• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠對(duì)糖尿病大鼠局部深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面MVD及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

    2014-02-09 07:18:44祁萬(wàn)強(qiáng)薛曉東阮濤劉金科
    中國(guó)美容醫(yī)學(xué) 2014年21期
    關(guān)鍵詞:胰島素糖尿病

    祁萬(wàn)強(qiáng),薛曉東,阮濤,劉金科

    (1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院甘肅蘭州730000;2.甘肅省人民醫(yī)院整形科甘肅蘭州730000)

    VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠對(duì)糖尿病大鼠局部深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面MVD及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

    祁萬(wàn)強(qiáng)1,薛曉東2,阮濤1,劉金科1

    (1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院甘肅蘭州730000;2.甘肅省人民醫(yī)院整形科甘肅蘭州730000)

    目的:制備外用VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠并觀察其對(duì)糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的作用.方法:以新型凝膠卡波姆980為基質(zhì),分別加入VEGF165、胰島素,分別配制成胰島素凝膠、VEGF165凝膠、VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠和空白對(duì)照凝膠.觀察各組凝膠性狀,檢測(cè)其pH值.75只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠,體重190~290g,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組、胰島素凝膠組、VEGF165凝膠組、VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組,每組15只.各組大鼠禁食12h后,除正常對(duì)照組外,其余各組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(55 mg/kg)制備1型糖尿病模型,正常對(duì)照組大鼠注射相同劑量檸檬酸鈉緩沖液.1型糖尿病大鼠造模成功后,采用恒溫水浴箱80℃,制備深Ⅱ度燙傷模型.正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組創(chuàng)面外敷空白凝膠基質(zhì),其余各組外敷對(duì)應(yīng)凝膠制劑,每天換藥1次.深Ⅱ度燙傷造模成功后觀察各組大鼠存活情況,于3、7、11、15、21天時(shí)點(diǎn)觀察糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合情況并計(jì)算創(chuàng)面愈合率,在各時(shí)點(diǎn)隨機(jī)處死每組3只大鼠取燙傷皮膚全層留取標(biāo)本,行組織學(xué)切片及免疫組化染色觀察各時(shí)點(diǎn)炎性細(xì)胞,微血管形成及膠原蛋白.結(jié)果:制備的各組凝膠透明,保濕性極佳,黏附性良好,便于涂抹及清洗,無(wú)組織毒性.各組大鼠無(wú)感染及死亡發(fā)生.3天后燙傷各組創(chuàng)面無(wú)明顯縮小,7、11、15、21天時(shí),VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組創(chuàng)面愈合率最高,糖尿病組最低.VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組愈合率與其余各組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05).病理切片觀察示各時(shí)點(diǎn)VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組肉芽組織形成及上皮化均優(yōu)于其余各組.免疫組化染色示各組微血管數(shù)量、Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性率均于3天開(kāi)始表達(dá),且隨時(shí)間陽(yáng)性細(xì)胞增多明顯;各時(shí)間點(diǎn)VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組微血管密度及Ⅰ型膠原蛋白最高,糖尿病組最低,與其余各組比較以及VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠組、糖尿病組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05).結(jié)論:糖尿病大鼠皮膚深Ⅱ度燙傷外用VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠對(duì)創(chuàng)面愈合有明顯的促進(jìn)作用

    VEGF;胰島素;卡波姆凝膠;糖尿病大鼠;創(chuàng)面愈合

    隨著社會(huì)的發(fā)展,人們的物質(zhì)生活越來(lái)越豐富,糖尿病發(fā)病率也隨之提升,臨床上糖尿病合并皮膚燒傷患者創(chuàng)面難愈合已經(jīng)成為當(dāng)前急需解決的醫(yī)學(xué)難題.有研究證實(shí),糖尿病合并創(chuàng)面難愈合主要是皮下組織中糖增高和真皮層晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts, AGEs)的堆積所致的皮膚微環(huán)境改變[1-2],這種變化使創(chuàng)傷后各種促愈合的細(xì)胞因子減少,其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowth factor,VEGF)對(duì)于微血管的生成起決定性調(diào)控作用,而微血管的生成對(duì)于創(chuàng)面愈合至關(guān)重要.大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明,細(xì)胞因子和胰島素的聯(lián)合應(yīng)用可加快促進(jìn)糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合[3-5]時(shí)間.但對(duì)于糖尿病合并燒燙傷外用VEGF的研究報(bào)道較少,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)外用VEGF165-胰島素觀察糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面愈合過(guò)程中微血管密度( microvessel density,MVD)及Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況,為臨床治愈創(chuàng)面提供進(jìn)一步研究數(shù)據(jù).

    1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑:光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯中國(guó)公司),電動(dòng)離心機(jī)(華威中儀科技公司,北京),微量移液器(求精生化試劑儀器公司,上海),恒溫水浴箱(上海比朗儀器公司),磁力攪拌器(匯爾儀器公司,杭州),PH計(jì)(美尼特自動(dòng)化儀表公司,杭州),快速血糖檢測(cè)儀(glucotrend公司).CD34免疫組織化學(xué)染色試劑盒及膠原蛋白Ⅰ型多克隆抗體(北京博奧森生物公司,中國(guó)),鏈脲佐菌素(STZ, streptozotoein,sigma公司,美國(guó)),血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(VEGF165,vascular endothelial growth factor,peprotech公司,美國(guó)),低精蛋白鋅胰島素(萬(wàn)邦生化醫(yī)藥公司,江蘇),卡波姆980(天力源科技公司,青島)等.

    1.2 研究對(duì)象:75只雄性成年wistar大鼠(甘肅省中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),體重:190~290g.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):SCXK(甘)2011-001.單籠5只飼養(yǎng),飼養(yǎng)7天后開(kāi)始造模.

    1.3 實(shí)驗(yàn)分組:75只雄性成年wistar大鼠隨即分成6組,A組(正常對(duì)照組),其余60只糖尿病大鼠隨機(jī)分為B組(糖尿病對(duì)照組)、C組(胰島素凝膠治療組)、D組(VEGF165凝膠治療組)、E組(VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠治療組),每組15只大鼠.

