熒光法測定藥品中維生素B2含量的綜合型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

程春英， 尹學(xué)博

(南開大學(xué) 化學(xué)學(xué)院 化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心和分析科學(xué)研究中心，天津 300071)

0 引 言

培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力、科學(xué)研究能力、發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的能力，是高等教育的重要目標(biāo)，研究性、綜合型實(shí)驗(yàn)的開發(fā)和設(shè)計(jì)也因此成為高校教育研究的主題之一，并成為素質(zhì)教育和創(chuàng)新能力培養(yǎng)的重要載體[1]。通過研究性、綜合型實(shí)驗(yàn)不但讓學(xué)生熟練掌握教學(xué)中的知識(shí)點(diǎn)，同時(shí)可以激發(fā)學(xué)生的科研創(chuàng)新的理念、提高學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力[2-3]。

儀器分析實(shí)驗(yàn)的教學(xué)目是熟練使用儀器、了解儀器的構(gòu)造、掌握儀器的性能和使用方法。學(xué)生按照規(guī)定的程序操作并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告的做法已不能滿足激發(fā)學(xué)生求知欲的要求[4]。學(xué)生只是對(duì)已知實(shí)驗(yàn)過程的簡單重復(fù)和已知實(shí)驗(yàn)結(jié)論的簡單驗(yàn)證降低了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的效果[5-6]。機(jī)械單調(diào)的重復(fù)不能加深學(xué)生對(duì)儀器的原理、操作的掌握和創(chuàng)新思維的培養(yǎng)。

通過加入驗(yàn)證內(nèi)容，讓學(xué)生提出問題，并找到問題的答案成為研究性、綜合型實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)理念。即實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容需要體現(xiàn)學(xué)生對(duì)現(xiàn)有知識(shí)的思考、疑惑和求證；實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有知識(shí)的拓展應(yīng)用，并培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維和創(chuàng)新能力[1]。

基于上述思想，我們對(duì)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改革，發(fā)展研究性、綜合型實(shí)驗(yàn)，本文討論了熒光法測定維生素B2研究性、綜合型實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和探索，通過條件控制實(shí)驗(yàn)和藥片中維生素B2熒光分析方法的建立培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)研究的能力和創(chuàng)新思維[7]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

(1) 儀器。日本島津RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)；上海雷磁pHSJ-3F型pH計(jì)；安捷倫CARY-60型紫外-可見分光光度計(jì)；分析天平。

(2) 藥品。分析純維生素B2；醋酸；0.5 mol/L氫氧化鈉溶液；商品化維生素B2片劑。

(3) 溶液的配制。① 儲(chǔ)備液的配制。準(zhǔn)確稱取10.0 mg維生素B2，溶于適量的1%的醋酸溶液中，轉(zhuǎn)入1 000 mL容量瓶中，用1%的醋酸溶液定容至刻度，然后保存在棕色試劑瓶中，并置于陰暗處[8]。② 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。取5個(gè)25 mL的比色管，避光條件下，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.5%的醋酸稀釋至刻度，搖勻[8]。③ 樣品的處理。避光條件下，稱取維生素B2片劑一片的質(zhì)量為0.078 1 g。為獲得藥品中維生素B2的平均含量，將5片維生素B2研磨，再從研細(xì)的粉末中稱取一片的質(zhì)量0.078 1 g。將其溶解在50 mL 1%的醋酸溶液，超聲5 min使其溶解[9]，取出5 mL溶液用1%的醋酸溶液定容在1 000 mL的容量瓶中，置于陰暗處待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 學(xué)生課前預(yù)習(xí)，了解維生素B2的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

維生素B2又叫核黃素(riboflavin)，分子式為C17H20O6N4，結(jié)構(gòu)簡式如圖1所示[10]。是一種含核糖醇基的桔黃色的針狀晶體[11]，微溶于水、乙醇、氯仿等，易溶于醋酸，可溶于稀的氫氧化鈉和氯化鈉溶液[12]。

