降香中的酚性化合物

王 昊，梅文莉，楊德蘭，鐘惠民，戴好富*

1青島科技大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，青島 266042;2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室;3 海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室，?？?571101

降香(Dalbergia odorifera)是豆科(Leguminosae)檀屬(Dalbergia)植物降香檀(Dalbergia odorifera T.Chen)的樹干和根的干燥心材，為傳統(tǒng)中藥，具有行氣活血、止痛、止血的功效，用于脘腹疼痛、肝郁脅痛、胸痹刺痛、跌撲損傷、外傷出血［1］。降香檀原產(chǎn)海南，為海南特有植物，分布于白沙、東方、樂東和三亞等地。其心材降香主要含揮發(fā)油和黃酮類化合物。目前對降香揮發(fā)油及黃酮類成分的生理活性研究較多，其揮發(fā)油具有抗凝血、抗血栓、抗心肌缺血、抗菌等活性;其黃酮類化合物具有舒張血管、降血脂、抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抑制破骨細(xì)胞功能下降等活性［2-10］。本實驗對降香進(jìn)行化學(xué)成分的研究，從中分離得到10個酚性化合物，運(yùn)用波譜學(xué)方法分別鑒定為dalbergin (1)，7-O-methylvestitol (2)，syringaresinol (3)，2'，4'-dimethoxy-3，7-dihydroxyisoflavanone (4)，3'-hydroxy-8-methoxyvestitol (5)，2'，6-dihydroxy-4'-methoxy-2-arylbenzofuran (6)，3'-O-methylviolanone (7)，pinocembrin (8)，prunetin(9)和mucronulatol (10)。本次研究僅對化合物1進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制的活性測試，化合物2～5 首次從該植物中分離得到。結(jié)果表明，化合物1 為降香提取物的主要成分(含量占總提物0.28%)，具有乙酰膽堿酯酶抑制活性，研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)和利用降香提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

NMR 采用Brucker AV-500 型超導(dǎo)核磁儀(TMS內(nèi)標(biāo)，瑞士Bruker 公司);MS 采用Autospec-3000 質(zhì)譜儀;薄層色譜硅膠板、柱色譜硅膠(200～300 目，60～80 目)均為青島海洋化工廠產(chǎn)品;Sephadex LH-20 為Merck 公司產(chǎn)品;乙酰膽堿酯酶、碘化硫代乙酰膽堿、DTNB、他克林均購自Sigma;酶標(biāo)儀為PE公司EnVision。

降香心材于2010 年10 月購自海南省?？谑修r(nóng)貿(mào)市場，樣品標(biāo)本(No.20101009)經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所代正福副研究員鑒定為Dalbergia odorifera T.Chen，并存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

