三葉人字草對膠原誘導關(guān)節(jié)炎大鼠的治療及其抗氧化研究?

羅 丹,荊生龍，趙宏艷，許慧慧，周曉峰，肖 誠

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院臨研所，北京 100029；3.江西中醫(yī)學院，南昌 330004；4.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種原因不明的、慢性的、多發(fā)性的以關(guān)節(jié)對稱性損害為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，病理表現(xiàn)主要在于炎細胞浸潤、滑膜增生、血管翳形成以及關(guān)節(jié)軟骨和骨的侵蝕與破壞等。慢性炎癥反應的持續(xù)發(fā)展，是類風濕關(guān)節(jié)炎的主要病理過程[1]，因此抑制炎癥反應就能有效地控制RA的進展。

三葉人字草(Kummerowia striata(Thunb)Schindl，Ks)為豆科雞眼草屬雞眼草，潮汕地區(qū)別名稱為鹿含草，外地別名稱為雞眼草、馬帚、蒼蠅翅等。為一年生草本，葉柄極短、一柄三葉，葉脈呈人字形排列，拉斷葉片裂口即成人字形，一年之中除冬季外，其他季節(jié)均可采摘。Ks味甘淡，入肺腎經(jīng)，性微涼、無毒，主治咳嗽胸痛、暑熱口渴、小便尿血、急性胃腸炎、夜盲癥等。現(xiàn)代研究表明，Ks具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，對炎癥后期的結(jié)締組織增生具有良好的抑制作用[2]。不同溶劑的Ks提取物均具有良好的抗氧化性，其總酚含量與DPPH 自由基清除能力有關(guān)[3]。然而目前尚未發(fā)現(xiàn)Ks對RA治療的相關(guān)報道，因此本研究試圖通過膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(collagen- induced arthritis，CIA)大鼠模型，探討其對RA的影響及共作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物和藥物

選用健康SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量160～180 g，購于軍事科學院(合格證號SCXK(京)2007-004)。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所動物房(許可證號SYXK(京)2010-0032)。

Ks購自廣州清平藥材市場，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥學院中藥標本中心鑒定為豆科植物Ks的全草干品。稱取干燥全草加水煎煮1 h，共煎煮3次，合并煎液過濾，濾液濃縮至每100 ml相當于原生藥160 g，置于冰箱冷藏備用，臨用時用生理鹽水稀釋成所需濃度。

1.2 實驗儀器和試劑

LEICA CTR6000 顯微鏡(德國Leica 公司產(chǎn)品)；Leica-Qwin圖像分析儀系統(tǒng)(德國Leica 公司產(chǎn)品)；丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)的測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號20130128、20130123、20130124)；牛II型膠原購于美國Chondrex公司(批號101512)；不完全弗氏佐劑購于美國Chondrex公司(批號100106)。

2 方法

2.1 分組與建立模型

將50只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組(N組)、模型組(M組)、三葉草低劑量組(KsL組)、三葉草中劑量組(KsM組)、三葉草高劑量組(KsH組)，每組10只。除N組外，其余動物制備成CIA模型。

造模方法參照[4]如下：將濃度為2 mg/ml的牛II型膠原與等體積的不完全弗氏佐劑用均質(zhì)器混合均勻，操作過程均在冰上進行。大鼠的尾根部75%酒精消毒后，于尾根部皮下注射上述終濃度為2 mg/mL的乳劑0.2 ml，N組大鼠同部位注射等體積的生理鹽水。7 d后，在相同部位再次免疫，劑量為0.1 ml。第2次免疫后約1周左右出現(xiàn)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。

2.2 給藥

于第2次免疫后1周，各給藥組大鼠分別按70 kg成人等效劑量給予Ks低劑量(4 g生藥/kg)、中劑量(8 g生藥/kg)、高劑量(16 g生藥/kg)，每天1次灌胃給藥；N組大鼠給予等量生理鹽水。給藥時間均固定在每天9時，給藥周期為4周。

2.3 關(guān)節(jié)腫脹度的評定

于第1次免疫后14 d每隔5 d即第1、6、11、16、21天和第26天對大鼠左右后足關(guān)節(jié)紅腫程度進行關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis Index，AI)評定，累積評分最高為8分，標準如下[5～7]：0分：無關(guān)節(jié)炎；1分：個別足趾發(fā)紅、腫脹；2分：大部分足趾及足底腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下全部腫脹；4分：腫脹累及踝關(guān)節(jié)以上且不能負重。

2.4 大鼠踝關(guān)節(jié)病理學觀察

取大鼠的踝關(guān)節(jié)多聚甲醛固定36 h后入10% EDTA脫鈣，酒精逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色。光鏡下觀察踝關(guān)節(jié)的病理學改變，包括滑膜增生、血管翳生成、炎細胞浸潤、軟骨及骨的病理改變等。

