• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠對(duì)糖尿病大鼠局部深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面MVD及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

    2014-02-09 07:18:44祁萬(wàn)強(qiáng)薛曉東阮濤劉金科
    中國(guó)美容醫(yī)學(xué) 2014年21期
    關(guān)鍵詞:胰島素糖尿病

    祁萬(wàn)強(qiáng),薛曉東,阮濤,劉金科

    (1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院甘肅蘭州730000;2.甘肅省人民醫(yī)院整形科甘肅蘭州730000)

    VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠對(duì)糖尿病大鼠局部深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面MVD及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

    祁萬(wàn)強(qiáng)1,薛曉東2,阮濤1,劉金科1

    (1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院甘肅蘭州730000;2.甘肅省人民醫(yī)院整形科甘肅蘭州730000)

    目的:制備外用VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠并觀察其對(duì)糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的作用.方法:以新型凝膠卡波姆980為基質(zhì),分別加入VEGF165、胰島素,分別配制成胰島素凝膠、VEGF165凝膠、VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠和空白對(duì)照凝膠.觀察各組凝膠性狀,檢測(cè)其pH值.75只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠,體重190~290g,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組、胰島素凝膠組、VEGF165凝膠組、VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組,每組15只.各組大鼠禁食12h后,除正常對(duì)照組外,其余各組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(55 mg/kg)制備1型糖尿病模型,正常對(duì)照組大鼠注射相同劑量檸檬酸鈉緩沖液.1型糖尿病大鼠造模成功后,采用恒溫水浴箱80℃,制備深Ⅱ度燙傷模型.正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組創(chuàng)面外敷空白凝膠基質(zhì),其余各組外敷對(duì)應(yīng)凝膠制劑,每天換藥1次.深Ⅱ度燙傷造模成功后觀察各組大鼠存活情況,于3、7、11、15、21天時(shí)點(diǎn)觀察糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合情況并計(jì)算創(chuàng)面愈合率,在各時(shí)點(diǎn)隨機(jī)處死每組3只大鼠取燙傷皮膚全層留取標(biāo)本,行組織學(xué)切片及免疫組化染色觀察各時(shí)點(diǎn)炎性細(xì)胞,微血管形成及膠原蛋白.結(jié)果:制備的各組凝膠透明,保濕性極佳,黏附性良好,便于涂抹及清洗,無(wú)組織毒性.各組大鼠無(wú)感染及死亡發(fā)生.3天后燙傷各組創(chuàng)面無(wú)明顯縮小,7、11、15、21天時(shí),VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組創(chuàng)面愈合率最高,糖尿病組最低.VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組愈合率與其余各組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05).病理切片觀察示各時(shí)點(diǎn)VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組肉芽組織形成及上皮化均優(yōu)于其余各組.免疫組化染色示各組微血管數(shù)量、Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性率均于3天開(kāi)始表達(dá),且隨時(shí)間陽(yáng)性細(xì)胞增多明顯;各時(shí)間點(diǎn)VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組微血管密度及Ⅰ型膠原蛋白最高,糖尿病組最低,與其余各組比較以及VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組、糖尿病組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05).結(jié)論:糖尿病大鼠皮膚深Ⅱ度燙傷外用VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠對(duì)創(chuàng)面愈合有明顯的促進(jìn)作用

    VEGF;胰島素;卡波姆凝膠;糖尿病大鼠;創(chuàng)面愈合

    隨著社會(huì)的發(fā)展,人們的物質(zhì)生活越來(lái)越豐富,糖尿病發(fā)病率也隨之提升,臨床上糖尿病合并皮膚燒傷患者創(chuàng)面難愈合已經(jīng)成為當(dāng)前急需解決的醫(yī)學(xué)難題.有研究證實(shí),糖尿病合并創(chuàng)面難愈合主要是皮下組織中糖增高和真皮層晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts, AGEs)的堆積所致的皮膚微環(huán)境改變[1-2],這種變化使創(chuàng)傷后各種促愈合的細(xì)胞因子減少,其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowth factor,VEGF)對(duì)于微血管的生成起決定性調(diào)控作用,而微血管的生成對(duì)于創(chuàng)面愈合至關(guān)重要.大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明,細(xì)胞因子和胰島素的聯(lián)合應(yīng)用可加快促進(jìn)糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合[3-5]時(shí)間.但對(duì)于糖尿病合并燒燙傷外用VEGF的研究報(bào)道較少,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)外用VEGF165-胰島素觀察糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面愈合過(guò)程中微血管密度( microvessel density,MVD)及Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況,為臨床治愈創(chuàng)面提供進(jìn)一步研究數(shù)據(jù).

    1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑:光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯中國(guó)公司),電動(dòng)離心機(jī)(華威中儀科技公司,北京),微量移液器(求精生化試劑儀器公司,上海),恒溫水浴箱(上海比朗儀器公司),磁力攪拌器(匯爾儀器公司,杭州),PH計(jì)(美尼特自動(dòng)化儀表公司,杭州),快速血糖檢測(cè)儀(glucotrend公司).CD34免疫組織化學(xué)染色試劑盒及膠原蛋白Ⅰ型多克隆抗體(北京博奧森生物公司,中國(guó)),鏈脲佐菌素(STZ, streptozotoein,sigma公司,美國(guó)),血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(VEGF165,vascular endothelial growth factor,peprotech公司,美國(guó)),低精蛋白鋅胰島素(萬(wàn)邦生化醫(yī)藥公司,江蘇),卡波姆980(天力源科技公司,青島)等.

    1.2 研究對(duì)象:75只雄性成年wistar大鼠(甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),體重:190~290g.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):SCXK(甘)2011-001.單籠5只飼養(yǎng),飼養(yǎng)7天后開(kāi)始造模.

    1.3 實(shí)驗(yàn)分組:75只雄性成年wistar大鼠隨即分成6組,A組(正常對(duì)照組),其余60只糖尿病大鼠隨機(jī)分為B組(糖尿病對(duì)照組)、C組(胰島素凝膠治療組)、D組(VEGF165凝膠治療組)、E組(VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠治療組),每組15只大鼠.

