通心絡(luò)下調(diào)RAGE-MAPK信號(hào)通路拮抗AGEs 誘導(dǎo)的人內(nèi)皮祖細(xì)胞內(nèi)皮分化異常

武雙平，賀治青，袁國(guó)強(qiáng)，王永恒，梁 春

(1．河北以嶺醫(yī)院，石家莊 050091；2．第二軍醫(yī)大學(xué)附屬上海長(zhǎng)征醫(yī)院，上海 200003)

內(nèi)皮祖細(xì)胞(human endothelial progenitor cells, hEPCs)作為內(nèi)源性血管修復(fù)的重要介導(dǎo)細(xì)胞[1, 2]，其作用和調(diào)控分化等生理特性一直是人們研究的熱點(diǎn)，從他汀類藥物的促hEPCs動(dòng)員到在體捕獲hEPCs促進(jìn)支架內(nèi)再內(nèi)皮化的新型支架系統(tǒng)的問世[3]，無不彰顯hEPCs在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)血管病變損傷后修復(fù)的重要作用，但在糖尿病等病理環(huán)境中hEPCs的功能和狀態(tài)發(fā)生改變。我們前期的研究證實(shí)，糖尿病的重要致病因素——晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)可通過激活RAGE-MAPK信號(hào)通路導(dǎo)致hEPCs功能異常，上述病理作用可部分被通心絡(luò)(tongxinluo, TXL)所阻斷。而現(xiàn)有大量研究證據(jù)提示，除了自身增殖、遷移和分泌功能，內(nèi)皮分化是其hEPCs介導(dǎo)內(nèi)源性血管修復(fù)的另一重要生理基礎(chǔ)[4]。因此，本研究旨在觀察TXL對(duì)AGEs誘導(dǎo)的hEPCs內(nèi)皮分化異常的保護(hù)作用及其相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

通心絡(luò)超微粉由石家莊以嶺藥業(yè)公司提供；淋巴細(xì)胞分離液、FITC標(biāo)記荊豆凝集素(FITC-UEA-1)及MAPK信號(hào)通路激動(dòng)劑購自美國(guó)Sigma公司；蛇皮透析膜、超濾管、Accutase酶和人纖連蛋白均購自美國(guó)Millipore公司；RAGE抗體、Taqman熒光探針、定量PCR試劑、胎牛血清和Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL)購自美國(guó)Life公司；內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑購自廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司；流式細(xì)胞抗體購自美國(guó)Biolegend公司；EGM-2培養(yǎng)基及核電轉(zhuǎn)試劑購自德國(guó)Lonza公司。

1.2 外周血hEPCs的分離培養(yǎng)和鑒定

取健康志愿者外周血50 ml，經(jīng)密度差異離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，種植于預(yù)先包被人纖連蛋白的10 cm大皿中，給予EGM2培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)21 d后可見hEPCs呈鵝軟石樣增殖，分別通過FITC標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)和Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍譊il-ac-LDL以及流式細(xì)胞鑒定其純度。

1.3 晚期糖基化終產(chǎn)物制備

取人血清白蛋白，將其按照1 mg/ml濃度與葡萄糖溶液混勻后共置于37℃細(xì)胞孵箱中，按照文獻(xiàn)報(bào)告共孵育60 d，孵育結(jié)束后通過過夜透析方法去除葡萄糖，并經(jīng)超濾濃縮分裝于-80℃冰箱備用。

1.4 干預(yù)分組

分為對(duì)照組、AGEs干預(yù)組(200 μg/ml)、TXL干預(yù)組(250、500、750 μg/ml，溶于DMSO中，并經(jīng)鱟實(shí)驗(yàn)內(nèi)毒素檢測(cè)陰性)、TXL預(yù)先干預(yù)30 min后再給予AGEs刺激組、RAGE過表達(dá)+TXL+AGEs干預(yù)組以及MAPK信號(hào)通路激動(dòng)劑(預(yù)先激動(dòng)30 min)+TXL+AGEs干預(yù)組。

1.5 hEPCs過表達(dá)RAGE

使用Accutase酶(美國(guó)ebioscience公司)消化貼壁細(xì)胞，將其與攜帶GFP熒光標(biāo)記的過表達(dá)RAGE受體的質(zhì)粒以及配套核電轉(zhuǎn)試劑混勻，按照儀器使用說明經(jīng)Nucleofector核電轉(zhuǎn)儀(德國(guó)amaxa公司)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染3 d后經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)蛋白電泳分析RAGE過表達(dá)水平。

1.6 hEPCs的體外內(nèi)皮分化評(píng)估

使用Accutase酶消化收集貼壁細(xì)胞，種植于預(yù)先準(zhǔn)備好的matrigel膠(美國(guó)BD公司)并給予不同干預(yù)，置于37℃度細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)2 h后倒置顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J軟件分析體外管型形成水平，從而反映hEPCs體外內(nèi)皮化程度。此外，干預(yù)結(jié)束后使用trizol抽取細(xì)胞mRNA，采用Taqman探針法經(jīng)熒光定量PCR分析細(xì)胞表達(dá)vWF水平，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 hEPCs鑒定

