滑子菇多糖的體外生物活性初步研究

李佳媚，孫潤廣，郭國赟，張 智

(1.陜西師范大學(xué)物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院，西安710062； 2.陜西服裝工程學(xué)院，咸陽712046)

滑子菇多糖的體外生物活性初步研究

李佳媚1，2，孫潤廣1，郭國赟1，張 智1

(1.陜西師范大學(xué)物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院，西安710062； 2.陜西服裝工程學(xué)院，咸陽712046)

為了研究滑子菇水提粗多糖(PNP)的體外生物活性，對滑子菇多糖的總還原力、清除1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)和由Fe2+誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用進行研究，采用MTT比色法和胎盤藍細胞計數(shù)檢測對滑子菇水提粗多糖的體外抑制K562細胞生長作用進行了研究，采用流失細胞術(shù)對滑子菇多糖作用人白血病K562細胞后的細胞周期進行了研究。結(jié)果表明：滑子菇水提粗多糖PNP具有一定的還原能力；在高質(zhì)量濃度(800 μg/mL)時具有接近于Vc清除DPPH· 的能力，達41.28%；PNP對Fe2+誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)具有一定的抑制作用，并且隨著濃度的增加抑制作用逐漸增強，但總的增長趨勢不大；MTT實驗表明PNP對K562細胞的體外增長有抑制作用，在質(zhì)量濃度為800 μg/mL和作用時間為48 h時，可達到最高的抑制率35.03%。流式細胞術(shù)對細胞周期的檢測表明滑子菇多糖能夠阻滯人白血病K562細胞于G1期。

抗氧化；抗腫瘤；滑子菇；滑子菇多糖

多糖是自然界中含量最豐富的生物大分子物質(zhì)，具有儲存能量、構(gòu)成生物體結(jié)構(gòu)物質(zhì)、抗病毒、抗衰老等功能，有些多糖還是非特異性的免疫增強劑，具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的生物活性[1-2]。生物體在新陳代謝過程中會不斷地產(chǎn)生自由基，包括單線態(tài)氧和過氧自由基等活性氧，這些活性氧能與體內(nèi)的生物大分子，諸如DNA、蛋白質(zhì)或者脂質(zhì)發(fā)生反應(yīng)從而削弱它們的功能，從而引發(fā)許多種疾病如癌癥、心腦血管疾病的發(fā)生[3]。

植物多糖具有強抗氧化活性，菌類中的香菇多糖、靈芝多糖、冬蟲夏草多糖等具有自由基清除能力，從而表現(xiàn)出抗氧化特性，因此此類天然的抗氧化劑可以有效地保護人體免受自由基傷害，防止一些慢性疾病的發(fā)生[4]。尋找有抗氧化活性和抗腫瘤活性的天然化合物具有重要的科學(xué)意義。

滑子菇又叫作珍珠菇、滑菇，是一種重要的真菌，屬于珍稀品種，在植物學(xué)分類上屬真菌門、擔(dān)子菌亞門、散菌目、蓋球菇科、磷傘屬，是集食用和藥用一體的菌類植物[5]?；庸蕉嗵鞘腔庸降闹饕煞种?，筆者主要運用熱水提醇沉法從滑子菇中提取多糖，從體外抗氧化活性和體外抑制腫瘤細胞生長作用兩方面對滑子菇多糖的體外生物活性進行研究，以期為功能食品的開發(fā)和利用提供實驗依據(jù)和理論參考，具有重要的生物學(xué)意義和潛在的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

滑子菇水提多糖(PNP)，由陜西師范大學(xué)生物物理與生物醫(yī)學(xué)工程研究室制備；K562細胞來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.1.2 試劑

無支原體新生牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；RPMI Medium 1640，美國Gibco公司；MTT，美國Amresco公司；DMSO、醫(yī)用酒精、1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)、硫代巴比妥酸(TBA)、牛血清蛋白(BSA)、RNase，碘化吡啶(PI)均為國產(chǎn)分析純試劑；實驗所用水均為三次蒸餾水。