圖1 維生素B2的結(jié)構(gòu)簡式

酸性條件下的溶液中維生素B2較穩(wěn)定，耐熱、耐氧化，光照易分解，堿性條件下，維生素B2分解的更快。維生素B2在機(jī)體內(nèi)與ATP作用，可生成在代謝上有極其重要功用的幾種酶的輔酶[11]。

2.2 測試條件的選擇

2.2.1最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長的選擇

取醋酸酸化的維生素B2溶液(CB2=0.4 μg/mL)作熒光激發(fā)光譜圖和熒光發(fā)射光譜圖，求得維生素B2的最大激發(fā)和最大發(fā)射波長：λex=468.8 nm，λem=524.0 nm。

2.2.2熒光強(qiáng)度隨pH的變化

取CB2=10 μg/mL的溶液，選擇λex=468.8 nm，λem=524.0 nm，測定不同pH下B2溶液的熒光強(qiáng)度，其變化趨勢如圖2所示。酸性條件下，維生素B2有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，從pH 2.56開始熒光緩慢增強(qiáng)，并在pH 6.50熒光強(qiáng)度達(dá)到最大；隨后，熒光強(qiáng)度迅速降低，在pH 11時(shí)熒光幾乎消失[8]。因此，從熒光效率角度考慮，維生素B2應(yīng)選擇在近中性條件下進(jìn)行測定。

圖2 不同pH的維生素B2溶液的熒光強(qiáng)度變化曲線

2.2.3維生素B2穩(wěn)定性考察

熒光強(qiáng)度的變化提供了維生素B2穩(wěn)定性的直接證據(jù)。取維生素B2溶液(CB2=0.4 μg/mL)，選擇λex=468.8 nm，λem=524.0 nm，考察不同pH 4.5和6.5條件下熒光強(qiáng)度隨光照時(shí)間t的變化。變化曲線如圖3所示，可以看出隨光照時(shí)間增加，維生素B2的熒光強(qiáng)度逐漸降低，但pH 6.5時(shí)，變化幅度更大。證明了維生素B2的光學(xué)不穩(wěn)定性，而且酸性越弱，越容易發(fā)生光分解反應(yīng)。所以，維生素B2的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品應(yīng)避光保存。

2.3 分解機(jī)理初探

2.3.1光照前后維生素B2吸收光譜的變化

為給學(xué)生以直觀的印象，我們進(jìn)一步考察光照過程，維生素B2紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的變化，并提出維生素B2光分解的初步機(jī)理。取pH=2.56，C=10 μg/mL B2溶液，作不同光照時(shí)間的吸光光譜圖(見圖4)。B2在280、375和444 nm處有最大吸收[12-14]。但隨著光照時(shí)間的增加，各處的吸收峰逐漸降低，并在光照1 h后444 nm處吸收峰幾乎消失，同時(shí)在400 nm出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰。圖4結(jié)果表明維生素B2在光照作用下生成了新的物質(zhì)并導(dǎo)致最大吸收波長的移動(dòng)。

圖3 維生素B2的不同光照時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化曲線

圖4 pH 2.56,C=10 μg/mL的維生素B2溶液不同光照時(shí)間的吸光度光譜圖

2.3.2不同日照時(shí)間維生素B2的熒光光譜圖

取的維生素B2溶液(pH 4.5，C=0.6 μg/mL)，選擇λex=468.8 nm，作不同光照時(shí)間的熒光光譜圖。如圖5所示，隨著光照時(shí)間的增長，熒光強(qiáng)度逐漸變小，但最大發(fā)射波長沒有變化。結(jié)合紫外可見吸收光譜結(jié)果，我們可以得出維生素B2光分解的初步結(jié)論：在酸性條件，1%的醋酸溶液中，維生素B2發(fā)生光分解，并形成沒有熒光的產(chǎn)物。

圖5 pH 4.5，C=0.6 μg/mL的維生素B2溶液在不同光照時(shí)間的熒光光譜圖

2.4 藥片中維生素B2的測定

2.4.1干擾實(shí)驗(yàn)