    1.4 藥物配制

    1.4.1 檸檬酸緩沖液的配制:A液的配制:準(zhǔn)確稱取檸檬酸2.1g緩慢加入蒸餾水100ml充分溶解;B液的配制:準(zhǔn)確稱取檸檬酸鈉2.94g緩慢加入蒸餾水100ml充分溶解.配制成的A、B液分別密封冰箱冷藏保存,用時(shí)將A、B液按1:1.32混合,用pH計(jì)測(cè)量調(diào)整混合液pH值為4.2~4.5,即為STZ所需檸檬酸緩沖液.

    1.4.2 VEGF165-胰島素凝膠制備:取干燥小燒杯緩慢加入30ml蒸餾水,用電子天平準(zhǔn)確稱取0.6g卡波姆980,緩慢倒入蒸餾水中,勿攪拌搖勻.密封后放置12h后可見(jiàn)卡波姆呈絮狀充分溶于蒸餾水中,未凝結(jié)成塊.用微量移液器緩慢加入1 000μl蒸餾水于VEGF165 2μg試劑瓶中,待充分溶解后,用微量移液器取出500μl混合液和胰島素注射液1 600U,共同加入卡波姆絮狀液中,磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆?緩慢滴入三乙醇胺溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4~7.5.當(dāng)三乙醇胺加入后混合溶液馬上變?yōu)檎吵砟z狀,含大量氣泡,攪拌無(wú)法消除.取配制好的VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠,電動(dòng)離心機(jī)離心30min去除大氣泡后,冰箱低溫保存?zhèn)溆?制備胰島素凝膠、VEGF165凝膠及空白凝膠方法同上.

    1.5 實(shí)驗(yàn)方法

    1.5.1 建立糖尿病大鼠模型:實(shí)驗(yàn)用成年健康大鼠禁食前1天用血糖檢測(cè)儀檢測(cè)大鼠血糖值在正常范圍(3.0~5.0mmol/L).給予充足飲水禁食12h以上后稱取大鼠體重,按每組大鼠體重計(jì)算所需STZ (55mg/kg)用量,采用一次腹腔快速給藥法[6],正常組15只大鼠腹腔注射相同劑量檸檬酸緩沖液,以消除檸檬酸緩沖液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,注射后48h后用注射針頭刺破大鼠尾靜脈,取血液測(cè)量血糖,未禁食狀態(tài)下血糖≥16.7mmol/L為造模成功,血糖未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)的大鼠,3天后補(bǔ)充腹腔注射STZ10~15mg/kg.7天后血糖穩(wěn)定,大鼠毛發(fā),飲食、飲水量,行為活動(dòng)發(fā)生明顯改變后1型糖尿病大鼠模型造模成功.對(duì)血糖濃度太高無(wú)法檢測(cè)得到具體數(shù)據(jù)的糖尿病大鼠,皮下注射一定量的胰島素,以防血糖過(guò)高致大鼠死亡.

    1.5.2 糖尿病大鼠燙傷模型制備:造模24h前,用配制好的的脫毛膏(皂粉、硫化鈉、淀粉以1:3:6)在每只大鼠背部形成一個(gè)足夠大的裸露區(qū).根據(jù)參照文獻(xiàn)[7],恒溫水浴箱加熱致溫度80℃?zhèn)溆?按照各個(gè)大鼠體重,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)麻醉后,把其腹部向上固定于中央為4cmX4cm圓形空洞,厚度為2cm的木板上,松緊適宜,大鼠背部裸露區(qū)放置在空洞之中,將載有大鼠的木板浸泡在恒溫水浴箱中,恒溫水正好淹沒(méi)大鼠裸露皮膚.放置時(shí)間A組6S,B、C、D、E組各放置5s,燙傷后立即腹腔注射乳酸林格液10ml后,用生理鹽水紗布包裹燙傷部位,大鼠逐漸蘇醒后單籠單只喂養(yǎng),各組大鼠給予足量食物及飲水,墊料每天更換以保持鼠籠干燥,記錄大鼠飲水量、體重及進(jìn)食量.燙傷后1天肉眼觀察各組大鼠背部創(chuàng)面微潮,部分大鼠創(chuàng)面出現(xiàn)大小一致的小水泡,發(fā)紅腫脹,取大鼠燙傷皮膚組織行HE染色后鏡下觀察證實(shí)為深Ⅱ度燙傷.

    1.5.3 藥物治療:糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷模型制備成功后,行干預(yù)治療措施,A、B組創(chuàng)面分別外敷空白凝膠,C組外敷胰島素凝膠、D組外敷VEGF165凝膠及E組外敷VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠,每天換藥1次直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,換藥前用醫(yī)用棉球輕輕擦洗大鼠創(chuàng)面凝膠,最好用生理鹽水清洗創(chuàng)面.除A、B組大鼠外,其余大鼠每天檢測(cè)血糖,腹部皮下注射中長(zhǎng)效胰島素4~6U/kg,使血糖控制在正常范圍[8].

    1.5.4 標(biāo)本采集:燙傷大鼠分別在第3天、7天、11天、15天及21天時(shí)點(diǎn)隨機(jī)選取每組3只大鼠,采用腹腔注射利多卡因麻醉后行頸椎脫臼法處死,固定到一木板上,手術(shù)刀切開(kāi)大鼠創(chuàng)面邊緣皮膚,銳性剝離燙傷全層組織,剪成5mm條索狀,用10%甲醛固定,石蠟包埋,切片,用于免疫組化.

    1.5.5 燙傷面積愈合率的計(jì)算:造模成功采用透明膜描記加稱重法計(jì)算燙傷大鼠創(chuàng)面愈合率,大鼠燙傷24h后,先取透明膜描計(jì)各組創(chuàng)面輪廓,剪取同樣大小面積,質(zhì)地均勻的膠片用電子天平稱重,其重量為大鼠創(chuàng)面原始燙傷面積,采用相同描計(jì)方法計(jì)算大鼠未愈創(chuàng)面,把膠片的重量帶入下列公式進(jìn)行計(jì)算,創(chuàng)面愈合率=[(原始面積膠片重量-未愈面積膠片重量)/原始面積膠片重量]X100%.