2 提取和分離

干燥并粉碎后的降香心材(8.4 kg)用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇室溫浸提三次，每次7 d，過濾得提取液。提取液經(jīng)減壓濃縮回收乙醇得到乙醇浸膏。乙醇浸膏用水分散后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。乙酸乙酯部分477 g 先采用硅膠(200～300目)減壓柱，以氯仿-甲醇(1∶0～0∶1)梯度洗脫，得18個流分(Fr.1-Fr.18)。Fr.3 以石油醚-丙酮(100∶1～1∶1)梯度洗脫共接收110個流分，流分54～105 結(jié)晶得化合物1(2.5 g);流分48～50 先過凝膠Sephadex-LH20(氯仿-甲醇1 ∶1)柱色譜，然后上硅膠柱(200～300 目)，石油醚-氯仿(8∶2)洗脫得化合物2(3.0 mg)。Fr.6 采用硅膠H 減壓柱，以石油醚-丙酮(50∶1～0∶1)梯度洗脫得128個流分。流分經(jīng)TLC 檢測合并后均先過過凝膠Sephadex-LH20(氯仿-甲醇1 ∶1)柱色譜。流分111～113 上硅膠柱(200～300 目)，石油醚-乙酸乙酯(3∶2)洗脫，結(jié)晶得化合物3(40.2 mg)。流分100～104 上硅膠柱(200～300 目)，氯仿-甲醇(60∶1)洗脫，結(jié)晶得化合物4(10.1 mg)。流分91-92 結(jié)晶得化合物5(20.3 mg)。流分82-86 結(jié)晶得化合物10(17.3 mg)，母液上硅膠柱(200～300 目)，氯仿-甲醇(100∶1)洗脫，結(jié)晶得化合物6(20.2 mg)。流分73～77 結(jié)晶得化合物7(10.1 mg)。流分43～46 上硅膠柱(200～300 目)，氯仿-甲醇(100∶1)洗脫得化合物8(15.3 mg)。流分56～60 結(jié)晶得化合物9(12.2 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 棕色晶體;ESI-MS m/z:267.0 ［MH］-，分子式為C16H12O4。1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:9.45 (1H，s，-OH)，7.57 (3H，m，H-2'，4'，6')，7.50 (2H，m，H-3'，5')，7.11 (1H，s，H-8)，6.82 (1H，s，H-5)，6.19 (1H，s，H-3)，3.89 (3H，s，7-OMe);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:160.5(C-2)，155.2 (C-4)，152.0 (C-7)，148.5 (C-9)，143.7 (C-6)，135.4(C-1')，129.6 (C-4')，128.9(C-3'，5')，128.4 (C-2'，6')，111.4 (C-3)，111.0(C-10)，110.5 (C-5)，100.6 (C-8)，56.3 (C-7-OMe)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］對照基本一致，故鑒定為dalbergin。

化合物2 黃色粉末;ESI-MS m/z:309.2［M +Na］+，分子式為C17H18O4。1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:7.02 (1H，d，J=8.3 Hz，H-6')，6.93(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.48 (1H，d，J=2.4 Hz，H-3')，6.45 (1H，dd，J=8.3，2.4 Hz，H-5')，6.39 (1H，dd，J=8.2，2.5 Hz，H-6)，6.35 (1H，d，J=2.5 Hz，H-8)，4.29 (1H，ddd，J=10.3，3.4，2.0 Hz，H-2a)，4.0 (1H，t，J=10.3 Hz，H-2b)，3.80 (6H，s，7，4'-OMe)3.55 (1H，m，H-3)，2.97(1H，dd，J=15.5，10.8 Hz，H-4a)，2.85 (1H，ddd，J=15.7，5.2，1.7Hz，H-4b);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:159.8 (C-2')，158.4 (C-4')，155.3 (C-7)，155.0 (C-9)，130.5 (C-5)127.7 (C-6')，122.0(C-1')，114.9 (C-10)，108.0 (C-6)，104.3 (C-5')，103.3 (C-8)，98.8 (C-3')，70.3 (C-2)，55.5 (C-4'，7-OMe)，31.7 (C-3)，30.5 (C-4)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］對照基本一致，故鑒定為7-O-methylvestitol。

化合物3 無色晶體;ESI-MS m/z:441.2［M +Na］+，分子式為C22H26O8。1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:8.20 (2H，s，-OH)，6.50 (4H，s，H-2，6，2'，6')，4.51 (2H，d，J=4.0 Hz，H-7，7')，4.06 (2H，m，H-9a，9'a)，3.67 (2H，m，H-9b，9'b)，3.65 (12H，s，3，5，3'，5'-OMe)，2.95 (2H，m，H-8，8');13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:148.0 (C-3，5，3'，5')，134.9 (C-4，4')，131.5 (C-1，1')，103.7 (C-2，6，2'，6')，85.4 (C-7，7')，71.2 (C-9，9')，56.1 (C-3，5，3'，5')，53.8(C-8，8')。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］對照基本一致，故鑒定為syringaresinol。