1.2 儀器

Olympus TH4-200型倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；HH·CP-01W型CO2細胞培養(yǎng)箱，上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YP601N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL80-2B型臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；超凈工作臺、DG5032型酶聯(lián)免疫檢測儀，南京華東電子集團醫(yī)療儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；SZ-97型自動三重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；CF16RX型高速離心機，日本日立公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；血球計數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 滑子菇多糖的制備

滑子菇多糖采用熱水提醇沉的方法制備。

1.3.2 K562細胞的培養(yǎng)

人白血病細胞系K562培養(yǎng)在含有10%(體積分數(shù))小牛血清和100 IU雙抗(青、鏈霉素)的RPMI 1640溶液中，在5%CO2、飽和濕度、37 ℃環(huán)境下生長，取處于生長對數(shù)期的細胞進行試驗。

1.3.3 滑子菇多糖總還原能力的測定

采用鐵氰化鉀還原法測定滑子菇多糖的總還原能力[6]，1 mL不同質(zhì)量濃度的滑子菇多糖PNP溶液和抗壞血酸Vc溶液(25、50、100、200、400和800 μg/mL)中依次加入pH為6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1%的鐵氰化鉀2.5 mL搖勻，置于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min后取出快速冷卻，隨后加入10%三氯乙酸(TCA)溶液2.5 mL，4 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL的1%FeCl3溶液，混合均勻后靜置10 min，700 nm波長下測吸光度值(A700)，試樣還原能力與A700值成正比。

1.3.4 滑子菇多糖清除1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)能力的測定

參照陳奕等[7]的方法，稱取一定量的DPPH·用少量無水乙醇溶解，然后用50%乙醇配成30 μmol/L的溶液，取2 mL DPPH溶液，分別加入0.2 mL不同質(zhì)量濃度(25、50、100、200、400和800 μg/mL)的滑子菇水提粗多糖溶液和Vc溶液(Vc為陽性對照)中，搖勻，放入25 ℃恒溫水浴中反應(yīng)15 min后取出，測定525 nm波長下的吸光值OD，以 0.2 mL 50%乙醇代替試樣作為空白對照管，以2 mL 50%乙醇代替DPPH溶液作為試樣參比管，并以等體積蒸餾水和50%乙醇混合液空白調(diào)零，按照同樣的方法測定525 nm波長下的吸光值，試樣對DPPH·的清除作用按式(1)計算。

(1)

式中:Ai為試樣管的吸光值;Aj為試樣參比管的吸光值;Ac為空白對照管吸光值。

1.3.5 滑子菇多糖對Fe2+誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用

參照張爾賢等[8]的方法，取pH 7.45磷酸鹽緩沖液 (PBS)0.1 mol/L配制卵黃懸液[V(卵黃)∶V(PBS)=1∶25]，吸取卵黃懸液0.2 mL，分別加入0.1 mL不同質(zhì)量濃度(25、50、100、200、400和800 μg/mL)的滑子菇水提粗多糖溶液和抗壞血酸Vc溶液(Vc為陽性對照)中，再加入0.2 mL 25 mmol/L的FeSO2溶液，然后加入1.5 mL 0.1 mol/L pH 7.45的PBS，37 ℃恒溫振蕩15 min，取出后加入 0.5 mL 200 g/L的三氯乙酸(TCA)，3 500 r/min離心10 min，吸取2 mL上清液加入8 g/L TBA 1 mL，加塞，放入沸水浴中15 min，冷卻后，以空白管(3 mL PBS代替)調(diào)零，于532 nm處比色測定吸光度值，以0.1 mL蒸餾水代替試樣作為空白對照管，按同樣處理方法測定532 nm波長下的吸光值，試樣抗氧化活性(AOA)用對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的清除率按式(2)計算。

(2)

式中：A0為空白對照管吸光值；A為試樣管吸光值。

1.3.6 MTT法檢測滑子菇多糖對K562細胞的體外增殖活性

取處于對數(shù)生長期的狀態(tài)良好的K562細胞，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL接種到96孔板中，每孔100 μL細胞懸液，放入37 ℃、5% CO2和飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，調(diào)零孔和對照組，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基溶液，實驗組每孔加入PNP溶液(質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400和800 μg/mL)，每組做6個平行，繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL放入孵箱培養(yǎng)4 h，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，每孔加入180 μL的DMSO，輕微振蕩15 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在492 nm下測光吸收值OD。按照式(3)計算細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率=[(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值] ×100%