    1.5.6 燙傷組織微血管密度:各時(shí)點(diǎn)10%甲醛固定標(biāo)本組織,石蠟包埋,切片成功后,嚴(yán)格按照CD34免疫組化步驟進(jìn)行操作,給大鼠各時(shí)點(diǎn)切片染色后,顯微鏡下觀察到棕黃色為血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性染色,每張染色片在10X40倍取6個(gè)視野計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)數(shù)量,計(jì)算平均值作為新生血管形成指標(biāo).采用Pareek[9]方法計(jì)算MVD.

    1.5.7 燙傷組織Ⅰ型膠原蛋白:取大鼠各組各時(shí)點(diǎn)部分切片,行大鼠Ⅰ型膠原免疫組化染色,顯微鏡下觀察,陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色或黃色.在10X40倍鏡下,創(chuàng)面隨機(jī)選取5個(gè)視野,應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算得出Ⅰ型膠原的陽(yáng)性面積,取其均值.

    1.5.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示,各組間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05.

    2 結(jié)果

    2.1 各組燙傷糖尿病大鼠各時(shí)點(diǎn)血糖測(cè)定:見(jiàn)表1.

    2.2 糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合觀察:糖尿病大鼠燙傷24h后,燙傷面積與模板面積大小一致,燙傷邊緣與周圍正常組織界限清楚,界限明顯發(fā)紅,水腫.燙傷3天后各組大鼠創(chuàng)面均未見(jiàn)縮小,創(chuàng)面皮溫增高,有大量滲出液,部分滲出物結(jié)痂,用生理鹽水棉球輕輕去除滲出物后可見(jiàn)創(chuàng)面基地部呈紅白相間,水腫較明顯,痛覺(jué)較為遲鈍.其中B組大鼠創(chuàng)面滲出明顯較多,水腫也最為明顯,A、C、D組大鼠次之,三組之間無(wú)明顯差異,E組大鼠相對(duì)其它組滲出物較少.各組大鼠創(chuàng)面滲出物部分結(jié)痂,結(jié)痂物周圍顏色輕微黃,質(zhì)稀薄,無(wú)特殊氣味.燙傷15天,愈合面積E>D>C>A,除B組外,其余各組大鼠創(chuàng)面周圍及毛囊邊緣創(chuàng)面已部分愈合,其中E組大鼠創(chuàng)面皮膚角化形成良好.B組大鼠創(chuàng)面開(kāi)始愈合,可見(jiàn)邊緣上皮組織向中央爬行.燙傷21天,E組大鼠燙傷創(chuàng)面大部分基本已愈合,僅燙傷中央留少量未愈創(chuàng)面,愈合創(chuàng)面新生成的皮膚組織角化形成良好,可見(jiàn)密集細(xì)小的毛發(fā)生長(zhǎng),C、D組也大部分愈合,但中央存留未愈面積較E組大,皮膚角化形成好,見(jiàn)細(xì)小少量毛發(fā)生長(zhǎng),A組較C、D、E組愈合差,B組創(chuàng)面是各組愈合中最差.各組大鼠實(shí)驗(yàn)中均無(wú)死亡及感染.

    2.3 微血管密度(MVD)的檢測(cè):CD34免疫組化均成陽(yáng)性在燙傷后各組大鼠時(shí)點(diǎn)均表達(dá),但隨時(shí)間增長(zhǎng)E組大鼠陽(yáng)性細(xì)胞最多,其余各組次之,B組陽(yáng)性表達(dá)最少.11天時(shí)E組大鼠陽(yáng)性表達(dá)達(dá)最大值,其余各組大鼠于15天時(shí)達(dá)高峰(見(jiàn)圖1).B、E組大鼠各觀測(cè)時(shí)點(diǎn)與其他各組大鼠相比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即:<0.05.燙傷3天時(shí),A、C、D組大鼠CD34陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即>0.05.從燙傷7天開(kāi)始,燙傷創(chuàng)面C、D組大鼠組織CD34陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均高于A組,存在明顯差異性,即<0.05. C、D組糖尿病大鼠創(chuàng)面CD34陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)各觀測(cè)時(shí)點(diǎn)比較差異不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即:>0.05.見(jiàn)表2.

    2.4Ⅰ 型膠原表達(dá)的測(cè)定:燙傷3天后C、D組大鼠創(chuàng)面Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)無(wú)顯著差異,但隨時(shí)間延長(zhǎng),Ⅰ型膠原陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多,E組大鼠創(chuàng)面組織含量最高,其余各組次之,B組大鼠創(chuàng)面膠原含量最少.燙傷7、11、15天,除E組大鼠外,其余各組主要表達(dá)于肉芽組織及血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍,E組大鼠在7、11天時(shí)表達(dá)于肉芽組織及血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍,15天時(shí)Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)在真皮層沉積,呈小團(tuán)塊無(wú)序線性排列(見(jiàn)圖2).21天時(shí)各組Ⅰ型膠原均主要在新生上皮基底細(xì)胞表達(dá),C、D組真皮層可見(jiàn)大量膠原,數(shù)量多且粗大,B組真皮層膠原含量最少,A組膠原含量次于C、D組,而E組真皮層缺損處可見(jiàn)大量膠原纖維填充,創(chuàng)面部分輕微攣縮.E組糖尿病大鼠燙傷組織Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)從燙傷3天開(kāi)始與其他組相比較有明顯的差異性,而B(niǎo)組大鼠表達(dá)最低,E、B組比較及兩組與其余各組大鼠比較均存在差異性(<0.05);燙傷7、11、15、21天時(shí),A組Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)均低于C、D、E組(<0.05),燙傷3天時(shí),Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)A組與C、D組比較無(wú)明顯差異性(>0.05),各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)C、D組間比較均無(wú)差異均性(>0.05).見(jiàn)表3.

    圖1 傷后15天各組大鼠創(chuàng)面CD34免疫組化微血管陽(yáng)性(SPX400)表達(dá)情況

    圖2 傷后15天各組大鼠創(chuàng)面Ⅰ型膠原陽(yáng)性(SPX400)表達(dá)情況

    表1 各組大鼠各時(shí)相點(diǎn)血糖(mmol/L)

    表2 各組大鼠不同時(shí)相點(diǎn)微血管密度表達(dá)(n=3,條/mm2,±)

    表3 各組大鼠不同時(shí)相點(diǎn)Ⅰ型膠原密度表達(dá)(n=3,條/mm2,±)

    3 討論

    創(chuàng)面愈合是一個(gè)連續(xù)的由多個(gè)互相交叉重疊過(guò)程組成,需通過(guò)各種細(xì)胞相互活動(dòng),相互影響來(lái)協(xié)同完成.這些活動(dòng)并非隨意發(fā)生,而是有序地進(jìn)行調(diào)節(jié),與傷口中不同類型細(xì)胞的參與有關(guān)[10].而實(shí)驗(yàn)證實(shí),糖尿病患者皮膚組織血糖與細(xì)胞因子水平呈負(fù)相關(guān)、過(guò)度的蛋白酶分解以及皮下神經(jīng)、血管病變等諸多因素,導(dǎo)致了皮膚創(chuàng)面不愈或延遲愈合[11-13].