    1.4 藥物配制

    1.4.1 檸檬酸緩沖液的配制:A液的配制:準(zhǔn)確稱取檸檬酸2.1g緩慢加入蒸餾水100ml充分溶解;B液的配制:準(zhǔn)確稱取檸檬酸鈉2.94g緩慢加入蒸餾水100ml充分溶解.配制成的A、B液分別密封冰箱冷藏保存,用時(shí)將A、B液按1:1.32混合,用pH計(jì)測(cè)量調(diào)整混合液pH值為4.2~4.5,即為STZ所需檸檬酸緩沖液.

    1.4.2 VEGF165-胰島素凝膠制備:取干燥小燒杯緩慢加入30ml蒸餾水,用電子天平準(zhǔn)確稱取0.6g卡波姆980,緩慢倒入蒸餾水中,勿攪拌搖勻.密封后放置12h后可見(jiàn)卡波姆呈絮狀充分溶于蒸餾水中,未凝結(jié)成塊.用微量移液器緩慢加入1 000μl蒸餾水于VEGF165 2μg試劑瓶中,待充分溶解后,用微量移液器取出500μl混合液和胰島素注射液1 600U,共同加入卡波姆絮狀液中,磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆?緩慢滴入三乙醇胺溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4~7.5.當(dāng)三乙醇胺加入后混合溶液馬上變?yōu)檎吵砟z狀,含大量氣泡,攪拌無(wú)法消除.取配制好的VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠,電動(dòng)離心機(jī)離心30min去除大氣泡后,冰箱低溫保存?zhèn)溆?制備胰島素凝膠、VEGF165凝膠及空白凝膠方法同上.

    1.5 實(shí)驗(yàn)方法

    1.5.1 建立糖尿病大鼠模型:實(shí)驗(yàn)用成年健康大鼠禁食前1天用血糖檢測(cè)儀檢測(cè)大鼠血糖值在正常范圍(3.0~5.0mmol/L).給予充足飲水禁食12h以上后稱取大鼠體重,按每組大鼠體重計(jì)算所需STZ (55mg/kg)用量,采用一次腹腔快速給藥法[6],正常組15只大鼠腹腔注射相同劑量檸檬酸緩沖液,以消除檸檬酸緩沖液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,注射后48h后用注射針頭刺破大鼠尾靜脈,取血液測(cè)量血糖,未禁食狀態(tài)下血糖≥16.7mmol/L為造模成功,血糖未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)的大鼠,3天后補(bǔ)充腹腔注射STZ10~15mg/kg.7天后血糖穩(wěn)定,大鼠毛發(fā),飲食、飲水量,行為活動(dòng)發(fā)生明顯改變后1型糖尿病大鼠模型造模成功.對(duì)血糖濃度太高無(wú)法檢測(cè)得到具體數(shù)據(jù)的糖尿病大鼠,皮下注射一定量的胰島素,以防血糖過(guò)高致大鼠死亡.

    1.5.2 糖尿病大鼠燙傷模型制備:造模24h前,用配制好的的脫毛膏(皂粉、硫化鈉、淀粉以1:3:6)在每只大鼠背部形成一個(gè)足夠大的裸露區(qū).根據(jù)參照文獻(xiàn)[7],恒溫水浴箱加熱致溫度80℃?zhèn)溆?按照各個(gè)大鼠體重,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)麻醉后,把其腹部向上固定于中央為4cmX4cm圓形空洞,厚度為2cm的木板上,松緊適宜,大鼠背部裸露區(qū)放置在空洞之中,將載有大鼠的木板浸泡在恒溫水浴箱中,恒溫水正好淹沒(méi)大鼠裸露皮膚.放置時(shí)間A組6S,B、C、D、E組各放置5s,燙傷后立即腹腔注射乳酸林格液10ml后,用生理鹽水紗布包裹燙傷部位,大鼠逐漸蘇醒后單籠單只喂養(yǎng),各組大鼠給予足量食物及飲水,墊料每天更換以保持鼠籠干燥,記錄大鼠飲水量、體重及進(jìn)食量.燙傷后1天肉眼觀察各組大鼠背部創(chuàng)面微潮,部分大鼠創(chuàng)面出現(xiàn)大小一致的小水泡,發(fā)紅腫脹,取大鼠燙傷皮膚組織行HE染色后鏡下觀察證實(shí)為深Ⅱ度燙傷.

    1.5.3 藥物治療:糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷模型制備成功后,行干預(yù)治療措施,A、B組創(chuàng)面分別外敷空白凝膠,C組外敷胰島素凝膠、D組外敷VEGF165凝膠及E組外敷VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠,每天換藥1次直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,換藥前用醫(yī)用棉球輕輕擦洗大鼠創(chuàng)面凝膠,最好用生理鹽水清洗創(chuàng)面.除A、B組大鼠外,其余大鼠每天檢測(cè)血糖,腹部皮下注射中長(zhǎng)效胰島素4~6U/kg,使血糖控制在正常范圍[8].

    1.5.4 標(biāo)本采集:燙傷大鼠分別在第3天、7天、11天、15天及21天時(shí)點(diǎn)隨機(jī)選取每組3只大鼠,采用腹腔注射利多卡因麻醉后行頸椎脫臼法處死,固定到一木板上,手術(shù)刀切開(kāi)大鼠創(chuàng)面邊緣皮膚,銳性剝離燙傷全層組織,剪成5mm條索狀,用10%甲醛固定,石蠟包埋,切片,用于免疫組化.

    1.5.5 燙傷面積愈合率的計(jì)算:造模成功采用透明膜描記加稱重法計(jì)算燙傷大鼠創(chuàng)面愈合率,大鼠燙傷24h后,先取透明膜描計(jì)各組創(chuàng)面輪廓,剪取同樣大小面積,質(zhì)地均勻的膠片用電子天平稱重,其重量為大鼠創(chuàng)面原始燙傷面積,采用相同描計(jì)方法計(jì)算大鼠未愈創(chuàng)面,把膠片的重量帶入下列公式進(jìn)行計(jì)算,創(chuàng)面愈合率=[(原始面積膠片重量-未愈面積膠片重量)/原始面積膠片重量]X100%.