(3)

1.3.7 臺盼藍細胞計數(shù)檢測細胞存活率

質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400和800 μg/mL且處理過的K562細胞懸液與0.4%臺盼藍以體積比9∶1的比例混合，3 min內(nèi)利用血球計數(shù)板計數(shù)。

1.3.8 細胞周期檢測實驗

取處于對數(shù)生長期的狀態(tài)良好的K562細胞，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL接種到24孔板中，放入37 ℃，5% CO2和飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，對照組加入無血清培養(yǎng)基溶液，實驗組每孔加入PNP溶液(質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400和800 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；隨后將孔板內(nèi)的細胞懸液分別收集于EP管中，1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄去上清液，底層沉淀用預(yù)冷的PBS(含1%BSA)清洗2次，將細胞重懸于500 μL的PBS緩沖液中，混合均勻后逐滴加入預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃條件下固定過夜；將固定之后的細胞離心棄去上清液，PBS(含1%BSA)清洗2次，將細胞重懸于500 μL的PBS中，加入5 μL的RNase A(10 mg/mL)在37 ℃條件下避光反應(yīng)30 min后置冰浴終止反應(yīng)，加入25 μL PI(碘化吡啶)染色，4 ℃避光反應(yīng)30 min，上流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 滑子菇水提粗多糖總還原力的測定

滑子菇水提粗多糖PNP和陽性對照組Vc在700 nm波長下的吸光度值如圖1所示。

圖1 PNP的還原能力Fig.1 Reduction ability of PNP

由圖1可以看出：滑子菇水提粗多糖有一定的還原能力，且其還原能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而增強，但是其還原能力遠低于Vc，一般而言，物質(zhì)的還原能力越強其抗氧化能力也越強，由此說明滑子菇水提粗多糖具有較弱的還原能力。

2.2 滑子菇水提粗多糖對DPPH·的清除作用

DPPH·在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈深紫色，具有單一的電子，故能夠接受一個電子或是H+，在514 nm波長處有最大吸收峰，當存在自由基清除劑時，DPPH·的單電子被捕捉從而使其顏色變淺，因而在514 nm處的吸光值亦下降，從而可以用來評價化合物的抗氧化能力[9]。滑子菇水提粗多糖對DPPH·的清除作用結(jié)果見圖2。

圖2 滑子菇水提粗多糖對DPPH·的清除作用Fig.2 Scavenging effects of PNP on DPPH·

由圖2可以看出:滑子菇水提粗多糖對DPPH·具有一定的清除作用，且隨著多糖質(zhì)量濃度增加，清除作用也隨之增強，當多糖質(zhì)量濃度增加到800 μg/mL時，滑子菇水提粗多糖對DPPH·清除率與抗壞血酸對DPPH·的清除率相接近，達到41.28%。表明水提滑子菇多糖中存在一個捕獲DPPH·的單電子的基團，可以將其單電子捕捉，達到清除DPPH·的作用，從而使其顏色變淺，使在514 nm處的吸光值下降。

2.3 滑子菇水提粗多糖對Fe2+誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用

滑子菇水提粗多糖對Fe2+誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用見圖3。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)被認為是與肝臟亞細胞水平和組織水平損傷有關(guān)，雖然有證據(jù)表明脂質(zhì)過氧化不會造成細胞死亡，但是它仍然會對肝臟損傷產(chǎn)生協(xié)同放大作用[10]。且脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是細胞膜多不飽和脂肪酸發(fā)生的一系列自由基鏈式反應(yīng)，與衰老、自身免疫疾病、肝損傷等很多疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)具有組織特異性，嚴重威脅著大腦、心臟、肝臟等器官，如果存在抗氧化劑，便可通過清除過氧化產(chǎn)物來阻斷鏈式反應(yīng)的發(fā)生，從而阻止脂質(zhì)過氧化[11]。

圖3 滑子菇水提粗多糖的抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.3 Inhibitory effects of PNP on lipid peroxidation