    研究表明,糖尿病大鼠皮膚深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面局部組織VEGF含量低下導(dǎo)致血管分化低下,致創(chuàng)面血供明顯少于非高血糖組織,肉芽組織形成遲緩等變化,呈現(xiàn)創(chuàng)面不愈或難愈的特征[14].近年,糖尿病合并燙傷創(chuàng)面難愈合研究發(fā)現(xiàn),局部細(xì)胞因子含量對(duì)創(chuàng)面愈合影響至關(guān)重要,其中VEGF是非常重要的因子之一.VEGF是能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,又能促進(jìn)血管保持正常狀態(tài)[15].在血管形成發(fā)展過(guò)程中,缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是轉(zhuǎn)錄活化編碼VEGF基因的活化因子,從而刺激血管形成[16-17].而HIF-l的活性[18]由缺氧誘導(dǎo)因子-1a(Hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)決定.組織中HIF-1a含量升高將抑制HIF-l的活性,糖尿病慢性創(chuàng)面引起了組織缺血缺氧,使創(chuàng)面組織中HIF-1a分泌增加,致VEGF含量減少[19]從而導(dǎo)致創(chuàng)面的愈合延遲或不愈合.喬亮等[20]利用熒光微球?qū)μ悄虿〈笫笊睥蚨葼C傷創(chuàng)面血管化進(jìn)行觀察,得出創(chuàng)面新生血管化程度、數(shù)量及質(zhì)量與對(duì)照組相比明顯降低.由此推斷糖尿病創(chuàng)面VEGF濃度較正常創(chuàng)面降低,使其無(wú)法促進(jìn)血管生成,致新鮮肉芽組織明顯缺乏.本實(shí)驗(yàn)就是利用糖尿病大鼠皮膚組織中HIF-1活性抑制,VEGF含量不足,外用VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和體表血管生成,初步證實(shí)外用一定濃度的VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠對(duì)創(chuàng)面愈合有明顯的促進(jìn)作用.

    創(chuàng)面愈合中膠原的形成也非常重要,膠原由成纖維細(xì)胞分泌,參與組成肉芽組織,以覆蓋創(chuàng)面,促進(jìn)創(chuàng)面愈合.膠原蛋白的生成與成纖維細(xì)胞增殖呈正相關(guān).成纖維細(xì)胞在傷口4~5天開(kāi)始通過(guò)有絲分裂增殖、分化,并合成和分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分,與新生毛細(xì)血管、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞共同組成肉芽組織,填充組織缺損,覆蓋創(chuàng)面,為表皮細(xì)胞的生成創(chuàng)造條件[21].成纖維細(xì)胞合成的膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分,膠原形成數(shù)量直接影響創(chuàng)面的修復(fù)質(zhì)量和愈合時(shí)間.在成纖維細(xì)胞分泌合成的膠原中,在皮膚組織中起主要作用的是I、Ⅲ型膠原,Ⅰ型膠原纖維位于真皮層,起支持作用,而Ⅲ型膠原呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)環(huán)繞在外周決定膠原纖維的彈性[22].而糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合過(guò)程中,成纖維細(xì)胞有絲分裂的S期數(shù)量及質(zhì)量明顯低于正常大鼠,成纖維細(xì)胞的DNA合成水平明顯下降,表明在皮膚組織高血糖狀態(tài)下成纖維細(xì)胞的增殖明顯放緩[23].這與本實(shí)驗(yàn)B組大鼠檢測(cè)膠原蛋白免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯偏少是一致的.同時(shí)有研究也表明,VEGF對(duì)增生性瘢痕形成有促進(jìn)作用[24],VEGF及其受體在增生性瘢痕組織中表達(dá)活躍.岳毅剛等[25]利用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體局部注射治療增生性瘢痕,結(jié)果顯示瘢痕體積明顯減少,組織內(nèi)血管數(shù)量減少,膠原纖維明顯減少,大劑量尤為明顯.這表明VEGF可以促進(jìn)創(chuàng)面膠原蛋白生成.

    研究證實(shí),視網(wǎng)膜mü ller細(xì)胞在高濃度的胰島素作用下能促進(jìn)的VEGF高表達(dá)[26],這說(shuō)明胰島素可能抑制組織中HIF-1a的活性,促進(jìn)HIF-1在組織水平升高,從而刺激VEGF增高,促進(jìn)血管生成.胰島素外用于創(chuàng)面可調(diào)節(jié)創(chuàng)面周圍物質(zhì)代謝, Zhang等[27]用小劑量胰島素治療燙燒大鼠,運(yùn)用同位素追蹤技術(shù)測(cè)量蛋白質(zhì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島素治療組創(chuàng)面中蛋白質(zhì)的含量明顯高于對(duì)照組,且炎癥反應(yīng)輕,低血糖反應(yīng)發(fā)生率低,進(jìn)一步證實(shí)胰島素能加速創(chuàng)面愈合.本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這點(diǎn),C組創(chuàng)面愈合率、愈合時(shí)間、MVD、Ⅰ型膠原蛋白等指標(biāo)均優(yōu)于于B組大鼠和A組大鼠.