    1.5.6 燙傷組織微血管密度:各時(shí)點(diǎn)10%甲醛固定標(biāo)本組織,石蠟包埋,切片成功后,嚴(yán)格按照CD34免疫組化步驟進(jìn)行操作,給大鼠各時(shí)點(diǎn)切片染色后,顯微鏡下觀察到棕黃色為血管內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性染色,每張染色片在10X40倍取6個(gè)視野計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)數(shù)量,計(jì)算平均值作為新生血管形成指標(biāo).采用Pareek[9]方法計(jì)算MVD.

    1.5.7 燙傷組織Ⅰ型膠原蛋白:取大鼠各組各時(shí)點(diǎn)部分切片,行大鼠Ⅰ型膠原免疫組化染色,顯微鏡下觀察,陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色或黃色.在10X40倍鏡下,創(chuàng)面隨機(jī)選取5個(gè)視野,應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算得出Ⅰ型膠原的陽(yáng)性面積,取其均值.

    1.5.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示,各組間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05.

    2 結(jié)果

    2.1 各組燙傷糖尿病大鼠各時(shí)點(diǎn)血糖測(cè)定:見(jiàn)表1.

    2.2 糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合觀察:糖尿病大鼠燙傷24h后,燙傷面積與模板面積大小一致,燙傷邊緣與周圍正常組織界限清楚,界限明顯發(fā)紅,水腫.燙傷3天后各組大鼠創(chuàng)面均未見(jiàn)縮小,創(chuàng)面皮溫增高,有大量滲出液,部分滲出物結(jié)痂,用生理鹽水棉球輕輕去除滲出物后可見(jiàn)創(chuàng)面基地部呈紅白相間,水腫較明顯,痛覺(jué)較為遲鈍.其中B組大鼠創(chuàng)面滲出明顯較多,水腫也最為明顯,A、C、D組大鼠次之,三組之間無(wú)明顯差異,E組大鼠相對(duì)其它組滲出物較少.各組大鼠創(chuàng)面滲出物部分結(jié)痂,結(jié)痂物周圍顏色輕微黃,質(zhì)稀薄,無(wú)特殊氣味.燙傷15天,愈合面積E>D>C>A,除B組外,其余各組大鼠創(chuàng)面周圍及毛囊邊緣創(chuàng)面已部分愈合,其中E組大鼠創(chuàng)面皮膚角化形成良好.B組大鼠創(chuàng)面開(kāi)始愈合,可見(jiàn)邊緣上皮組織向中央爬行.燙傷21天,E組大鼠燙傷創(chuàng)面大部分基本已愈合,僅燙傷中央留少量未愈創(chuàng)面,愈合創(chuàng)面新生成的皮膚組織角化形成良好,可見(jiàn)密集細(xì)小的毛發(fā)生長(zhǎng),C、D組也大部分愈合,但中央存留未愈面積較E組大,皮膚角化形成好,見(jiàn)細(xì)小少量毛發(fā)生長(zhǎng),A組較C、D、E組愈合差,B組創(chuàng)面是各組愈合中最差.各組大鼠實(shí)驗(yàn)中均無(wú)死亡及感染.

    2.3 微血管密度(MVD)的檢測(cè):CD34免疫組化均成陽(yáng)性在燙傷后各組大鼠時(shí)點(diǎn)均表達(dá),但隨時(shí)間增長(zhǎng)E組大鼠陽(yáng)性細(xì)胞最多,其余各組次之,B組陽(yáng)性表達(dá)最少.11天時(shí)E組大鼠陽(yáng)性表達(dá)達(dá)最大值,其余各組大鼠于15天時(shí)達(dá)高峰(見(jiàn)圖1).B、E組大鼠各觀測(cè)時(shí)點(diǎn)與其他各組大鼠相比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即:<0.05.燙傷3天時(shí),A、C、D組大鼠CD34陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即>0.05.從燙傷7天開(kāi)始,燙傷創(chuàng)面C、D組大鼠組織CD34陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均高于A組,存在明顯差異性,即<0.05. C、D組糖尿病大鼠創(chuàng)面CD34陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)各觀測(cè)時(shí)點(diǎn)比較差異不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即:>0.05.見(jiàn)表2.

    2.4Ⅰ 型膠原表達(dá)的測(cè)定:燙傷3天后C、D組大鼠創(chuàng)面Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)無(wú)顯著差異,但隨時(shí)間延長(zhǎng),Ⅰ型膠原陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多,E組大鼠創(chuàng)面組織含量最高,其余各組次之,B組大鼠創(chuàng)面膠原含量最少.燙傷7、11、15天,除E組大鼠外,其余各組主要表達(dá)于肉芽組織及血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍,E組大鼠在7、11天時(shí)表達(dá)于肉芽組織及血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍,15天時(shí)Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)在真皮層沉積,呈小團(tuán)塊無(wú)序線性排列(見(jiàn)圖2).21天時(shí)各組Ⅰ型膠原均主要在新生上皮基底細(xì)胞表達(dá),C、D組真皮層可見(jiàn)大量膠原,數(shù)量多且粗大,B組真皮層膠原含量最少,A組膠原含量次于C、D組,而E組真皮層缺損處可見(jiàn)大量膠原纖維填充,創(chuàng)面部分輕微攣縮.E組糖尿病大鼠燙傷組織Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)從燙傷3天開(kāi)始與其他組相比較有明顯的差異性,而B(niǎo)組大鼠表達(dá)最低,E、B組比較及兩組與其余各組大鼠比較均存在差異性(<0.05);燙傷7、11、15、21天時(shí),A組Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)均低于C、D、E組(<0.05),燙傷3天時(shí),Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)A組與C、D組比較無(wú)明顯差異性(>0.05),各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)Ⅰ型膠原蛋白陽(yáng)性表達(dá)C、D組間比較均無(wú)差異均性(>0.05).見(jiàn)表3.