2.5 檢測血清MDA、T-AOC、T-SOD

按照試劑盒說明書操作，硫代巴比妥酸法測定MDA，鐵還原法測定T-AOC，羥胺法測定T-SOD。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 大鼠AI的變化

表1顯示，隨著給藥時間的延長，3個給藥組大鼠AI積分都明顯下降。從第16天開始， KsH組的AI積分與M組比較顯著降低(P<0.01)，其作用一直持續(xù)到第26天(P<0.01)。與M組比較，KsL組、KsM組也有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。

表1 各組大鼠AI 的變化

注：與N組比較：*P<0.05，**P<0.01；與M組比較：#P<0.05，##P<0.01(下同)

4.2 大鼠踝關(guān)節(jié)的病理學改變

病理學圖片顯示，N組關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)、軟骨和關(guān)節(jié)周圍軟組織未見異常，滑膜組織無增生。M組關(guān)節(jié)內(nèi)可見明顯的滑膜組織增生，淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。關(guān)節(jié)面完全破壞，增生的滑膜和血管形成血管翳浸入軟骨或骨組織，軟骨表層可見明顯的壞死，關(guān)節(jié)腔內(nèi)也可見壞死剝脫的軟骨和滑膜組織。KsL組滑膜組織增生、炎性細胞浸潤及關(guān)節(jié)破壞無明顯改善。KsM組滑膜組織的增生和炎性細胞浸潤略有減少，可見關(guān)節(jié)面明顯的破壞；KsH組滑膜增生和滑膜組織水腫明顯減輕，淋巴細胞和巨噬細胞浸潤減少，血管新生顯著減少，血管內(nèi)膜增厚減輕，少見血管翳形成，關(guān)節(jié)面破壞減輕。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)的病理變化(A)N組；(B)M組；(C)KsL組；(D)KsM組；(E)KsH組。(HE，100×)

4.3 大鼠血清MDA含量、T-AOC和T-SOD活性的變化

表2顯示，與N組比較，M組中的MDA含量、T-AOC和T-SOD活性差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與M組比較，各治療組MDA含量明顯降低(P<0.05)，KsH組的T-AOC活性顯著升高(P<0.05)，KsM組、KsH組T-SOD的活性顯著升高(P<0.01)，但各治療組之間差異無統(tǒng)計學意義。

表2 各組大鼠血清MDA含量、T-AOC和T-SOD活性的變化

5 討論

RA是影響多個關(guān)節(jié)的慢性病，滑膜組織的增生和炎性細胞的浸潤又是其主要病理特點，由此而形成的血管翳能對受影響關(guān)節(jié)的軟骨和骨造成不可逆轉(zhuǎn)的破壞。而本研究中所采用的CIA大鼠模型與人類RA在許多方面相似，因此它被普遍用作中藥治療RA的研究模型[4, 8]。

氧自由基是細胞代謝的產(chǎn)物，在生理條件下發(fā)揮第二信使的作用，但在RA存在時，氧自由基會過度表達，對細胞組織等產(chǎn)生毒性作用，是造成組織損傷的主要因素之一，也會影響到RA病人對治療的反應[9～11]。SOD是體內(nèi)抗氧自由基的重要生理防線，能夠有效地清除體內(nèi)自由基，對體內(nèi)的氧化/抗氧化系統(tǒng)穩(wěn)定有著十分重要的作用。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化而形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物與蛋白中賴氨酸殘基反應產(chǎn)生免疫原性分子，從而加劇炎癥，而較長鏈的多不飽和脂肪酸尤其能增強脂質(zhì)過氧化反應和導致細胞損害的氧化應激[12]，而對T-AOC的檢測又能客觀反映機體內(nèi)抗氧化酶類的濃度。因此，增強抗氧化能力將能有效緩解RA[4]。而現(xiàn)代研究證實，Ks中黃酮、多糖、氨基酸和多酚具有較強清除自由基的能力，對DPPH 自由基和羥自由基的清除率表現(xiàn)為顯著的量效關(guān)系[13]。Ks對IgA腎病模型也具有很好的抗氧化活性，能夠清除自由基，提高抗氧化酶活力[14]。

在本研究中，觀察到M組的血清MDA含量明顯升高，同時降低了血清T-AOC和T-SOD活性，具有顯著的氧化效應，而關(guān)節(jié)的AI值和病理學圖片也顯示關(guān)節(jié)的炎癥程度較重，相反，經(jīng)Ks治療后，關(guān)節(jié)的炎癥程度得到降低，尤其KsH組抗氧化效果明顯，對CIA模型能降低其MDA含量，提升T-AOC和T-SOD活性，關(guān)節(jié)的病理學圖片顯示滑膜組織的增生和炎性細胞的浸潤減少，軟骨及骨損傷等也出現(xiàn)明顯緩解。因此本研究結(jié)果提示，Ks可能通過有效的抗氧化效應，對抗氧自由基來達到一定的緩解和治療RA的目的，其具體機制值得進一步研究。

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