    本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用空白凝膠、含胰島素凝膠、含VEGF165凝膠和含VEGF165-胰島素凝膠作為分組,以抵消卡波姆凝膠本身對(duì)創(chuàng)面愈合的影響.而卡波姆對(duì)活體細(xì)胞及組織無(wú)任何損害,以卡波姆凝膠作為VEGF165、胰島素的賦形劑,既方便了創(chuàng)面敷藥物的操作性,同時(shí)也保證了一定時(shí)間內(nèi)局部創(chuàng)面VEGF165、胰島素濃度的持續(xù)性和穩(wěn)定性.同時(shí)凝膠還可以為創(chuàng)面提供溫暖、濕潤(rùn)的局部微環(huán)境,在一定程度上能夠保護(hù)創(chuàng)面及促進(jìn)愈合[28].卡波姆溶于水呈酸性,直接用于創(chuàng)面治療,酸性pH值對(duì)愈合影響巨大[29].人體生理?xiàng)l件下微環(huán)境pH值通常維持在7.35~7.45之間,微堿性,因此本實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組凝膠的pH值設(shè)置接近人體.通過(guò)實(shí)驗(yàn),卡波姆凝膠應(yīng)用到燙傷創(chuàng)面能有效保護(hù)創(chuàng)面,防止感染,不對(duì)創(chuàng)面造成二次損傷,達(dá)到了本次實(shí)驗(yàn)作為基質(zhì)運(yùn)用的效果.

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:保持一定穩(wěn)定濃度的VEGF165、胰島素外用對(duì)深I(lǐng)I度燙傷的糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合有顯著地促進(jìn)作用.創(chuàng)面外敷VEGF165-胰島素凝膠后,創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯提前,創(chuàng)面愈合率比同期對(duì)照組高.早期膠原蛋白含量及毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多,上皮化時(shí)間早,新生表皮厚度大于同期對(duì)照組.創(chuàng)面局部膠原蛋白、新生毛細(xì)血管的陽(yáng)性數(shù)量表達(dá)遠(yuǎn)高于同期對(duì)照組.

    [1]陸樹(shù)良,謝挺,牛軼雯,等.創(chuàng)面難愈的機(jī)制研究-糖尿病皮膚的"微環(huán)境污染"[J].中華燒傷雜志,2008,24(1):3-5.

    [2]Lian H,Zakhaleva J,Chen W.Cell and tissue interactions with glycated collagen and their relevance to delayed diabetic wound healing[J].Blomaterials,2009,30(9):1689-1696.

    [3]張冀北,薛曉東,謝沛霖,等.局部聯(lián)合應(yīng)用NGF及胰島素對(duì)糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面血管形成及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志,2011,25(3):354-360.

    [4]謝沛霖,薛曉東,張冀北,等.局部應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子聯(lián)合胰島素對(duì)糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面愈合及HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)師雜志,2011,13(1):33-37.

    [5]常飛,薛曉東,謝沛霖,等.聯(lián)合應(yīng)用NGF和胰島素對(duì)糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面表皮干細(xì)胞的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012,12(7):1236-1240.

    [6]農(nóng)慧,盛慶壽,梁健,等.STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,27(1):69-72.

    [7]林煒棟,陸樹(shù)良,青春,等.糖尿病大鼠深二度燙傷創(chuàng)面VEGF和bFGF的表達(dá)規(guī)律及其創(chuàng)面微血管密度的關(guān)系[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2003,83(19):1702-1704.

    [8]王竹,楊月欣,向雪松,等.實(shí)驗(yàn)大鼠血糖正常范圍的估算[J].衛(wèi)生研究,2010,39(2):133-137

    [9]Pareek G,Shevchuk M,Armenakas NA,et al.The effect of finasteride on the expression of vascular endothelial growth factor and microvessel density:A possible mechanism for decreased prostatic bleeding in treated patients[J].J Urology, 2003,169(1):20-23.

    [10]Sherrell JA,Robert WB,Charles HM.Grabb and Smith's Plastic Surgery[M].郭樹(shù)忠,等譯.5版.西安:世界圖書(shū)出版西安公司,2002:3-4.

    [11]Lobmann R,Ambrosch A,Schultz G,et al.Expression of matrix-metalloprprotoinases and their inhibitors in the woundsofdiabeticandnon-diabeticpatients[J]. Diabetologia,2002,45(2):1011-1016.

    [12]LermanOZ,GalianoRD,ArmourM,etal.Celluar dysfunction in the diabetic fibroblast[J].Am J Pathol, 2003,162(1):303-312.

    [13]Ge K,Qing C,Lu SL.Epidermal growth factor receptor and impaired wound healing in diabetes[J].Chinese Journal Clinical Rehabilitation,2003,7(6):944-945.

    [14]葛奎,陸樹(shù)良,青春,等.氨基胍對(duì)糖尿病燒傷創(chuàng)面促愈作用的研究[J].中華創(chuàng)傷雜志,2004,20(8):17-21.

    [15]Stefanini MO,Wu FT,Mac Gabhann F,et a1.A compartment model of VEGF distribution in blood,healthy and diseased tissues[J].BMC Systerms Biology,2008,2:77.

    [16]Dai Y,Xu MF,Wang YG,et a1.HIF-1a induced VEGF over-expressioninbonemarrowstemcellsprotects cardio-myocytes against ischemia[J].J Mol Cell Cardiol, 2007,42(6):1036-1044.

    [17]Thomas P,Angelika L,Bodo K,et a1.Mechanical overload induces VEGF in cartil-age discs via hypoxia-inducible factor[J].Am J Pathol,2004,164(1):185-192.

    [18]Jennifer EZ,Ion SJ,Yan H.Hypoxia-inducible factor(HIF)-l regulatorypathwayanditspotentialfortherapeutic intervention in malignancy and ischemia[J].Yale J Biol Med,2007,80(2):51-60.

    [19]Robert DG,Oren MT,Catherine RP,et a1.Topical vascular endothelialgrowt-hfactoracceleratesdiabeticwound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-de-rived Cells[J].Am J Pathol, 2004,164(6):1935-1947.

    [20]喬亮,王志勇,韋俊,等.糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面新生血管形成障礙的研究[J].中華燒傷雜志,2008,2(24):18-21.

    [21]贠健,楊關(guān)根,黃常新,等.大鼠感染創(chuàng)面肉芽組織膠原代謝的改變[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2009,15(6):656.

    [22]Gallant CL,Olson ME,Hart DA.Molecular,histologic and gross phenotype of shin wo-und healing in red duroc pigs reveals an abnormal healing pherotype of hyperpiymented scaring[J].Wound Repair Regan,2004,12(3):305.

    [23]牛軼雯,陸樹(shù)良,謝挺,等.糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的改變[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,26(1):63-65.