    圖1 傷后15天各組大鼠創(chuàng)面CD34免疫組化微血管陽(yáng)性(SPX400)表達(dá)情況

    圖2 傷后15天各組大鼠創(chuàng)面Ⅰ型膠原陽(yáng)性(SPX400)表達(dá)情況

    表1 各組大鼠各時(shí)相點(diǎn)血糖(mmol/L)

    表2 各組大鼠不同時(shí)相點(diǎn)微血管密度表達(dá)(n=3,條/mm2,±)

    表3 各組大鼠不同時(shí)相點(diǎn)Ⅰ型膠原密度表達(dá)(n=3,條/mm2,±)

    3 討論

    創(chuàng)面愈合是一個(gè)連續(xù)的由多個(gè)互相交叉重疊過(guò)程組成,需通過(guò)各種細(xì)胞相互活動(dòng),相互影響來(lái)協(xié)同完成.這些活動(dòng)并非隨意發(fā)生,而是有序地進(jìn)行調(diào)節(jié),與傷口中不同類型細(xì)胞的參與有關(guān)[10].而實(shí)驗(yàn)證實(shí),糖尿病患者皮膚組織血糖與細(xì)胞因子水平呈負(fù)相關(guān)、過(guò)度的蛋白酶分解以及皮下神經(jīng)、血管病變等諸多因素,導(dǎo)致了皮膚創(chuàng)面不愈或延遲愈合[11-13].

    研究表明,糖尿病大鼠皮膚深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面局部組織VEGF含量低下導(dǎo)致血管分化低下,致創(chuàng)面血供明顯少于非高血糖組織,肉芽組織形成遲緩等變化,呈現(xiàn)創(chuàng)面不愈或難愈的特征[14].近年,糖尿病合并燙傷創(chuàng)面難愈合研究發(fā)現(xiàn),局部細(xì)胞因子含量對(duì)創(chuàng)面愈合影響至關(guān)重要,其中VEGF是非常重要的因子之一.VEGF是能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,又能促進(jìn)血管保持正常狀態(tài)[15].在血管形成發(fā)展過(guò)程中,缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是轉(zhuǎn)錄活化編碼VEGF基因的活化因子,從而刺激血管形成[16-17].而HIF-l的活性[18]由缺氧誘導(dǎo)因子-1a(Hypoxia inducible factor-1a,HIF-1a)決定.組織中HIF-1a含量升高將抑制HIF-l的活性,糖尿病慢性創(chuàng)面引起了組織缺血缺氧,使創(chuàng)面組織中HIF-1a分泌增加,致VEGF含量減少[19]從而導(dǎo)致創(chuàng)面的愈合延遲或不愈合.喬亮等[20]利用熒光微球?qū)μ悄虿〈笫笊睥蚨葼C傷創(chuàng)面血管化進(jìn)行觀察,得出創(chuàng)面新生血管化程度、數(shù)量及質(zhì)量與對(duì)照組相比明顯降低.由此推斷糖尿病創(chuàng)面VEGF濃度較正常創(chuàng)面降低,使其無(wú)法促進(jìn)血管生成,致新鮮肉芽組織明顯缺乏.本實(shí)驗(yàn)就是利用糖尿病大鼠皮膚組織中HIF-1活性抑制,VEGF含量不足,外用VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和體表血管生成,初步證實(shí)外用一定濃度的VEGF165-胰島素復(fù)合凝膠對(duì)創(chuàng)面愈合有明顯的促進(jìn)作用.

    創(chuàng)面愈合中膠原的形成也非常重要,膠原由成纖維細(xì)胞分泌,參與組成肉芽組織,以覆蓋創(chuàng)面,促進(jìn)創(chuàng)面愈合.膠原蛋白的生成與成纖維細(xì)胞增殖呈正相關(guān).成纖維細(xì)胞在傷口4~5天開(kāi)始通過(guò)有絲分裂增殖、分化,并合成和分泌大量的膠原纖維和基質(zhì)成分,與新生毛細(xì)血管、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞共同組成肉芽組織,填充組織缺損,覆蓋創(chuàng)面,為表皮細(xì)胞的生成創(chuàng)造條件[21].成纖維細(xì)胞合成的膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分,膠原形成數(shù)量直接影響創(chuàng)面的修復(fù)質(zhì)量和愈合時(shí)間.在成纖維細(xì)胞分泌合成的膠原中,在皮膚組織中起主要作用的是I、Ⅲ型膠原,Ⅰ型膠原纖維位于真皮層,起支持作用,而Ⅲ型膠原呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)環(huán)繞在外周決定膠原纖維的彈性[22].而糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合過(guò)程中,成纖維細(xì)胞有絲分裂的S期數(shù)量及質(zhì)量明顯低于正常大鼠,成纖維細(xì)胞的DNA合成水平明顯下降,表明在皮膚組織高血糖狀態(tài)下成纖維細(xì)胞的增殖明顯放緩[23].這與本實(shí)驗(yàn)B組大鼠檢測(cè)膠原蛋白免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯偏少是一致的.同時(shí)有研究也表明,VEGF對(duì)增生性瘢痕形成有促進(jìn)作用[24],VEGF及其受體在增生性瘢痕組織中表達(dá)活躍.岳毅剛等[25]利用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體局部注射治療增生性瘢痕,結(jié)果顯示瘢痕體積明顯減少,組織內(nèi)血管數(shù)量減少,膠原纖維明顯減少,大劑量尤為明顯.這表明VEGF可以促進(jìn)創(chuàng)面膠原蛋白生成.

    研究證實(shí),視網(wǎng)膜mü ller細(xì)胞在高濃度的胰島素作用下能促進(jìn)的VEGF高表達(dá)[26],這說(shuō)明胰島素可能抑制組織中HIF-1a的活性,促進(jìn)HIF-1在組織水平升高,從而刺激VEGF增高,促進(jìn)血管生成.胰島素外用于創(chuàng)面可調(diào)節(jié)創(chuàng)面周圍物質(zhì)代謝, Zhang等[27]用小劑量胰島素治療燙燒大鼠,運(yùn)用同位素追蹤技術(shù)測(cè)量蛋白質(zhì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島素治療組創(chuàng)面中蛋白質(zhì)的含量明顯高于對(duì)照組,且炎癥反應(yīng)輕,低血糖反應(yīng)發(fā)生率低,進(jìn)一步證實(shí)胰島素能加速創(chuàng)面愈合.本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這點(diǎn),C組創(chuàng)面愈合率、愈合時(shí)間、MVD、Ⅰ型膠原蛋白等指標(biāo)均優(yōu)于于B組大鼠和A組大鼠.