化合物4 白色粉末;ESI-MS m/z:339.1［M +Na］+，結(jié)合NMR 譜和ESI-MS 數(shù)據(jù)推斷分子式為C17H16O6。1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:7.81 (1H，d，J=8.7 Hz，H-5)，7.37 (1H，d，J=8.4 Hz，H-6')，6.51 (1H，dd，J=8.7，2.2 Hz，H-6)，6.45(1H，dd，J=8.7，2.4 Hz，H-5')，6.44 (1H，d，J=2.3 Hz，H-3')，6.32 (1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，4.80(1H，d，J=11.8 Hz，H-2a)，4.26 (1H，d，J=11.8 Hz，H-2b)，3.74 (3H，s，H-2'-OMe)，3.67 (3H，s，H-4'-OMe);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:191.9 (C-4)，163.4 (C-7)，163.2 (C-9)，161.4 (C-4')，158.2(C-2')，130.2 (C-5)，128.6 (C-6')，119.1 (C-1')，113.6 (C-10)，111.3 (C-6)，104.8 (C-5')，103.4(C-8)，99.8 (C-3')，74.3 (C-3)，73.8 (C-2)，55.7(C-2'-OMe)，55.5 (C-4'-OMe)。根據(jù)HMBC 信號，δH7.81 (1H，d，J=8.7 Hz，H-5)與δC191.9 (C-4)相關(guān)，表明氫在C-5 上;從δH7.37 (1H，d，J=8.4 Hz，H-6')與δC74.3 (C-3)相關(guān)，且在ROESY 上與δH4.80 (1H，d，J=11.8 Hz，H-2a)有NOE 效應(yīng)，表明氫在C-6'上。通過偶合常數(shù)可以判斷芳環(huán)上的取代位置為C-7，2'，4'。由HMBC 上δH3.74 (3H，s，H-2'-OMe)與δC158.2 (C-2')相關(guān)，δH3.67 (3H，s，H-4'-OMe)與δC161.4 (C-4')相關(guān)，而δH7.37 (1H，d，J=8.4 Hz，H-6')分別與δC158.2 (C-2')和δC161.4 (C-4')相關(guān)，在ROESY 上觀察到δH3.67(3H，s，H-4'-OMe)和δH3.74 (3H，s，H-2'-OMe)與δH6.44 (1H，d，J=2.3 Hz，H-3')的NOE 效應(yīng)，表明C-2'，4'被甲氧基取代而C-7 被羥基取代。以上可以鑒定化合物結(jié)構(gòu)為3，7-dihydroxy -2'，4'-dimethoxyisoflavanone。

化合物5 白色粉末;ESI-MS m/z:341.1［M +Na］+，結(jié)合NMR 譜和ESI-MS 數(shù)據(jù)推斷分子式為C17H18O6。1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:8.78(1H，s，7-OH)，8.48 (1H，s，3'-OH)，8.37 (1H，s，2'-OH)，6.47 (1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，6.39 (1H，d，J=8.6 Hz，H-6')，6.28 (1H，d，J=8.6 Hz，H-5')，6.20 (1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，4.30 (1H，dd，J=15.2，4.3 Hz，H-4a)，4.09 (1H，ddd，J=10.2，3.06，1.89 Hz，H-2a)，3.77 (1H，dd，J=10.2，10.2 Hz，H-2b)，3.59 (3H，s，H-4'-OMe)，3.51 (3H，s，H-8-OMe)，3.18 (1H，m，H-3)，2.75 (1H，dd，J=15.6，11.0 Hz，H-4b);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:148.8 (C-7)，147.9 (C-9)，147.3 (C-4')，144.0 (C-2')，135.7 (C-8)，133.8 (C-3')，123.8(C-5)，121.0 (C-1')，116.6 (C-6')，114.3 (C-10)，108.3 (C-6)，103.1 (C-5')，69.4 (C-2)，60.0 (C-8-OMe)，55.9 (C-4'-OMe)，31.4 (C-3)，30.1 (C-4)。根據(jù)HMBC 信號，δH6.47 (1H，d，J=8.4 Hz，H-5)與δC30.1 (C-4)相關(guān)，表明氫連接在C-5;δH6.39 (1H，d，J=8.6 Hz，H-6')與δC31.4 (C-3)相關(guān)，且δH3.18 (1H，m，H-3)與δC116.6 (C-6')相關(guān)表明氫連接在C-6'。通過偶合常數(shù)可以確定δH6.28 (1H，d，J=8.6 Hz，H-5')連接在C-5'，δH6.20(1H，d，J=8.4 Hz，H-6)連接在C-6。在ROESY上觀察到δH6.28 (1H，d，J=8.6 Hz，H-5')與δH3.59 (3H，s，H-4'-OMe)的NOE 效應(yīng)表明C-4'連接甲氧基;δH6.20 (1H，d，J=8.4 Hz，H-6)與δH8.78(1H，s，7-OH)有NOE 效應(yīng)，而δH8.78 (1H，s，7-OH)與δH3.51 (3H，s，H-8-OMe)有NOE 效應(yīng)，表明C-8 連接甲氧基。以上可以鑒定化合物結(jié)構(gòu)為3'-hydroxy-8-methoxyvestitol。

