益母草注射液有效部位提取及其對(duì)凝血系統(tǒng)的影響研究?

趙小梅，彭 成 ,熊 亮，謝曉芳

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 610075)

近年來，文獻(xiàn)頻頻報(bào)道益母草注射液在臨床上預(yù)防產(chǎn)后出血療效顯著，但益母草屬于傳統(tǒng)中藥學(xué)的活血化瘀類藥?，F(xiàn)代藥理研究亦表明，其具有活血的作用，包括抗血小板聚集、抗凝、纖溶等活性[1～4]。益母草注射液作為具有代表性意義的成藥，用于產(chǎn)后出血主要取其具有收縮子宮的功效，但對(duì)其活血化瘀有效物質(zhì)基礎(chǔ)以及活血而不加重產(chǎn)后出血的作用機(jī)制尚無深入研究。因此，作者通過提取分離益母草注射液有效部位，深入探索其對(duì)凝血系統(tǒng)的影響及其作用機(jī)制，為益母草注射液二次開發(fā)或指導(dǎo)臨床安全用藥提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

10只健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量200±20 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(川)2008-11)。6只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200±20 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(川)2008-11)。

1.2 藥物

阿司匹林腸溶片由辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào)120529210)。

1.3 試劑

凝血酶原時(shí)間(PT，批號(hào)545487)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT，批號(hào)547163A)、纖維蛋白原(FIB，批號(hào)538043)及凝血酶時(shí)間(TT，批號(hào)42282)測(cè)定試劑均購(gòu)自德國(guó)SIEMENS公司。腺苷二磷酸(ADP，批號(hào)SLBB1854)、纖維蛋白原(Fibrinogen,批號(hào)F8630)、凝血酶(Thrombin, 批號(hào)T4648)均由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。瓊脂粉(Agar，JAPAN進(jìn)口分裝，分裝號(hào)89054120，購(gòu)自溶海生物技術(shù)(成都)有限公司)，PBS磷酸鹽緩沖液粉末(批號(hào)20130311，北京中杉金橋生物科技有限公司)。

1.4 儀器

日本SYSMEX株式會(huì)社CA-500型血凝儀，SC-2000血小板聚集測(cè)試儀，德國(guó)Heraeus臺(tái)式離心機(jī)Biofuge Stratos，Sanyo CO2培養(yǎng)箱MLO-15A。

2 方法

2.1 益母草注射液有效部位的制備

益母草注射液浸膏(1200 g)經(jīng)水分散溶解，上樣于D101型大孔吸附樹脂，以水-乙醇梯度洗脫，回收溶劑得水及15%、30%、45%、60%、95%乙醇洗脫部分。水洗脫部分(550 g)上樣于732型強(qiáng)酸型離子交換樹脂，以水及3 mol/L的NaCl溶液洗脫。水洗脫部分回收溶劑得非生物堿部分(300 g)。NaCl溶液洗脫液用NaOH調(diào)pH至6-7，回收溶劑，所得固形物加甲醇超聲提取過濾，殘?jiān)貜?fù)處理3次，合并濾液并回收溶劑得生物堿部分(220 g)。上述非生物堿部分、生物堿部分采用去離子水稀釋備用。

2.2 樣本采集與測(cè)定方法

2.2.1 體外凝血4項(xiàng)值的測(cè)定 取雌性SD大鼠10只，采用20%烏拉坦麻醉，經(jīng)股靜脈取血，每只3.6 ml，以3.8%枸櫞酸三鈉1∶9抗凝，經(jīng)3500 r離心10 min，可獲得2 mL左右血漿。取200 μL×7份，可平行進(jìn)行7組實(shí)驗(yàn)：陰性對(duì)照組、益母草注射液水溶性非生物堿部分高、中、低劑量組和益母草注射液水溶性生物堿部分高、中、低劑量組，于實(shí)驗(yàn)前分別加入20 μL相應(yīng)藥物，其中陰性對(duì)照組加入生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同劑量的實(shí)驗(yàn)藥物。經(jīng)充分混勻，37 ℃溫浴5 min。以全自動(dòng)血凝儀測(cè)定各組凝血4項(xiàng)指標(biāo)值，每組重復(fù)10次。

2.2.2 體外血小板聚集率的測(cè)定 取雄性SD大鼠6只，采用20%烏拉坦麻醉，經(jīng)股靜脈采血每只取血3.6 mL，3.8%枸櫞酸三鈉1∶9抗凝，25 ℃離心200 g×10 min，取上液作為PRP，剩余部分繼續(xù)離心2200 g×10 min作為PPP，采用同只鼠的PPP稀釋PRP至2.5～3.5×108/mL，每只鼠的PRP可平均分成300 μL×8份，平行進(jìn)行8組實(shí)驗(yàn)，即陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、益母草注射液水溶性非生物堿部分高、中、低劑量組和益母草注射液水溶性生物堿部分高、中、低劑量組。應(yīng)用SC-2000四通道血小板聚集儀，按Born比濁法[5]測(cè)定血小板聚集性。用PPP調(diào)零，取300 μl PRP分別加入20 μL相應(yīng)藥物，37 ℃溫浴5 min，然后加入5 μmol ADP，每次測(cè)試時(shí)間為5 min，記錄最大聚集率，計(jì)算血小板聚集抑制率=(對(duì)照管血小板最大聚集率-給藥管血小板最大聚集率)/對(duì)照管血小板最大聚集率×100%，每組重復(fù)6次。