    本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用空白凝膠、含胰島素凝膠、含VEGF165凝膠和含VEGF165-胰島素凝膠作為分組,以抵消卡波姆凝膠本身對(duì)創(chuàng)面愈合的影響.而卡波姆對(duì)活體細(xì)胞及組織無(wú)任何損害,以卡波姆凝膠作為VEGF165、胰島素的賦形劑,既方便了創(chuàng)面敷藥物的操作性,同時(shí)也保證了一定時(shí)間內(nèi)局部創(chuàng)面VEGF165、胰島素濃度的持續(xù)性和穩(wěn)定性.同時(shí)凝膠還可以為創(chuàng)面提供溫暖、濕潤(rùn)的局部微環(huán)境,在一定程度上能夠保護(hù)創(chuàng)面及促進(jìn)愈合[28].卡波姆溶于水呈酸性,直接用于創(chuàng)面治療,酸性pH值對(duì)愈合影響巨大[29].人體生理?xiàng)l件下微環(huán)境pH值通常維持在7.35~7.45之間,微堿性,因此本實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組凝膠的pH值設(shè)置接近人體.通過(guò)實(shí)驗(yàn),卡波姆凝膠應(yīng)用到燙傷創(chuàng)面能有效保護(hù)創(chuàng)面,防止感染,不對(duì)創(chuàng)面造成二次損傷,達(dá)到了本次實(shí)驗(yàn)作為基質(zhì)運(yùn)用的效果.

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:保持一定穩(wěn)定濃度的VEGF165、胰島素外用對(duì)深I(lǐng)I度燙傷的糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合有顯著地促進(jìn)作用.創(chuàng)面外敷VEGF165-胰島素凝膠后,創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯提前,創(chuàng)面愈合率比同期對(duì)照組高.早期膠原蛋白含量及毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多,上皮化時(shí)間早,新生表皮厚度大于同期對(duì)照組.創(chuàng)面局部膠原蛋白、新生毛細(xì)血管的陽(yáng)性數(shù)量表達(dá)遠(yuǎn)高于同期對(duì)照組.

    [1]陸樹(shù)良,謝挺,牛軼雯,等.創(chuàng)面難愈的機(jī)制研究-糖尿病皮膚的"微環(huán)境污染"[J].中華燒傷雜志,2008,24(1):3-5.

    [2]Lian H,Zakhaleva J,Chen W.Cell and tissue interactions with glycated collagen and their relevance to delayed diabetic wound healing[J].Blomaterials,2009,30(9):1689-1696.

    [3]張冀北,薛曉東,謝沛霖,等.局部聯(lián)合應(yīng)用NGF及胰島素對(duì)糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面血管形成及Bcl-2、Bax表達(dá)的影響[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志,2011,25(3):354-360.

    [4]謝沛霖,薛曉東,張冀北,等.局部應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子聯(lián)合胰島素對(duì)糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面愈合及HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)師雜志,2011,13(1):33-37.

    [5]常飛,薛曉東,謝沛霖,等.聯(lián)合應(yīng)用NGF和胰島素對(duì)糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面表皮干細(xì)胞的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012,12(7):1236-1240.

    [6]農(nóng)慧,盛慶壽,梁健,等.STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,27(1):69-72.

    [7]林煒棟,陸樹(shù)良,青春,等.糖尿病大鼠深二度燙傷創(chuàng)面VEGF和bFGF的表達(dá)規(guī)律及其創(chuàng)面微血管密度的關(guān)系[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2003,83(19):1702-1704.

    [8]王竹,楊月欣,向雪松,等.實(shí)驗(yàn)大鼠血糖正常范圍的估算[J].衛(wèi)生研究,2010,39(2):133-137

    [9]Pareek G,Shevchuk M,Armenakas NA,et al.The effect of finasteride on the expression of vascular endothelial growth factor and microvessel density:A possible mechanism for decreased prostatic bleeding in treated patients[J].J Urology, 2003,169(1):20-23.

    [10]Sherrell JA,Robert WB,Charles HM.Grabb and Smith's Plastic Surgery[M].郭樹(shù)忠,等譯.5版.西安:世界圖書(shū)出版西安公司,2002:3-4.

    [11]Lobmann R,Ambrosch A,Schultz G,et al.Expression of matrix-metalloprprotoinases and their inhibitors in the woundsofdiabeticandnon-diabeticpatients[J]. Diabetologia,2002,45(2):1011-1016.

    [12]LermanOZ,GalianoRD,ArmourM,etal.Celluar dysfunction in the diabetic fibroblast[J].Am J Pathol, 2003,162(1):303-312.

    [13]Ge K,Qing C,Lu SL.Epidermal growth factor receptor and impaired wound healing in diabetes[J].Chinese Journal Clinical Rehabilitation,2003,7(6):944-945.

    [14]葛奎,陸樹(shù)良,青春,等.氨基胍對(duì)糖尿病燒傷創(chuàng)面促愈作用的研究[J].中華創(chuàng)傷雜志,2004,20(8):17-21.

    [15]Stefanini MO,Wu FT,Mac Gabhann F,et a1.A compartment model of VEGF distribution in blood,healthy and diseased tissues[J].BMC Systerms Biology,2008,2:77.

    [16]Dai Y,Xu MF,Wang YG,et a1.HIF-1a induced VEGF over-expressioninbonemarrowstemcellsprotects cardio-myocytes against ischemia[J].J Mol Cell Cardiol, 2007,42(6):1036-1044.

    [17]Thomas P,Angelika L,Bodo K,et a1.Mechanical overload induces VEGF in cartil-age discs via hypoxia-inducible factor[J].Am J Pathol,2004,164(1):185-192.

    [18]Jennifer EZ,Ion SJ,Yan H.Hypoxia-inducible factor(HIF)-l regulatorypathwayanditspotentialfortherapeutic intervention in malignancy and ischemia[J].Yale J Biol Med,2007,80(2):51-60.

    [19]Robert DG,Oren MT,Catherine RP,et a1.Topical vascular endothelialgrowt-hfactoracceleratesdiabeticwound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-de-rived Cells[J].Am J Pathol, 2004,164(6):1935-1947.

    [20]喬亮,王志勇,韋俊,等.糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面新生血管形成障礙的研究[J].中華燒傷雜志,2008,2(24):18-21.

    [21]贠健,楊關(guān)根,黃常新,等.大鼠感染創(chuàng)面肉芽組織膠原代謝的改變[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2009,15(6):656.