化合物6 白色粉末;1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:10.4 (1H，s，-OH)，9.50 (1H，s，-OH)，7.69 (1H，d，J=8.6 Hz，H-4)，7.36 (1H，d，J=8.3，H-6')，7.11 (1H，s，H-3)，6.92 (1H，br.s，H-3')，6.70 (1H，dd，J=8.3，2.0 Hz，H-5')，6.55(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，6.53 (1H，dd，J=8.6，2.4 Hz，H-5)，3.74 (3H，s，4'-OMe);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:159.9 (C-2)，155.5 (C-7a)，155.2 (C-6)，154.2 (C-4')，151.2 (C-2')，126.7(C-4)，121.6 (C-1')，120.8 (C-6')，112.0 (C-5')，110.7 (C-3a)，105.3 (C-5)，103.5 (C-3)，101.8

(C-7)，97.4 (C-3')，55.2 (C-4'-OMe)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］對照基本一致，故鑒定為2'，6-dihydroxy-4'-methoxy-2-arylbenzofuran。

化合物7 無色晶體;1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:7.68 (1H，d，J=8.6 Hz，H-5)，6.84 (1H，d，J=8.5 Hz，H-6')，6.74 (1H，d，J=8.5 Hz，H-5')，6.53 (1H，dd，J=8.5，2.2Hz，H-6)，6.35(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，4.50 (1H，dd，J=11.2，11.2 Hz，H-2a)，4.44 (1H，dd，J=11.2，5.5 Hz，H-2b)，4.14 (1H，dd，J=11.6，5.5 Hz，H-3)，3.77 (3H，s，3'-OMe)，3.73 (3H，s，2'-OMe)3.70(3H，s，4'-OMe);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:190.6 (C-4)，164.5 (C-7)，163.4 (C-9)，153.1 (C-4')，151.6 (C-2')，141.8 (C-3')，129.1 (C-5)，124.6 (C-1')，121.8 (C-6')，114.0 (C-10)，110.8(C-6)，107.8 (C-5')，102.5 (C-8)，70.7 (C-2)，60.6 (C-2'-OMe)，60.3 (C-4'-OMe)，55.9 (C-3'-OMe)，47.4 (C-3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］對照基本一致，故鑒定為3'-O-methylviolanone。