體外培養(yǎng)21 d后的hEPCs鏡下呈鵝軟石樣排布，經(jīng)Accutase酶消化后能夠穩(wěn)定傳代，同時(shí)FITC-UEA-1和Dil-acLDL雙染色陽性，流式細(xì)胞分析證實(shí)細(xì)胞高表達(dá)CD34、CD73、CD105、CD146，但KDR、CD14、CD45和HLA-DR陰性，提示成功獲得人外周血來源EPCs可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 TXL促進(jìn)hEPCs體外內(nèi)皮分化

給予不同濃度的TXL干預(yù)hEPCs，發(fā)現(xiàn)TXL可顯著提高h(yuǎn)EPCs內(nèi)皮分化程度，表現(xiàn)為體外管型形成能力增強(qiáng)，同時(shí)vWF表達(dá)水平顯著升高(圖1A-C)，以500 μg/ml作用最為顯著，進(jìn)一步提高濃度并不能增強(qiáng)其促內(nèi)皮分化的作用(P<0.05)，故此后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用該濃度作為TXL的干預(yù)劑量。

圖1 TXL對(duì)hEPCs體外內(nèi)皮分化的影響注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與250μg/ml TXL干預(yù)組比較：?P<0.05

2.3 TXL通過RAGE-MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)拮抗AGEs介導(dǎo)的hEPCs內(nèi)皮分化異常

200 μg/ml的AGEs可顯著抑制hEPCs的體外內(nèi)皮分化，該病理作用可被預(yù)先TXL干預(yù)30 min所部分阻斷之前的研究表明，RAGE-MAPK信號(hào)通路的激動(dòng)參與了AGEs的病理作用，因此通過預(yù)先過表達(dá)RAGE或給予MAPK信號(hào)通路激動(dòng)劑(ERK激動(dòng)劑叔丁基氫醌或p38 MAPK激動(dòng)劑U-46619)處理hEPCs，觀察上述信號(hào)通路對(duì)于TXL保護(hù)作用的影響發(fā)現(xiàn)，預(yù)先激動(dòng)上述信號(hào)通路明顯減弱TXL的保護(hù)作用(圖2)，提示TXL是通過下調(diào)RAGE-MAPK信號(hào)通路進(jìn)而拮抗AGEs誘導(dǎo)hEPCs內(nèi)皮分化異常。

圖2 TXL經(jīng)RAGE-MAPK信號(hào)通路拮抗AGEs誘導(dǎo)hEPCs體外內(nèi)皮分化異常注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與200μg/ml AGEs干預(yù)組比較：?P<0.05；與500 μg/ml TXL+200 μg/ml AGEs干預(yù)組比較：&P<0.05

3 討論

通心絡(luò)作為一種可顯著抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展的復(fù)方中藥，已在臨床廣泛應(yīng)用。通心絡(luò)由人參、水蛭、土鱉蟲、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、降香、冰片等藥物組成，具有益氣活血、通絡(luò)止痛的功效。現(xiàn)代藥理研究表明，人參具有抗氧化和改善血管內(nèi)皮功能作用，水蛭具有抗凝和降血脂作用，全蝎、蜈蚣、蟬蛻則具有改善血管內(nèi)皮功能、解除血管痙攣的作用。大量研究證實(shí)，通心絡(luò)可通過多種途徑延緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展，其中包括促進(jìn)泡沫細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)、加快損傷內(nèi)皮修復(fù)和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)等[5～7]。我們前期的研究證實(shí)，通心絡(luò)可顯著提高體外內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移和分泌功能，其作用呈劑量依賴性[8]。同時(shí)臨床研究也發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)可提高冠心病患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞含量[9]。除上述功能外，內(nèi)皮分化是內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)內(nèi)源性血管損傷后修復(fù)的重要機(jī)制之一，因此本研究著重評(píng)估通心絡(luò)對(duì)于內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外內(nèi)皮分化作用及其機(jī)制。

糖尿病作為冠心病的等危癥，中醫(yī)學(xué)將其稱為“消渴癥”，主要癥狀是口渴、多飲、多食、多尿等，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)。尤以我國(guó)發(fā)病人群為重，呈現(xiàn)發(fā)病年齡提早和臨床控制率差等諸多問題，其血管病變較單純冠心病患者更為彌散且穩(wěn)定性差等臨床特點(diǎn)，是現(xiàn)階段嚴(yán)重危害人民群眾身心健康的重大社會(huì)問題。糖尿病導(dǎo)致血管損傷的致病因素除外血糖，晚期糖基化終產(chǎn)物也是不可忽視的病因，特別是隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，大量研究證實(shí)，AGEs的病理作用較高血糖持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，可從多種機(jī)制引發(fā)細(xì)胞和組織功能異常。我們的前期研究證實(shí)，AGEs可導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡、增殖降低，該病理作用主要是通過異常激活RAGE-MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[10]，TXL可部分拮抗AGEs的病理作用[11]。