    [22]Gallant CL,Olson ME,Hart DA.Molecular,histologic and gross phenotype of shin wo-und healing in red duroc pigs reveals an abnormal healing pherotype of hyperpiymented scaring[J].Wound Repair Regan,2004,12(3):305.

    [23]牛軼雯,陸樹(shù)良,謝挺,等.糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的改變[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,26(1):63-65.

    [24]錢利,趙柏程,皮立,等.瘢痕組織中微血管數(shù)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的研究[J].中國(guó)燒傷創(chuàng)瘍雜志,2003,15(4): 285-289.

    [25]岳毅剛,蔣常文,李佩英,等.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體靶血管治療對(duì)增生性瘢痕Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)燒傷雜志,2006,22(6):427-430.

    [26]Song E,Yue H,X Qi,et a1.Effects of high-concentration insulin on expression of vascular endothelial growth factor in cultured Muller cells in vitro[J].Chin J Ophthalmol, 2004,40(1):201-204.

    [27]Zhang XJ,Chinkes DL,Wolf SE,et al.Insulin but not growth ormone stimulates protein anabolis in skin wound and muscle[J].Am J Physiol,1999,276(4pt1):E712-20.

    [28]Kaya AI,Turani N,Akyui M.The effectiveness of a hydrogel dressing compared with standard management of pressure ulcers[J].J Wound Care,2005,14(1):42-44.

    [29]Dissemind J,Withoff M,Brauns JC,et al.Ph values in chronic wounds.Evaluationduringmodernwoundtherapy[J]. Hautarzt,2003,54(10):959-965.

    Impact VEGF165-insulin composite gel in diabetic rats localⅡdeep degree burn wounds expression of MVD and collagenⅠ

    QI Wan-qiang1,XUE Xiao-dong2,RUAN Tao1,LIU Jin-ke1
    (1.The First Clinical Medical College of Lanzhou University,Lanzhou 730000,Gansu,China; 2.Department of Plastic Surgery,Gansu Province People's Hospital,Lanzhou 730000,Gansu,China)

    ObjectivePreparation of topical gel VEGF165-insulin complex and observe its deepⅡde-gree burn wound healing in diabetic rats role.MethodsCarbomer with new gel matrix,were added to VEGF165,insulin,insulin were formulated into a gel,VEGF165 gel,VEGF165-insulin composite gel and control gel.Gel characters of each group,the pH value of the detection.75 SPF male Wistar rats weighing 190~290g,were randomly divided into normal control group,diabetic control group,insulin gel group,VEGF165 gel group,VEGF165-insulin gel composite groups 15.Inaddition to the normal control group,the other groups of rats were fasted 12h after intraperitoneal injection of streptozotocin(55mg/kg)Preparation of type 1 diabetes model,normal control rats injected at the same dose fasting sodium citrate buffer fluid.Type 1 diabetes in rats after successful modeling,using heated water bath 80℃,the preparation of deepⅡdegree burn model.Normal control group,diabetic control group topical wound gel matrix blank,the rest of the group corresponding topical gel formulation,dressing once a day.DeepⅡdegree burns after a successful modeling survival of the rats was observed at 3,7,11,15,21d point of wound healing in diabetic rats and calculate the rate of wound healing in each group were sacrificed at each time point 3 rats take full thickness skin burns specimens were taken for histological sections and immunohistochemical staining of inflammatory cells at each time point,angiogenesis and collagen.Results Each group prepared a transparent gel,moisturizing excellent,good adhesion,easy painting and cleaning,no tissue toxicity.The rats without infection and death.3d no after burn wounds in each group was significantly reduced,7,11,15,21d when VEGF165-insulin compound gel group the highest rate of wound healing,diabetic group was the lowest,VEGF165-insulin compound gel group healing rate with the rest of the group,the difference were statistically significant(<0.05).Histopathological examination shows each time point VEGF165-insulin compound gel group granulation tissue formation and epithelialization were better than the rest of the group.Immunohistochemical staining showed that the number of microvessels in each group,Ⅰcollagen expression positive rates start at 3d,and the positive cells was significantly increased with time;each time point VEGF165-insulin highest composite gel group microvessel density and collagen typeⅠdiabetes lowest group,with other groups and VEGF165-insulin compound gel group,the difference was statistically significant(<0.05) between the diabetic group.ConclusionDiabetic rat skin deepⅡdegree burns topical gel VEGF165-insulin complex on wound healing have significant role in promoting

    VEGF;insulin;carbomer gel;diabetic rats;wound healing

    R587.1

    A

    1008-6455(2014)21-1799-07

    2014-09-27

    2014-11-13

    編輯/張惠娟

    薛曉東,男,教授,主任醫(yī)師,碩士研究生導(dǎo)師;擅長(zhǎng)危重?zé)齻木戎?難愈性創(chuàng)面的治療和各種美容整形手術(shù).甘肅省人民醫(yī)院整形科,蘭州市城關(guān)區(qū)東崗西路204號(hào),郵編:730000

