知母寧對阿霉素致乳鼠心肌細胞損傷的保護作用機制研究

代 淵,胡 勇,巨少華,任香怡

(成都中醫(yī)藥大學(xué),成都 611137)

阿霉素(Doxorubicin, Dox)作為一種重要的抗腫瘤藥物，通過插入DNA螺旋、抑制拓撲異構(gòu)酶II，并抑制DNA卷曲的剪切及共價聯(lián)結(jié)，以抑制細胞修補、促進細胞凋亡，被臨床廣泛用于各種腫瘤的治療，如乳腺癌與肺癌等[1]。同時研究表明，阿霉素也可產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)，如過氧化氫和超氧化物陰離子自由基等，通過這種方式也可誘導(dǎo)基于線粒體氧化損傷的腫瘤細胞死亡[2]。目前也認為，阿霉素的毒副作用也與這一氧化應(yīng)激損傷有密切關(guān)系，如其引起的心肌肥大、充血性心力衰竭、心律不齊及骨髓抑制毒性等[3]，因此抗氧化劑的合并用藥對緩解阿霉素的相關(guān)毒性具有重要作用。國內(nèi)外也進行了大量的研究，如研究證實β-細辛醚[4]、木犀草苷[5]、黃芪苷Ⅳ[6]、金絲桃苷[7]均可減輕阿霉素的心肌毒性。

知母寧(Chinonin,Chi)又名芒果苷，屬于多酚類化合物，來源于漆樹科植物芒果樹(Mangifera indica)、扁桃樹(Mangifera persiciformis)的葉、果實和樹皮、百合科知母(Anemarrhena asphodeloides)葉及龍膽科植物東北龍膽 (Gentiana manshurica)根莖等，被證實具有明確的抗氧化作用[8～11]，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、保健品。因此，應(yīng)用知母寧對抗阿霉素所致心臟毒性的相關(guān)研究具有重要的應(yīng)用與理論價值。早期研究確已證實，知母寧能對抗阿霉素體外引起大鼠心臟線粒體丙二醛(MDA)的生成、ATP酶的活性喪失及線粒膜流動性降低[10]，也能保護線粒體細胞色素C氧化酶的相關(guān)功能[11]，從而起到一定的解毒作用。但氧化應(yīng)激僅為毒性啟動的首發(fā)環(huán)節(jié)，其引起的炎癥與凋亡通路活化是導(dǎo)致阿霉素最終心肌細胞損傷的直接病理誘因，相關(guān)研究目前未見報道。因此，本文觀察了知母寧對阿霉素致乳鼠心肌細胞的保護作用，并觀察了其對調(diào)控細胞凋亡的c-jun 氨基末端激酶(c-jun N terminal kinase, JNK)通路及其磷酸化水平、調(diào)控相關(guān)炎癥介質(zhì)表達的核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor of kappa B, NF-κB)通路蛋白表達的影響，以探討其相應(yīng)的細胞保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新生1～3 d的SD大鼠，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 藥物及試劑

阿霉素為深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；知母寧購自成都曼徹斯生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自普利萊基因技術(shù)有限公司；NF-κB p65、phospho-p65、JNK、phospho-JNK抗體購自Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗購自Santa Cruz公司。

1.3 實檢主要儀器

BIORAD Mini-PROTEAN小型垂直電泳系統(tǒng)。

2 方法

2. 1 細胞培養(yǎng)

新生1～3 d的SD乳鼠心臟，經(jīng) 0. 125% 胰蛋白酶分解消化4次，離心、洗滌后加入含 10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，差速貼壁法于 37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng) 2 h。將富含心肌細胞的培養(yǎng)液再次接種于含 10% 胎牛血清、1 μmol·L-1阿糖胞苷的高糖DMEM 中，細胞密度約為 5×105/L。24 h 換液去除阿糖胞苷，72 h 后細胞達融合狀態(tài)，取生長狀態(tài)佳者加干預(yù)藥物，各組12只。

2.2 分組及給藥

空白對照組加入含10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基； Dox模型組加入Dox(培養(yǎng)液配制Dox濃度為 2 mg·L-1); Dox+知母寧低、中、高劑量組(2、8、16 mg·L-1)。以上各組均于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.3 指標檢測

MTT 檢測細胞存活率 Dox損傷培養(yǎng)細胞 24 h，棄去上清液每孔加入20 μL MTT溶液，37 ℃孵育 4 h，棄去上清加入DMSO 150 μL，振搖15 min。490 nm下檢測各孔吸光度(A)，以下式(實驗組吸光度/對照組吸光度) ×100%計算存活率。