    [24]錢利,趙柏程,皮立,等.瘢痕組織中微血管數(shù)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的研究[J].中國(guó)燒傷創(chuàng)瘍雜志,2003,15(4): 285-289.

    [25]岳毅剛,蔣常文,李佩英,等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體靶血管治療對(duì)增生性瘢痕Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)燒傷雜志,2006,22(6):427-430.

    [26]Song E,Yue H,X Qi,et a1.Effects of high-concentration insulin on expression of vascular endothelial growth factor in cultured Muller cells in vitro[J].Chin J Ophthalmol, 2004,40(1):201-204.

    [27]Zhang XJ,Chinkes DL,Wolf SE,et al.Insulin but not growth ormone stimulates protein anabolis in skin wound and muscle[J].Am J Physiol,1999,276(4pt1):E712-20.

    [28]Kaya AI,Turani N,Akyui M.The effectiveness of a hydrogel dressing compared with standard management of pressure ulcers[J].J Wound Care,2005,14(1):42-44.

    [29]Dissemind J,Withoff M,Brauns JC,et al.Ph values in chronic wounds.Evaluationduringmodernwoundtherapy[J]. Hautarzt,2003,54(10):959-965.

    Impact VEGF165-insulin composite gel in diabetic rats localⅡdeep degree burn wounds expression of MVD and collagenⅠ

    QI Wan-qiang1,XUE Xiao-dong2,RUAN Tao1,LIU Jin-ke1
    (1.The First Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou 730000,Gansu,China; 2.Department of Plastic Surgery,Gansu Province People's Hospital,Lanzhou 730000,Gansu,China)

    ObjectivePreparation of topical gel VEGF165-insulin complex and observe its deepⅡde-gree burn wound healing in diabetic rats role.MethodsCarbomer with new gel matrix,were added to VEGF165,insulin,insulin were formulated into a gel,VEGF165 gel,VEGF165-insulin composite gel and control gel.Gel characters of each group,the pH value of the detection.75 SPF male Wistar rats weighing 190~290g,were randomly divided into normal control group,diabetic control group,insulin gel group,VEGF165 gel group,VEGF165-insulin gel composite groups 15.Inaddition to the normal control group,the other groups of rats were fasted 12h after intraperitoneal injection of streptozotocin(55mg/kg)Preparation of type 1 diabetes model,normal control rats injected at the same dose fasting sodium citrate buffer fluid.Type 1 diabetes in rats after successful modeling,using heated water bath 80℃,the preparation of deepⅡdegree burn model.Normal control group,diabetic control group topical wound gel matrix blank,the rest of the group corresponding topical gel formulation,dressing once a day.DeepⅡdegree burns after a successful modeling survival of the rats was observed at 3,7,11,15,21d point of wound healing in diabetic rats and calculate the rate of wound healing in each group were sacrificed at each time point 3 rats take full thickness skin burns specimens were taken for histological sections and immunohistochemical staining of inflammatory cells at each time point,angiogenesis and collagen.Results Each group prepared a transparent gel,moisturizing excellent,good adhesion,easy painting and cleaning,no tissue toxicity.The rats without infection and death.3d no after burn wounds in each group was significantly reduced,7,11,15,21d when VEGF165-insulin compound gel group the highest rate of wound healing,diabetic group was the lowest,VEGF165-insulin compound gel group healing rate with the rest of the group,the difference were statistically significant(<0.05).Histopathological examination shows each time point VEGF165-insulin compound gel group granulation tissue formation and epithelialization were better than the rest of the group.Immunohistochemical staining showed that the number of microvessels in each group,Ⅰcollagen expression positive rates start at 3d,and the positive cells was significantly increased with time;each time point VEGF165-insulin highest composite gel group microvessel density and collagen typeⅠdiabetes lowest group,with other groups and VEGF165-insulin compound gel group,the difference was statistically significant(<0.05) between the diabetic group.ConclusionDiabetic rat skin deepⅡdegree burns topical gel VEGF165-insulin complex on wound healing have significant role in promoting

    VEGF;insulin;carbomer gel;diabetic rats;wound healing

    R587.1

    A

    1008-6455(2014)21-1799-07

    2014-09-27

    2014-11-13

    編輯/張惠娟

    薛曉東,男,教授,主任醫(yī)師,碩士研究生導(dǎo)師;擅長(zhǎng)危重?zé)齻木戎?難愈性創(chuàng)面的治療和各種美容整形手術(shù).甘肅省人民醫(yī)院整形科,蘭州市城關(guān)區(qū)東崗西路204號(hào),郵編:730000