    猜你喜歡
    胰島素糖尿病
    如何選擇和使用胰島素
    人人健康(2023年26期)2023-12-07 03:55:46
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    中老年保健(2022年5期)2022-08-24 02:35:42
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    中老年保健(2022年1期)2022-08-17 06:14:56
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    中老年保健(2021年5期)2021-08-24 07:07:20
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    中老年保健(2021年9期)2021-08-24 03:51:04
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    中老年保健(2021年7期)2021-08-22 07:42:16
    糖尿病知識(shí)問(wèn)答
    自己如何注射胰島素
    門(mén)冬胰島素30聯(lián)合二甲雙胍治療老年初診2型糖尿病療效觀察
    糖尿病的胰島素治療
    热re99久久国产66热| 一级毛片女人18水好多 | 欧美日韩av久久| 国产老妇伦熟女老妇高清| 九色亚洲精品在线播放| 97人妻天天添夜夜摸| 国产亚洲av高清不卡| 国产成人精品久久二区二区免费| a级毛片黄视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 97人妻天天添夜夜摸| 美女视频免费永久观看网站| 久久久国产欧美日韩av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 午夜影院在线不卡| 欧美激情 高清一区二区三区| 黄色一级大片看看| 99国产综合亚洲精品| 久久久亚洲精品成人影院| 十八禁人妻一区二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 午夜激情久久久久久久| 美女扒开内裤让男人捅视频| 精品第一国产精品| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 美女中出高潮动态图| 欧美97在线视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久av网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲黑人精品在线| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 又大又爽又粗| 又大又爽又粗| 亚洲伊人久久精品综合| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 黑人猛操日本美女一级片| 色视频在线一区二区三区| 在线观看国产h片| 亚洲色图综合在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲美女黄色视频免费看| 99热国产这里只有精品6| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 精品国产国语对白av| 亚洲精品国产av成人精品| 2021少妇久久久久久久久久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产亚洲一区二区精品| 妹子高潮喷水视频| 自线自在国产av| 人妻 亚洲 视频| 免费高清在线观看日韩| 后天国语完整版免费观看| 精品久久久久久电影网| 国产精品免费大片| 男男h啪啪无遮挡| 九色亚洲精品在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 男女午夜视频在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久久欧美国产精品| 国产精品二区激情视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产欧美亚洲国产| 交换朋友夫妻互换小说| 性少妇av在线| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 黄色片一级片一级黄色片| 大香蕉久久成人网| 最新在线观看一区二区三区 | 美女国产高潮福利片在线看| 日韩一区二区三区影片| 新久久久久国产一级毛片| 1024香蕉在线观看| 色网站视频免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产av一区二区精品久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 午夜老司机福利片| 国产成人av激情在线播放| a级毛片黄视频| 欧美在线黄色| www.av在线官网国产| 1024视频免费在线观看| 最新在线观看一区二区三区 | 亚洲五月色婷婷综合| 国产成人系列免费观看| 成年人免费黄色播放视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 爱豆传媒免费全集在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| h视频一区二区三区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 少妇人妻 视频| 看免费av毛片| 一级a爱视频在线免费观看| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲第一青青草原| 成年人午夜在线观看视频| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品国产av成人精品| 日本欧美国产在线视频| 中文字幕亚洲精品专区| 国产午夜精品一二区理论片| 波野结衣二区三区在线| 日本午夜av视频| 亚洲国产欧美在线一区| av国产精品久久久久影院| 久热爱精品视频在线9| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 青春草视频在线免费观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 美女大奶头黄色视频| 久久这里只有精品19| 久久国产精品人妻蜜桃| 在线 av 中文字幕| 悠悠久久av| 亚洲成人免费av在线播放| 十八禁网站网址无遮挡| 久久久亚洲精品成人影院| 国产成人欧美在线观看 | 免费不卡黄色视频| 精品一区在线观看国产| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久国产精品大桥未久av| 制服诱惑二区| 男的添女的下面高潮视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 狂野欧美激情性xxxx| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲欧美一区二区三区久久| 一级a爱视频在线免费观看| 美女视频免费永久观看网站| 午夜福利乱码中文字幕| 国产男女超爽视频在线观看| 最黄视频免费看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一级毛片我不卡| 亚洲av综合色区一区| 午夜免费观看性视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 男女边摸边吃奶| 国产男女内射视频| 国产精品久久久久成人av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产午夜精品一二区理论片| 99国产综合亚洲精品| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产成人精品无人区| 交换朋友夫妻互换小说| 十分钟在线观看高清视频www| 久久精品久久精品一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 老熟女久久久| 欧美日本中文国产一区发布| 日韩av不卡免费在线播放| 大码成人一级视频| 看免费av毛片| 丰满饥渴人妻一区二区三| 熟女av电影| 亚洲激情五月婷婷啪啪| av网站在线播放免费| 99久久综合免费| 国产精品熟女久久久久浪| 国产爽快片一区二区三区| 1024香蕉在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 少妇 在线观看| 天天影视国产精品| 成在线人永久免费视频| 美女主播在线视频| 大片电影免费在线观看免费| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲第一青青草原| 亚洲国产欧美一区二区综合| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| kizo精华| 啦啦啦在线观看免费高清www| 另类精品久久| 日本a在线网址| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 三上悠亚av全集在线观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 香蕉丝袜av| 欧美精品av麻豆av| 免费黄频网站在线观看国产| 日韩伦理黄色片| 手机成人av网站| 亚洲国产日韩一区二区| 精品一区在线观看国产| 日本欧美视频一区| 人人澡人人妻人| 成人国产一区最新在线观看 | 飞空精品影院首页| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 99九九在线精品视频| 国产精品久久久av美女十八| 午夜老司机福利片| 亚洲精品第二区| 99国产综合亚洲精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜福利视频在线观看免费| 18在线观看网站| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 免费看不卡的av| 七月丁香在线播放| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产伦人伦偷精品视频| av在线播放精品| 日韩电影二区| 日韩大片免费观看网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 这个男人来自地球电影免费观看| 精品久久久精品久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久毛片免费看一区二区三区| 操美女的视频在线观看| 成年av动漫网址| 1024视频免费在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美人与性动交α欧美软件| 久久精品人人爽人人爽视色| av国产精品久久久久影院| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 日韩 亚洲 欧美在线| 黑丝袜美女国产一区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产真人三级小视频在线观看| 美女主播在线视频| 妹子高潮喷水视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 午夜激情av网站| 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品一区二区免费欧美 | 免费观看av网站的网址| 中文字幕高清在线视频| 日本黄色日本黄色录像| 两个人看的免费小视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| av又黄又爽大尺度在线免费看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日韩一区二区三区影片| 一级,二级,三级黄色视频| 日韩免费高清中文字幕av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 青青草视频在线视频观看| 美女中出高潮动态图| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产精品久久久久久精品古装| 交换朋友夫妻互换小说| 高清欧美精品videossex| 岛国毛片在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费少妇av软件| 