由圖3可以看出:滑子菇水提粗多糖具有抑制由Fe2+誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的活性，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，抑制活性逐漸增強，但總體增強的幅度不是很大。在多糖質(zhì)量濃度為800 μg/mL時抑制率達到19.72%。實驗結(jié)果表明，水提滑子菇多糖中含有一定量的清除過氧化產(chǎn)物的基團，能夠在一定程度上抑制由Fe2+誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

2.4 滑子菇水提粗多糖對K562細胞的生長抑制活性

真菌多糖對腫瘤具有直接的細胞毒性，它們可以抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)分化和細胞凋亡，影響腫瘤細胞膜的生化特性，并且抑制腫瘤血管形成，同時還可增強機體免疫功能從而間接地抑制腫瘤生長[12]。

圖4為滑子菇水提粗多糖對人白血病K562細胞的體外增殖抑制作用結(jié)果。由圖4可知：作用時間為24 h時，抑制人白血病的K562細胞體外生長作用較弱，低質(zhì)量濃度(25～200 μg/mL)時抑制作用與對照組相比沒有顯著性差異，質(zhì)量濃度為400和800 μg/mL時抑制作用顯著，由于多糖與細胞的作用時間較短，多糖的抑制活性沒有完全表現(xiàn)出來，因此對K562細胞的生長起到了較弱的抑制作用；當作用時間延長至48 h時，PNP對K562細胞的抑制作用明顯增大，在100～800 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)抑制作用與陰性對照組相比有顯著性差異，在質(zhì)量濃度為800 μg/mL時抑制率達到最大為35.03%。趙俊霞等[13]的研究表明滑子菇多糖能誘導(dǎo)K562細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)，可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因Caspase-3在mRNA水平上的表達，從而達到抑制K562細胞增殖的作用；當作用時間為72 h時，PNP對K562細胞生長不再具有抑制作用，魏文青等[14]的研究表明腫瘤藥物對腫瘤細胞的生長具有一個最佳的作用時間，在最佳作用時間之前，抑制作用隨著作用時間的增加而增強，超過這個最佳作用時間后，抑制作用隨著時間的增長而減弱。

表1 滑子菇水提粗多糖MTT的試驗結(jié)果Table 1 MTT results of PNP

注：與陰性對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。

圖4 不同質(zhì)量濃度PNP作用K562細胞24、 48和72 h后的細胞抑制率Fig.4 Cell viability of K562 cells after treated with PNP on different concentrations for 24,48 and 72 h

2.5 胎盤藍細胞計數(shù)結(jié)果

K562細胞在含有不同濃度的滑子菇多糖的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)24、48和72 h后計數(shù)，由圖5可以看出，計數(shù)結(jié)果表明：在24和48 h時細胞生長受到抑制，并且隨著多糖濃度的增加細胞數(shù)量逐漸減少，到72 h時基本沒有影響，該結(jié)果與MTT實驗結(jié)果相一致(表1)。

圖5 滑子菇多糖PNP對人白血病K562 細胞生長曲線的影響Fig.5 Effects of PNP on K562 cell growth curves

2.6 細胞周期檢測實驗結(jié)果

細胞周期分為間期和分裂期(M期)2個階段，間期又分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)，根據(jù)有絲分裂細胞在各個時期DNA含量的不同，用DNA染料處理細胞后就可以將細胞周期區(qū)分開來。不同濃度的滑子菇多糖作用細胞48 h后對K562細胞周期的影響如圖6和表2所示。由圖6和表2可知：與對照組相比，實驗組的S期細胞明顯減少，G2期細胞隨著多糖質(zhì)量濃度的增加先增多隨后有減少，而G1期的細胞明顯增加，表明滑子菇多糖阻滯細胞的周期在G1期。

圖6 PNP作用K562細胞48 h后細胞周期的檢測結(jié)果Fig.6 Cell cycle test results of PNP on K562 after 48 h

ρ(PNP)/(μg·mL-1)不同周期的細胞占總細胞量/%G1期S期G2期對照41.7558.2502576.74023.265099.5100.4910010000200100004001000080010000