根據(jù)藥片成分可知維生素B2藥片含有維生素B2和輔料淀粉；實(shí)驗(yàn)中選擇的熒光測定基質(zhì)是1 %醋酸溶液。建立維生素B2的熒光測定方法前，需要考察輔料淀粉和醋酸溶液對(duì)維生素B2測定的潛在干擾。如表1所示，淀粉懸濁液和飽和溶液在不同pH條件下均具有可以忽略的熒光，證明輔料淀粉不會(huì)干擾藥片中維生素B2的測定。同樣醋酸在λex=468.8 nm，λem=524.0nm的測定條件下，熒光強(qiáng)度僅為0.371。說明醋酸基質(zhì)不會(huì)干擾維生素B2的熒光測定。

表1 淀粉懸濁液和飽和淀粉溶液的比較

2.4.2藥品中維生素B2測定條件選擇

根據(jù)上面分析，雖然pH 6.5時(shí)，維生素B2的熒光強(qiáng)度最大，但此條件下維生素B2的分解速度較快，可導(dǎo)致較大的測定誤差。但從圖2可以看出，pH 4.5時(shí)，維生素B2的熒光強(qiáng)度雖較pH 6.5時(shí)略有降低，但圖3的結(jié)果表明pH 4.5時(shí)，維生素B2的穩(wěn)定性更高，所以我們選擇酸性較強(qiáng)的醋酸溶液(pH 4.5)進(jìn)行維生素B2標(biāo)準(zhǔn)液和樣品的溶解并用于樣品分析。為進(jìn)一步避免維生素B2的分解，標(biāo)準(zhǔn)液配制和樣品處理時(shí)選擇避光條件。為減少樣品處理過程中耗費(fèi)時(shí)間長帶來的誤差，也避免樣品中淀粉的干擾，將研磨樣品超聲溶解并離心沉淀除去不溶的淀粉。選擇多個(gè)藥片研磨后，然后稱取一個(gè)藥片的質(zhì)量更能保證結(jié)果可信度。

2.4.3標(biāo)準(zhǔn)溶液，工作曲線和樣品分析

選擇λex=468.8 nm，λem=524.0 nm調(diào)零后測試pH 4.5醋酸溶液配制的維生素B2的標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度(表2)，并作工作曲線(圖6)：

If=0.143+116.38C(R=0.999 9)

測得樣品溶液的濃度為0.449 μg/mL 折合每個(gè)藥片的維生素B2含量為4.49 mg，與藥片的標(biāo)示含量(5.0 mg)接近。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度值

圖6 維生素B2的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

3 結(jié) 語

(1) 傳統(tǒng)熒光法測定維生素B2含量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改革，在完成了教學(xué)任務(wù)的同時(shí)，提高了學(xué)生的自主性和能動(dòng)性。

(2) 新的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)增加了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，學(xué)生可熟練掌握儀器的性能和使用方法，并將pH計(jì)、紫外-可見分光光度計(jì)的使用并入其中。起到了綜合利用不同分析方法的效果，加深對(duì)不同分析方法的理解。

(3) 實(shí)驗(yàn)前，學(xué)生通過資料查閱并實(shí)現(xiàn)對(duì)測試條件的選擇，每一個(gè)步驟和過程都需要認(rèn)真思考，細(xì)心探索，培養(yǎng)了學(xué)生獨(dú)立思考和分析問題的能力。

(4) 從條件測試、干擾分析到樣品的避光處理，都使得學(xué)生將所學(xué)知識(shí)主動(dòng)的、多樣化的運(yùn)用到實(shí)踐中。每一步成功都代表著他們實(shí)驗(yàn)操作技能和解決問題能力的提高，使學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中接受創(chuàng)新思維的訓(xùn)練和創(chuàng)新能力的鍛煉[4]。真正實(shí)現(xiàn)了在實(shí)驗(yàn)中探索、提出問題、解決問題；在解決問題中發(fā)現(xiàn)、創(chuàng)新，并在創(chuàng)新中得到提高[15]。

(5) 使學(xué)生了解科學(xué)研究的嚴(yán)謹(jǐn)和實(shí)事求是，更讓他們知道團(tuán)隊(duì)合作的重要作用[16]。更重要的是這種方式起到從本科教學(xué)到科學(xué)研究的橋梁作用。

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