    猜你喜歡
    胰島素糖尿病
    如何選擇和使用胰島素
    人人健康(2023年26期)2023-12-07 03:55:46
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    中老年保健(2022年5期)2022-08-24 02:35:42
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    中老年保健(2022年1期)2022-08-17 06:14:56
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    中老年保健(2021年5期)2021-08-24 07:07:20
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    中老年保健(2021年9期)2021-08-24 03:51:04
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    中老年保健(2021年7期)2021-08-22 07:42:16
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    自己如何注射胰島素
    門冬胰島素30聯(lián)合二甲雙胍治療老年初診2型糖尿病療效觀察
    糖尿病的胰島素治療
    亚洲,欧美,日韩| 插逼视频在线观看| 波野结衣二区三区在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| 天堂动漫精品| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久久九九精品影院| 老司机影院成人| 国产v大片淫在线免费观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 黄片wwwwww| 欧美一区二区国产精品久久精品| 人妻少妇偷人精品九色| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产老妇女一区| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美日本视频| 国产三级在线视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久国产成人免费| 别揉我奶头 嗯啊视频| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 中文字幕av成人在线电影| 日韩欧美三级三区| 99久国产av精品国产电影| 亚洲国产精品国产精品| 国产老妇女一区| 日韩精品有码人妻一区| 免费观看人在逋| 午夜激情福利司机影院| 啦啦啦韩国在线观看视频| 免费观看在线日韩| 欧美精品国产亚洲| 春色校园在线视频观看| 日本一本二区三区精品| 永久网站在线| 哪里可以看免费的av片| 亚洲四区av| av黄色大香蕉| 插逼视频在线观看| 波多野结衣高清作品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久人妻av系列| 欧美最新免费一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久久久久久久大av| 一夜夜www| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 长腿黑丝高跟| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 人人妻人人看人人澡| 99久久九九国产精品国产免费| h日本视频在线播放| 国产视频一区二区在线看| 久久精品91蜜桃| 亚洲美女搞黄在线观看 | 五月伊人婷婷丁香| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久人人精品亚洲av| 一级a爱片免费观看的视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 亚洲av二区三区四区| 国产真实乱freesex| 欧美精品国产亚洲| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩av在线大香蕉| avwww免费| 露出奶头的视频| 国产一区二区激情短视频| 露出奶头的视频| 深爱激情五月婷婷| 国产高清有码在线观看视频| 国产成人影院久久av| 一级黄片播放器| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲图色成人| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品野战在线观看| 91狼人影院| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 插逼视频在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 日日啪夜夜撸| 少妇丰满av| 黑人高潮一二区| 九九热线精品视视频播放| av视频在线观看入口| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 人妻久久中文字幕网| 成人亚洲精品av一区二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久精品91蜜桃| 深夜精品福利| 一进一出抽搐动态| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 3wmmmm亚洲av在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产色婷婷99| 久久人人精品亚洲av| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美国产日韩亚洲一区| 成年女人看的毛片在线观看| 有码 亚洲区| 精品人妻熟女av久视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 一区二区三区精品91| 国产亚洲最大av| 99热全是精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲综合色惰| 乱系列少妇在线播放| 免费人成在线观看视频色| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久人人爽人人爽人人片va| 老司机亚洲免费影院| h视频一区二区三区| av天堂中文字幕网| 夫妻性生交免费视频一级片| 男女国产视频网站| 国产亚洲91精品色在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 99热6这里只有精品| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲不卡免费看| 亚洲第一av免费看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 岛国毛片在线播放| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日日啪夜夜爽| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 午夜福利影视在线免费观看| 日本av手机在线免费观看| 午夜久久久在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 国产欧美亚洲国产| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久精品夜色国产| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品嫩草影院av在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| www.av在线官网国产| 色吧在线观看| 国产精品一区www在线观看| 在线播放无遮挡| 哪个播放器可以免费观看大片| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 午夜影院在线不卡| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产毛片在线视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 色5月婷婷丁香| 视频区图区小说| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 日韩一区二区视频免费看| 国产精品无大码| 亚洲成人手机| a级片在线免费高清观看视频| 看非洲黑人一级黄片| 一级毛片我不卡| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产精品人妻久久久久久| 伊人亚洲综合成人网| 啦啦啦在线观看免费高清www| 我要看黄色一级片免费的| 国产高清三级在线| 亚洲精品,欧美精品| 大片免费播放器 马上看| 国产色婷婷99| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 精品国产乱码久久久久久小说| 婷婷色综合www| 国产伦精品一区二区三区四那| 黄片无遮挡物在线观看| 日本欧美国产在线视频| 精品人妻熟女av久视频| 中文资源天堂在线| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 黄色一级大片看看| 搡老乐熟女国产| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲av在线观看美女高潮| 伊人亚洲综合成人网| av国产精品久久久久影院| 午夜影院在线不卡| 亚洲熟女精品中文字幕| 婷婷色综合www| 亚洲国产精品999| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 简卡轻食公司| 国产伦理片在线播放av一区| av在线观看视频网站免费| 国产精品无大码| 国产欧美日韩精品一区二区| 色网站视频免费| 国产精品无大码| 国产高清国产精品国产三级| 久久精品夜色国产| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产在线视频一区二区| 欧美xxⅹ黑人| 国产伦精品一区二区三区视频9| 搡老乐熟女国产| 日韩 亚洲 欧美在线| 一个人免费看片子| .国产精品久久| 一区二区av电影网| 久久97久久精品| 中文字幕制服av| 久久久久久久久久成人| 日本av免费视频播放| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品熟女久久久久浪| 美女中出高潮动态图| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产毛片在线视频| 亚洲欧洲日产国产| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 免费人妻精品一区二区三区视频| 老司机亚洲免费影院| 久久鲁丝午夜福利片| 日韩欧美 国产精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 女性被躁到高潮视频| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 久久女婷五月综合色啪小说| 国产精品一区二区在线不卡| 久久人人爽人人片av| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本-黄色视频高清免费观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 精品一区二区免费观看| 精品久久久精品久久久| 国产成人精品一,二区| 日本-黄色视频高清免费观看| 777米奇影视久久| 久久韩国三级中文字幕| 99热6这里只有精品| 中文字幕久久专区| 免费观看在线日韩| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 美女内射精品一级片tv| 高清在线视频一区二区三区| 波野结衣二区三区在线| 人人妻人人澡人人看| 久久久久久久精品精品| 国产69精品久久久久777片| 色5月婷婷丁香| 日本色播在线视频| av在线播放精品| 亚洲av不卡在线观看| 中文资源天堂在线| 国产精品福利在线免费观看| 国产综合精华液| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费看光身美女| 