2.7 光學(xué)顯微鏡觀察

圖7(a～g)分別為25、50、100、200、400和800 μg/mL的滑子菇水提粗多糖處理人白血病K562細胞48 h后和空白對照組K562細胞的倒置熒光顯微鏡觀察圖。從圖7可以觀察到：隨著滑子菇水提粗多糖質(zhì)量濃度的增加，細胞密度和數(shù)量發(fā)生了顯著變化。正常生長狀態(tài)下的人白血病K562細胞成規(guī)則的圓球狀，分布均勻，細胞接觸緊密，生長速度快。圖7中滑子菇水提粗多糖作用48 h后，隨著質(zhì)量濃度的增加細胞密度逐漸下降，細胞形態(tài)發(fā)生了改變，部分細胞體積增大，有些細胞甚至發(fā)生溶解破裂。說明K562細胞加入滑子菇水提粗多糖后細胞生長受到抑制并且發(fā)生形態(tài)變化，分析可能的原因是滑子菇多糖可以誘導(dǎo)癌細胞凋亡并且具有細胞毒性，從而影響腫瘤細胞膜表面的生化特性，抑制了腫瘤細胞的增殖。

圖7 滑子菇水提粗多糖與K562細胞作用48 h后倒置顯微鏡觀察圖Fig.7 Inverted microscope images of PNP on K562

3 結(jié) 論

主要對滑子菇水提粗多糖的體外生物活性進行了研究，通過實驗可以得出滑子菇水提粗多糖具有很好的抗氧化能力；并且具有一定的還原能力；當多糖質(zhì)量濃度為800 μg/mL時，滑子菇水提粗多糖對DPPH·的清除作用接近于抗壞血酸，達到41.28%的抑制效果；滑子菇水提粗多糖還具有抑制脂質(zhì)過氧化的作用，當多糖的質(zhì)量濃度為800 μg/mL時達到最高抑制率19.72%；同時滑子菇水提粗多糖對K562細胞的體外增殖具有顯著的抑制作用，在多糖質(zhì)量濃度為800 μg/mL與作用時間為48 h時，抑制率最高可達到35.03%，同時滑子菇多糖能夠阻滯人白血病K562細胞周期于G1期。綜合表明滑子菇水提粗多糖有較好的體外生物活性，為研究開發(fā)滑子菇多糖提供了一定的實驗依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 周曉薇)

In vitro biological activity of polysaccharide extractedfrom Pholiota nameko

LI Jiamei1，2,SUN Runguang1,GUO Guoyun1,ZHANG Zhi1

(1. College of Physics and Information Technology,Shaanxi Normal University,Xi′an 710062,China;2. Shaanxi Fashion Engineering University,Xianyang 712046,China)

Fungus polysaccharide had an important value of biological activity,Pholiotanamekowas plant fungus of edible medicinal value.Water-extracted crude polysaccharides ofPholiotanameko,were investigated. Their antioxidant activity was studied by DPPH method,the lipid peroxidation by Fe2+method,the antitumor activity by MTT assay,and placenta blue cell count detection.The flow cytometer was used to study effects of PNP on K562 cell cycle.Experimental results showed that PNP had inhibitory ability and DPPH free radical scavenging capability similar to that of Vc on high concentration.PNP had actions on lipid peroxidation with the increasing of the concentration,the inhibitory effect increased.MTT assay showed that PNP inhibited the growth of K562 cells in vitro,exhibited dose-dependent and time-based effect,the highest inhibition rate is 35.03% when treated with PNP in 800 μg/mL for 48 h.In addition,the result of cell cycle analysis by flow cytometer showed that PNP could block the K562 cell in G1 phase.

antioxidant;antitumor;Pholiotanameko;polysaccharide

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.009

2012-10-17

國家自然科學(xué)基金(10874108)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃(SJ08A16)；2010國家級大學(xué)生創(chuàng)新實驗計劃(101071812)

李佳媚(1988—),女，陜西寶雞人,碩士研究生,研究方向：天然產(chǎn)物有效成分的化學(xué)研究；孫潤廣(聯(lián)系人)，教授，E-mail:sunrunguang@snnu.edu.cn

Q53；R73

A

1672-3678(2014)02-0044-07