB染色法和DNA瓊脂糖凝膠電泳法測定了蚯蚓寡肽對HeLa細胞凋亡的影響。結果顯示，蚯蚓寡肽可以抑制PRV感染細胞，同時存在劑量效應和時間效應。崔東波[13]提取出來的一種抗菌肽對金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、食酸叢毛單胞菌、惡臭假單孢菌、皮氏伯克霍爾德菌、酵母菌、白色念球菌均有不同程度的抑制。在沸水中加熱1 h，抑菌活性未見顯著變化，表現出較高的熱穩(wěn)定性。張希春[12]等提取出來的蚯蚓抗菌肽EABP-1，最小抑菌濃度實驗表明，EABP-1對鶉雞腸球菌、綠膿桿菌、鮑氏不動菌、土生克雷伯菌的最小抑菌濃度為11.4 μg·mL-1，對糞腸球菌的最小抑菌濃度為22.8 μg·mL-1，對真菌白色念珠菌沒有表現出完全的抑制作用。鄭津輝等[19]用30%-80%不同濃度的硫酸銨沉淀蚯蚓蛋白，用考馬斯亮藍測定蛋白含量，采用管碟法和微量稀釋法分別測定蚯蚓抗菌肽和苯甲酸鈉在pH值分別是4.0、7.0、9.0下的抑菌活性及最小抑菌濃度（MIC）。結果顯示40 %、50 %、60 %、70 %硫酸銨沉淀出的蛋白都表現出抗菌活性，并對G+金黃色葡萄球菌和G-大腸桿菌均有抑菌性。而張希春等[11]提取出來的兩種新抗菌肽F-1的肽序列為Ac-Ala-Met-Val-Ser-Ser, F-2的肽序列為Ac-Ala-Met-Val-Gly-Thr，最小抑菌濃度實驗表明F-1與F-2對鶉雞腸球菌、綠膿桿菌、鮑氏不動桿菌、土生克雷伯氏菌的最小抑菌濃度分別為11.4 mg·L-1和12.85 mg·L-1，對糞腸球菌的最小抑菌濃度分別為22.8 mg·L-1和25.68 mg·L-1，對真菌白色念珠菌沒有表現出完全的抑制作用。趙曉瑜等[16]等采用菌落計數法對蚯蚓抗菌29肽的最低抑制濃度進行了研究，研究結果表明：該抗菌肽具有廣譜性，即不僅有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見細菌，而且還能夠抑制釀酒酵母、露濕漆斑菌、總狀毛霉等真菌，當質量濃度為0.009 g·L-1時對大腸桿菌就有明顯的抑制效果。劉兵[20]提取的抗菌肽也對綠膿桿菌和黃曲霉產生了不同程度的抑制作用。李曾夏子[21]對蚯蚓的體液進行超濾-陽離子交換分離-凝膠過濾層析提取出的3-30KD的抗菌肽經實驗證明對巴氏桿菌有較好的抑制作用。

4 蚯蚓抗菌肽的應用現狀及展望

抗生素不僅會增加細菌耐藥性，而且會對人類健康產生危害。而抗菌肽則是直接和細菌的細胞壁、細胞膜或者胞質內的靶目標作用，不需要和受體結合，所以細菌很難產生抗藥性。面對當今社會抗生素的濫用已經導致大量細菌產生了極強的抗藥性的問題，抗菌肽的發(fā)現無疑給了人們希望。

目前，含有蚯蚓抗菌肽的產品已研究開發(fā)出來，并在動物養(yǎng)殖中進行了初步應用，具有抗病保健和誘食的作用，使動物免疫力增加，改善肉質等作用。但因提純技術有限，應用的產品多為粗品。隨著科學技術的迅速發(fā)展和人們對蚯蚓抗菌肽研究的不斷深入，蚯蚓抗菌肽在不久的將來會在醫(yī)藥衛(wèi)生和畜牧獸醫(yī)方面發(fā)揮更重要的作用。

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[20] 劉兵.蚯蚓抗菌肽提取純化及其性質研究[D].貴州:貴州大學,2008.

[21] 李曾夏子.3-30KD蚯蚓抗菌肽的分離純化及其抗菌效果的研究[D].湖南:湖南農業(yè)大學,2010.

（責任編輯、校對：李春香）

Progress in Antimicrobial Peptides of Earthworm

DU Ming-liang, LI Cheng-hui
(Department of Life Science, Tangshan Teachers College, Tangshan 063000, China)

Antimicrobial Peptides of the earthworm is a new antimicrobial agent discovered in recent years. It plays an extremely important roal on the earthworm’s immune system. we review the advance on investigation of antimicrobial peptides in recent years, and prospect the development trend of the antimicrobial peptides.

earthworm; antimicrobial peptides; physicochemical property; biological activity; research advance

Q959.193

A

1009-9115(2014)02-0049-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2014.02.014

唐山師范學院平臺建設項目（11PT-03）

2013-07-04

杜明亮（1991-），男，河北唐山人，研究方向為動物營養(yǎng)。

李成會（1972-），男，河北廊坊人，碩士，教授，研究方向為動物營養(yǎng)研究及飼料資源開發(fā)。