2.2.3 體外纖維平板實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法[6]，用PBS緩沖液配制10 mg/mL纖維蛋白原溶液、1 U/mL凝血酶和100 U/mL尿激酶。取0.2 g瓊脂粉加20 mLPBS緩沖液加熱溶解，待溫度降至55～60 ℃時(shí)，取18 mL放入玻璃杯中，加入30 ℃的纖維蛋白原溶液1 mL，搖勻后再加入30 ℃的凝血酶溶液1 mL，搖勻后立即放入水平放置的90 mm玻璃培養(yǎng)皿中，待冷凝后采用7 mm中空打孔器打孔。在孔中加入相應(yīng)藥物50 μl，其中陰性對(duì)照組加入生理鹽水，陽性對(duì)照組加入尿激酶，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同劑量的益母草注射液水溶性非生物堿和益母草注射液水溶性生物堿。然后將平板放入37 ℃的培養(yǎng)箱，16 h后測(cè)定結(jié)果，每組重復(fù)6次。

3 結(jié)果

3.1 益母草注射液兩大部分體外給藥對(duì)凝血4項(xiàng)指標(biāo)的影響(表1)

表1 益母草注射液有效部位體外給藥對(duì)凝血四項(xiàng)的影響

注：n代表樣本量，與陰性對(duì)照組比較：△P<0.05，*P<0.01

益母草注射液水溶性非生物堿部分能明顯延長(zhǎng)PT和APTT，其水溶性生物堿部分能明顯縮短APTT，兩者均能明顯降低血纖維蛋白原含量和延長(zhǎng)TT。

3.2 體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果

表2顯示，益母草注射液兩大部分均具有明顯的抗ADP誘導(dǎo)血小板聚集作用，尤以益母草注射液水溶性非生物堿部分的抗血小板聚集作用更強(qiáng)。

3.3 體外纖維平板實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表3顯示，益母草注射液水溶性非生物堿部分具有明顯的纖溶活性，且呈明顯的量效關(guān)系，益母草注射液水溶性生物堿部分未見明顯的纖溶活性。

表2 益母草注射液有效部位體外給藥對(duì)ADP誘導(dǎo)血小板聚集的影響

注：與陰性對(duì)照組比較：△P<0.05，*P<0.01(n代表樣本量)

表3 益母草注射液有效部位體外給藥對(duì)纖維蛋白的溶解作用

注：n代表樣本量

4 討論

近年來，隨著人們對(duì)妊娠機(jī)體生理變化認(rèn)識(shí)的逐漸深入，研究發(fā)現(xiàn)在妊娠過程中孕婦表現(xiàn)為凝血功能逐漸增強(qiáng)、纖溶功能逐漸減弱的生理變化，血液呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，這樣一種生理變化能為產(chǎn)后快速有效地止血提供物質(zhì)基礎(chǔ)，但部分婦女可能出現(xiàn)病理狀態(tài)。病理性高凝狀態(tài)極易誘發(fā)DIC和血栓性疾病[7，8]，如妊娠期易栓癥及分娩后發(fā)生血栓的風(fēng)險(xiǎn)極度升高。因此，對(duì)于易栓癥患者在治療原發(fā)癥的同時(shí)，抗凝治療起著不可替代的作用[9，10]。但目前臨床上最常用的肝素易誘發(fā)嚴(yán)重出血，而對(duì)于易栓癥患者抗凝治療應(yīng)以產(chǎn)時(shí)不引起過度失血為目的[11]，因此迫切需要找到新型抗凝藥物。

本研究中發(fā)現(xiàn)，益母草注射液同時(shí)具有活血與止血作用，止血作用機(jī)制與縮短內(nèi)源性凝血時(shí)間有關(guān)，活血作用機(jī)制與延長(zhǎng)內(nèi)外源性凝血時(shí)間、抗血小板聚集和纖溶有關(guān)。目前的臨床報(bào)道表明，益母草注射液產(chǎn)后給藥并不增加產(chǎn)后出血量[12]，這種天然的配伍形式比較適合臨床預(yù)防產(chǎn)婦血栓性疾病和DIC發(fā)生。如能更好地協(xié)調(diào)兩大部分的配比，可為產(chǎn)科抗凝治療開辟新的局面。該提取分離方法對(duì)益母草注射液二次開發(fā)具有重要意義。

此外，本研究結(jié)果中，益母草注射液水溶性非生物堿部分和生物堿部分都能明顯降低血纖維蛋白原含量，但在纖維平板實(shí)驗(yàn)中后者卻未見明顯的纖溶活性，表明前者對(duì)已形成的纖維蛋白仍存在降解作用，而后者卻僅對(duì)纖維蛋白未形成前有作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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