欧美国产精品一级二级三级 | 九色成人免费人妻av| 高清毛片免费看| av播播在线观看一区| 亚洲国产精品成人久久小说| 免费观看av网站的网址| 一级毛片我不卡| 国产成人freesex在线| 欧美国产精品一级二级三级 | 日韩强制内射视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 美女国产视频在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 只有这里有精品99| 少妇熟女欧美另类| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美精品一区二区大全| 99久久精品国产国产毛片| 看免费成人av毛片| 国产高清国产精品国产三级| 观看免费一级毛片| 两个人的视频大全免费| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产毛片在线视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久6这里有精品| 亚洲国产精品国产精品| 日韩人妻高清精品专区| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美另类一区| 妹子高潮喷水视频| 成人免费观看视频高清| 国产成人精品婷婷| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产成人一区二区在线| 国产精品无大码| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 女性生殖器流出的白浆| 一级毛片 在线播放| 麻豆成人午夜福利视频| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲成人av在线免费| 日日撸夜夜添| av女优亚洲男人天堂| 人妻一区二区av| 少妇人妻 视频| 五月天丁香电影| 中国美白少妇内射xxxbb| 视频区图区小说| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 人人妻人人澡人人看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 色视频在线一区二区三区| 国产免费又黄又爽又色| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲国产最新在线播放| kizo精华| 亚洲av男天堂| 婷婷色av中文字幕| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美国产精品一级二级三级 | 看十八女毛片水多多多| 激情五月婷婷亚洲| 久久精品国产亚洲av天美| 日本免费在线观看一区| 日本av手机在线免费观看| a级一级毛片免费在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日本vs欧美在线观看视频 | 精品人妻偷拍中文字幕| 免费观看性生交大片5| 国产日韩欧美亚洲二区| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲国产最新在线播放| 免费看不卡的av| 色吧在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 高清在线视频一区二区三区| 久久免费观看电影| 18禁在线播放成人免费| 极品少妇高潮喷水抽搐| 熟女av电影| 波野结衣二区三区在线| 国产熟女午夜一区二区三区 | 国产精品伦人一区二区| 久久av网站| 久久热精品热| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 超碰97精品在线观看| av天堂中文字幕网| 国国产精品蜜臀av免费| 老司机亚洲免费影院| 欧美97在线视频| 一本色道久久久久久精品综合| 极品教师在线视频| 亚洲欧美日韩东京热| 777米奇影视久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产黄片美女视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲精品一区蜜桃| 制服丝袜香蕉在线| 久久久久久久精品精品| 另类精品久久| 日韩人妻高清精品专区| 久久久久久伊人网av| 国模一区二区三区四区视频| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日韩成人伦理影院| 日韩大片免费观看网站| 人妻系列 视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 九色成人免费人妻av| 观看免费一级毛片| 日本av免费视频播放| 能在线免费看毛片的网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产成人精品无人区| 高清不卡的av网站| 国产伦精品一区二区三区四那| 国内揄拍国产精品人妻在线| 午夜激情福利司机影院| 亚洲,欧美,日韩| 久久久精品94久久精品| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产亚洲5aaaaa淫片| 免费观看的影片在线观看| 看免费成人av毛片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 又爽又黄a免费视频| 深夜a级毛片| 高清不卡的av网站| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲欧洲日产国产| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品熟女久久久久浪| 国产成人精品福利久久| 国产高清有码在线观看视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 丰满人妻一区二区三区视频av| 18禁动态无遮挡网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 人妻人人澡人人爽人人| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 9色porny在线观看| 秋霞伦理黄片| 婷婷色综合大香蕉| 久久久精品免费免费高清| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美精品国产亚洲| 国模一区二区三区四区视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美成人午夜免费资源| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久精品久久精品一区二区三区| 黄色欧美视频在线观看| 少妇丰满av| 黄色视频在线播放观看不卡| 色网站视频免费| 黄色怎么调成土黄色| 丝袜喷水一区| 国产极品天堂在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美精品国产亚洲| 99久久人妻综合| 亚洲精品,欧美精品| 丝袜脚勾引网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久韩国三级中文字幕| 欧美人与善性xxx| 男女国产视频网站| 少妇精品久久久久久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 欧美丝袜亚洲另类| 日韩av不卡免费在线播放| 高清欧美精品videossex| 国产成人精品福利久久| 9色porny在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 女性被躁到高潮视频| 国产男女超爽视频在线观看| 久久97久久精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 晚上一个人看的免费电影| 日本av免费视频播放| a级毛色黄片| 22中文网久久字幕| 日韩亚洲欧美综合| 嫩草影院入口| 欧美97在线视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美xxⅹ黑人| 国产免费视频播放在线视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲欧美精品专区久久| 国产成人aa在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产毛片在线视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲丝袜综合中文字幕| 最近最新中文字幕免费大全7| 老熟女久久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产永久视频网站| 亚洲国产色片| 男女免费视频国产| 99久久精品国产国产毛片| 人体艺术视频欧美日本| 午夜91福利影院| 老司机影院毛片| 91精品伊人久久大香线蕉| 精品酒店卫生间| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产在线视频一区二区| 天美传媒精品一区二区| 国产又色又爽无遮挡免| 成人特级av手机在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 在线观看一区二区三区激情| 嘟嘟电影网在线观看| 免费观看av网站的网址| 美女福利国产在线| 国产成人一区二区在线| 免费观看无遮挡的男女| 黑丝袜美女国产一区| 大片免费播放器 马上看| 国产成人精品一,二区| 免费人妻精品一区二区三区视频| av一本久久久久| 丝袜在线中文字幕| 99精国产麻豆久久婷婷| √禁漫天堂资源中文www| 免费观看在线日韩| 少妇丰满av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久av网站| 最近最新中文字幕免费大全7| 免费在线观看成人毛片| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 国产深夜福利视频在线观看| 男女边摸边吃奶| 国产精品久久久久久av不卡| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 免费看日本二区| av网站免费在线观看视频| 国产精品久久久久久av不卡| 夜夜爽夜夜爽视频| 26uuu在线亚洲综合色| 在线免费观看不下载黄p国产| 全区人妻精品视频| 国模一区二区三区四区视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产成人精品无人区| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 一区二区三区乱码不卡18| 一区二区三区精品91| 高清毛片免费看| 精品一区在线观看国产| 亚洲成人av在线免费| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚州av有码| 欧美日本中文国产一区发布| 简卡轻食公司| 哪个播放器可以免费观看大片| 中文字幕久久专区| 精品少妇久久久久久888优播| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产爽快片一区二区三区| 欧美少妇被猛烈插入视频| av天堂中文字幕网| 色视频www国产| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 美女福利国产在线| 边亲边吃奶的免费视频| 国产深夜福利视频在线观看| 久久影院123| 国产成人精品久久久久久| 亚洲av不卡在线观看| 欧美另类一区| 国产熟女欧美一区二区| 美女视频免费永久观看网站| 精品久久国产蜜桃| 大陆偷拍与自拍| 日本黄色片子视频| 国产亚洲欧美精品永久| 色94色欧美一区二区| 久久99热6这里只有精品| 亚洲自偷自拍三级| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 婷婷色综合www| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产淫语在线视频| 亚洲国产精品一区三区| 久久久国产精品麻豆| 免费黄色在线免费观看| 七月丁香在线播放| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日本wwww免费看| 亚洲国产精品999| 国产精品久久久久久精品电影小说| 极品人妻少妇av视频| 国产伦理片在线播放av一区|