日韩制服骚丝袜av| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产黄频视频在线观看| 99热全是精品| 视频在线观看一区二区三区| 老司机在亚洲福利影院| 久久人妻福利社区极品人妻图片 | 日本a在线网址| 大片免费播放器 马上看| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品欧美亚洲77777| 精品亚洲成国产av| 国产国语露脸激情在线看| 性色av一级| 久久免费观看电影| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美日韩综合久久久久久| av在线播放精品| 久久av网站| 黑人猛操日本美女一级片| 搡老岳熟女国产| 少妇人妻久久综合中文| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 美女大奶头黄色视频| 超碰成人久久| 免费观看人在逋| 国产成人精品久久二区二区免费| 成人免费观看视频高清| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费av中文字幕在线| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲伊人色综图| av福利片在线| 久久久久久久国产电影| 国产精品一国产av| 久久人人爽人人片av| 美女大奶头黄色视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 永久免费av网站大全| av不卡在线播放| 丝袜美腿诱惑在线| 人妻人人澡人人爽人人| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲中文av在线| 色视频在线一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲视频免费观看视频| 国产一区二区在线观看av| 欧美人与性动交α欧美软件| 在线观看免费视频网站a站| 午夜福利免费观看在线| 亚洲成国产人片在线观看| 丝袜脚勾引网站| 精品一区二区三卡| 香蕉国产在线看| 美女福利国产在线| 国产免费又黄又爽又色| 国产精品一国产av| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产真人三级小视频在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 飞空精品影院首页| 国产熟女欧美一区二区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲精品国产av成人精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产免费视频播放在线视频| 国产男女超爽视频在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 色94色欧美一区二区| 在线观看免费高清a一片| www.999成人在线观看| 精品第一国产精品| www.999成人在线观看| 色视频在线一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产精品九九99| 亚洲,一卡二卡三卡| 捣出白浆h1v1| 99国产精品99久久久久| 国产av精品麻豆| netflix在线观看网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品少妇久久久久久888优播| 高清视频免费观看一区二区| 国产男人的电影天堂91| 91字幕亚洲| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美精品一区二区免费开放| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品少妇久久久久久888优播| videos熟女内射| 国产精品一国产av| 欧美日韩黄片免| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久国产一区二区| 国产日韩欧美在线精品| 777米奇影视久久| 日本91视频免费播放| 国产成人影院久久av| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 满18在线观看网站| 国产av国产精品国产| 男女无遮挡免费网站观看| 1024视频免费在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产黄频视频在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看 | 在线观看人妻少妇| 麻豆av在线久日| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲第一青青草原| 国产一区亚洲一区在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 国产成人a∨麻豆精品| 91字幕亚洲| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲,欧美,日韩| 国产成人欧美在线观看 | 国产精品久久久av美女十八| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产精品免费视频内射| 黑丝袜美女国产一区| 激情五月婷婷亚洲| 午夜影院在线不卡| 日本一区二区免费在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 2021少妇久久久久久久久久久| 黄色视频不卡| 国产片内射在线| 日韩视频在线欧美| 欧美黄色淫秽网站| 男人操女人黄网站| 人体艺术视频欧美日本| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲欧美色中文字幕在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜两性在线视频| 免费观看av网站的网址| 黄色毛片三级朝国网站| 人妻一区二区av| 男女边吃奶边做爰视频| 午夜福利视频在线观看免费| 操出白浆在线播放| 一区二区三区激情视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 精品久久久精品久久久| 国产三级黄色录像| 国产男女内射视频| 久久久国产欧美日韩av| 欧美日韩视频精品一区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 日日夜夜操网爽| 午夜福利,免费看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 丝袜喷水一区| 又大又黄又爽视频免费| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日本欧美国产在线视频| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲色图综合在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产高清videossex| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产一区二区在线观看av| 久久久久久人人人人人| 久久性视频一级片| 亚洲五月色婷婷综合| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产熟女午夜一区二区三区| videos熟女内射| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产精品二区激情视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲精品成人av观看孕妇| 在线观看免费午夜福利视频| 午夜福利视频在线观看免费| 搡老乐熟女国产| av有码第一页| 曰老女人黄片| 国产精品一国产av| av在线老鸭窝| 在线观看国产h片| 国产一区二区激情短视频 | 国产精品国产三级国产专区5o| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产成人系列免费观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产精品.久久久| 免费日韩欧美在线观看| 只有这里有精品99| av天堂在线播放| 国产精品免费大片| 在线天堂中文资源库| 婷婷色综合www| 免费看十八禁软件| 91字幕亚洲| 一边亲一边摸免费视频| 欧美人与善性xxx| 9191精品国产免费久久| 一级,二级,三级黄色视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 各种免费的搞黄视频| 1024香蕉在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 午夜视频精品福利| 婷婷丁香在线五月| 十八禁网站网址无遮挡| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品国产三级专区第一集| 99久久人妻综合| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日本黄色日本黄色录像| 在现免费观看毛片| 免费观看a级毛片全部| 在线观看人妻少妇| 亚洲情色 制服丝袜| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 亚洲精品乱久久久久久| 免费看不卡的av| 中文字幕高清在线视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 精品久久久久久电影网| 国产av一区二区精品久久| 一区二区三区四区激情视频| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产成人免费观看mmmm| 宅男免费午夜| 男男h啪啪无遮挡| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 热99国产精品久久久久久7| 国产成人精品久久久久久| 9热在线视频观看99| 51午夜福利影视在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 51午夜福利影视在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 人成视频在线观看免费观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 天天操日日干夜夜撸| 一级a爱视频在线免费观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲五月色婷婷综合| 青草久久国产| 黄色 视频免费看| 国产国语露脸激情在线看| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美精品一区二区大全| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 亚洲九九香蕉| 欧美性长视频在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 欧美成人午夜精品| 午夜av观看不卡| 中文字幕制服av| 日本wwww免费看| av在线app专区| 亚洲精品美女久久av网站| 首页视频小说图片口味搜索 | 免费看十八禁软件| 久久精品久久久久久久性| 男人操女人黄网站| av天堂在线播放| 成人三级做爰电影| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 日韩中文字幕欧美一区二区 | 少妇粗大呻吟视频| 少妇人妻久久综合中文| 一个人免费看片子| 午夜久久久在线观看| 亚洲国产精品999| 日日爽夜夜爽网站| 国产熟女欧美一区二区| www日本在线高清视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 天堂俺去俺来也www色官网| 99香蕉大伊视频| 欧美97在线视频| 丝袜美足系列| 丝袜人妻中文字幕| 欧美av亚洲av综合av国产av| 中文字幕av电影在线播放| 男女边摸边吃奶| 久久久国产欧美日韩av| 久久综合国产亚洲精品| 午夜福利免费观看在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 日本欧美视频一区| 欧美大码av| 女性生殖器流出的白浆| 欧美性长视频在线观看| 国产黄色免费在线视频| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美日韩黄片免|