Western blotting法檢測 NF-κB和JNK磷酸化水平:各實驗組心肌細胞給予不同的處理后，棄細胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的 PBS 洗 2 次，加入細胞裂解液冰上靜置 30 min，收集細胞裂解液，12000 r/min 離心 30 min取上清，采用 BCA 法進行蛋白定量。取等量總蛋白經(jīng) SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。用 5% 脫脂奶粉封閉 1.5 h，隨后加入抗 p65(1∶1000)、 p-p65 抗體(1∶1000)、抗JNK (1∶400)和 p- JNK (1∶400)，4 ℃ 過夜，PVDF膜用 TBST 洗 3 次，10 min/次。與辣根過氧化物酶標記的第二抗體反應(yīng)后，ECL 顯色，暗室曝光到 X 線片上，Image J分析圖像灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 心肌細胞存活率

表1顯示，與空白對照組比較，Dox損傷后心肌細胞存活數(shù)明顯下降(P<0. 05)；與阿霉素處理組比較，知母寧高劑量組均能增加心肌細胞活力，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

組別例數(shù)心肌細胞存活率空白對照組120.6577±0.0211阿霉素處理組120.2543±0.0079阿霉素+低劑量知母寧組120.2687±0.0087阿霉素+中劑量知母寧組120.2797±0.0085阿霉素+高劑量知母寧組120.2982±0.0088

4.2 知母寧抑制 DOX 對心肌細胞磷酸化 NF-κB p65表達的上調(diào)作用

圖1顯示，2 mg·L-1DOX 處理后能顯著增加p-p65的表達水平(P<0. 01)。與模型組比較，知母寧高劑量組可有效抑制p65磷酸化，使p65的磷酸化水平降低21.75%。而低、中劑量組雖有降低p65磷酸化的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 知母寧抑制阿霉素引起心肌細胞磷酸化NF-κB p65(p-p65)表達的上調(diào)作用注：與空白對照組比較:*P<0.05；與阿霉素處理組比較:#P<0.05

圖2 知母寧抑制阿霉素引起心肌細胞磷酸化NF-κB p65(p-p65)表達的上調(diào)作用注：與空白對照組比較:*P<0.05；與阿霉素處理組比較:#P<0.05

4.3 知母寧抑制 DOX對心肌細胞磷酸化JNK表達的上調(diào)作用

圖2顯示，2 mg·L-1DOX 處理后能顯著增加p-JNK的表達水平(P<0. 01)。與模型組比較，知母寧高劑量可有效抑制JNK磷酸化，使JNK的磷酸化水平降低12.96%。但低、中劑量組雖有降低JNK磷酸化的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

5 討論

阿霉素的心肌細胞毒性被認為與其產(chǎn)生的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)有密切關(guān)系[3]，抗氧化劑的應(yīng)用一直是研究聯(lián)合用藥以降低阿霉素心臟毒性的重要方向。近年來大量的研究也證實，ROS引起的炎癥反應(yīng)及細胞凋亡過程在相關(guān)毒性產(chǎn)生中發(fā)揮著重要作用。因此，除對聯(lián)合應(yīng)用藥物的抗氧化作用進行評價外，對其調(diào)控炎癥或細胞凋亡關(guān)鍵通路相應(yīng)靶位的研究也值得重視。

知母寧的抗氧化作用已得到較多的研究證實[8～11]。本研究進一步表明，知母寧具有一定的對抗Dox引起的心肌細胞損傷作用，但在所研究的劑量范圍內(nèi)療效較弱。雖然已有研究證實這種心肌細胞保護作用可能與線粒體保護作用有關(guān)，但目前對知母寧調(diào)控細胞炎癥與凋亡的相關(guān)反應(yīng)報道較少。NF-κB具有調(diào)節(jié)與應(yīng)激反應(yīng)(包括炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等) 相關(guān)的基因作用，參與心肌炎癥與壞死過程。NF-κB家族主要由5個亞單位構(gòu)成，其中 p65是 NF-κB 發(fā)揮功能的必需亞單位。研究證明，Dox能明顯上調(diào) H9c2細胞 p-NF-κB p65 的表達水平，提示NF-κB 通路活化可能是 Dox引起心肌細胞炎癥反應(yīng)的機制之一[12]，本研究結(jié)果與其類似。本研究表明，高劑量組知母寧能顯著抑制p65的磷酸化過程。

JNK是氧化應(yīng)激所引起細胞凋亡信號通路最為重要的一環(huán)[13]。我們觀察發(fā)現(xiàn)，Dox能明顯增強JNK的磷酸化水平，這與已有報道一致[14]；但知母寧對其活化抑制作用雖具有一定的量效關(guān)系，但總體作用較弱。

綜上所述，知母寧具有一定的抗阿霉素心肌毒性作用，其保護心肌細胞作用與抑制NF-κB和JNK通路的磷酸化水平具有一定的關(guān)聯(lián)性。

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