化合物8 白色晶體;1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:12.1 (1H，s，-OH)，10.8 (1H，s，-OH)，7.53 (2H，d，J=6.0 Hz，H-2'，6')，7.44 (2H，t，J=6.0 Hz，H-3'，5')，7.39 (1H，t，J=6.0 Hz，H-4')，5.94 (1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，5.91 (1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，5.58 (1H，dd，J=12.6，3.0，H-2)，3.26 (1H，dd，J=17.1，12.6 Hz，H-2a)，2.80(1H，dd，J=17.1，3.0 Hz，H-3b);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:196.0 (C-4)，166.8 (C-7)，163.6 (C-5)，162.8 (C-9)，138.8 (C-1')，128.6(C-3'，4'，5')，126.1 (C-2'，6')，101.9 (C-10)，96.0(C-6)，95.1 (C-8)，78.5 (C-2)，42.2 (C-3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］對照基本一致，故鑒定為pinocembrin。

化合物9 淺黃色粉末;1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:12.9 (1H，s，-OH)，8.35 (1H，s，H-2)，7.49 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2'，6')，6.99 (1H，d，J=8.4 Hz，H-3'，5')，6.39 (1H，d，J=1.5 Hz，H-8)，6.23 (1H，d，J=1.5 Hz，H-6)，3.79 (3H，s，7-OMe);13C NMR (DMSO-d6，125 MHz)δ:180.2 (C-4)，164.4 (C-7)，162.1 (C-5)，159.2 (C-4')，157.7(C-9)，154.3 (C-2)，130.3 (C-2'，6')，123.0 (C-3)，122.1 (C-1')，113.8 (C-3'，5')，104.6 (C-10)，99.1 (C-6)，93.8 (C-8)，55.2 (C-7-OMe)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］對照基本一致，故鑒定為prunetin。

化合物10 白色粉末;1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:9.22 (1H，s，-OH)，8.66 (1H，s，-OH)，6.86 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.68 (1H，d，J=8.6 Hz，H-5')，6.59 (1H，d，J=8.6 Hz，H-6')，6.29 (1H，dd，J=8.2，2.3 Hz，H-6)，6.20 (1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，4.10 (1H，dt，J=10.2，2.1 Hz，H-2a)，3.89 (1H，t，J=10.2 Hz，H-2b)，3.75(3H，s，4'-OMe)3.72 (3H，s，2'-OMe)，3.31 (1H，m，H-3)，2.81 (1H，dd，J=15.5，11.2 Hz，H-4a)，2.73 (1H，dd，J=15.6，3.7 Hz，H-4b);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:156.6 (C-7)，154.6 (C-9)，147.8 (C-2')，146.1 (C-4')，139.4 (C-3')，130.2 (C-5)，127.0 (C-1')，116.3 (C-6')，112.8(C-10)，108.1 (C-6)，107.6 (C-5')，102.6 (C-8)，69.8 (C-2)，60.4 (C-2'-OMe)，56.0 (C-4'-OMe)，31.4 (C-3)，31.0 (C-4)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］對照基本一致，故鑒定為mucronulatol。

4 乙酰膽堿酯酶抑制的活性測試

采用Ellman 方法［16］測定樣品的乙酰膽堿酯酶抑制活性。在96 孔酶標(biāo)板中依次加入110 μL PBS(0.1M pH=8.0)，10 μL 樣品溶液(1.0 mg/mL，DMSO)，40 μL AChE (0.10 U/mL，pH=8.0 PBS溶解稀釋)。4 ℃孵育20 min 后，加40 μL DTNB(6.25 Mm)和碘化硫代乙酰膽堿(6.25 mM)的等體積混合液。30 ℃孵育20 min 后，用酶標(biāo)儀在405 nm 下測定其吸光度值。

抑制率的計算公式:抑制率={［A對照-(A樣品-A空白)］/A對照}×100%，其中，對照組用10 μL DMSO 代替10 μL 樣品溶液;空白組用10 μL DMSO代替10 μL 樣品溶液，再用40 μL PBS 代替40 μL AChE。實驗以他克林為陽性對照，所有實驗重復(fù)3 次。

化合物1(50 μg/mL)對乙酰膽堿酯酶抑制率為30.36%，陽性對照他克林(0.08 (g/mL)對乙酰膽堿酯酶的抑制率為72.40%。實驗表明化合物1具有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性。

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