本研究證實(shí)，TXL自身既可顯著提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外內(nèi)皮分化，同時(shí)還可通過下調(diào)RAGE-MAPK信號(hào)通路對(duì)抗AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮分化異常，這可能是TXL發(fā)揮抗糖尿病血管動(dòng)脈粥樣硬化的新機(jī)制之一?，F(xiàn)今冠心病的治療策略已有單純?nèi)芩ê退幬锔蓴_全面進(jìn)入支架時(shí)代，而在支架時(shí)代如何降低支架內(nèi)血栓形成成為當(dāng)務(wù)之急，由此人們開發(fā)了藥物涂層支架，但隨之而來又出現(xiàn)了支架內(nèi)內(nèi)皮延遲愈合等問題?；趦?nèi)皮祖細(xì)胞可在體動(dòng)員并在損傷血管局部分化的生物學(xué)特性，內(nèi)皮祖細(xì)胞捕獲支架在臨床應(yīng)用中取得較好的療效[12～14]，但該支架存在費(fèi)用較高等問題。由本研究的結(jié)果是否可以猜測(cè)TXL可加速裸金屬支架或者藥物涂層支架內(nèi)皮覆蓋，從而從根本上降低支架內(nèi)管腔丟失，這方面仍需進(jìn)一步的臨床深入研究。

[1] Castejon R, Jimenez-Ortiz C, Valero-Gonzalez S,et al． Decreased circulating endothelial progenitor cells as an early risk factor of subclinical atherosclerosis in systemic lupus erythematosus[J]. Rheumatology，2014， 53:631-638.

[2] Ruan C, Shen Y, Chen R, et al. Endothelial progenitor cells and atherosclerosis[J]. Frontiers in Bioscience，2013， 18:1194-1201.

[3] Ho HH, Chow WH, Ko LY, et al. Successful use of endothelial progenitor cell capture stent for treatment of left main coronary artery disease before non-cardiac surgery for abdominal aortic aneurysm[J]. International Journal of Cardiology，2010， 143:e27-29.

[4] Zhang L, Xu Q． Stem/Progenitor cells in vascular regeneration[J]. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology，2014， 34:1114-1119.

[5] Chen ZQ, Hong L, Wang H．Effect of tongxinluo capsule on platelet activities and vascular endothelial functions as well as prognosis in patients with acute coronary syndrome undergoing percutaneous coronary intervention[J]．Chinese journal of integrated traditional and Western medicine，2011， 31:487-491.

[6] Guan QG, Zeng DY, Sun XZ．Inhibitory effect and acting mechanism of Tongxinluo on IL-1beta-mediated coronary intimal hyperplasia and 5-hydroxytryptamine-induced coronary vasospasm in small swine[J]. Chinese journal of integrated traditional and Western medicine，2008， 28:627-631.

[7] 梁小衛(wèi), 孫承波, 王華, 等． 通心絡(luò)體外促進(jìn)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007， 6:598-601.

[8] 苗旺, 劉恒方, 楊期東, 等． 通心絡(luò)對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊患者內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力的影響[J]. 中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2010， 15:44-45.

[9] Sun C, Liang C, Ren Y, Zhen Y, et al. Advanced glycation end products depress function of endothelial progenitor cells via p38 and ERK 1/2 mitogen-activated protein kinase pathways[J]. Basic research in cardiology,2009, 104:42-49.

[10] 孫承波, 梁春, 吳宗貴, 等. 通心絡(luò)對(duì)晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞存活的影響及其機(jī)制[J]. 上海醫(yī)學(xué)，2008， 10:711-714.

[11] Tan A, Farhatnia Y, Goh D, et al. Surface modification of a polyhedral oligomeric silsesquioxane poly(carbonate-urea) urethane (POSS-PCU) nanocomposite polymer as a stent coating for enhanced capture of endothelial progenitor cells[J]. Biointerphases,2013, 8:22.

[12] Yu Z, Zhu H, Lu S, et al. Accelerated endothelialization with a polymer-free sirolimus-eluting antibody-coated stent. Journal of materials science[J]. Materials in medicine,2013, 24:2601-2609.

[13] Haude M, Lee SW, Worthley SG, et al. The REMEDEE trial: a randomized comparison of a combination sirolimus-eluting endothelial progenitor cell capture stent with a paclitaxel-eluting stent. JACC[J]. Cardiovascular interventions,2013, 6:334-343.

[14] Scacciatella P, D’Amico M, Pennone M, et al. Effects of EPC capture stent and CD34+ mobilization in acute myocardial infarction[J]. Minerva cardioangiologica,2013, 61:211-219.