殼聚糖絮凝法精制合歡皮多糖水提液的工藝

韓 樂，孫曉海，韓 偉

(華東理工大學中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237)

殼聚糖絮凝法精制合歡皮多糖水提液的工藝

韓 樂，孫曉海，韓 偉

(華東理工大學中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237)

采用殼聚糖對合歡皮總多糖的絮凝純化工藝進行研究。通過單因素和正交試驗，得到優(yōu)化的工藝條件：殼聚糖用量為生藥量0.8 mL/g，絮凝溫度35 ℃，絮凝時間4 h，藥液濃縮比(質(zhì)量體積比)為1∶10(g/mL)，在此條件下，多糖保留率、脫蛋白率和多糖純度分別為91.23%、22.26%和47.27%，優(yōu)于傳統(tǒng)的水提醇沉法。

合歡皮；殼聚糖；絮凝；多糖

合歡皮是一味傳統(tǒng)中藥，具有解郁安神、活血消腫等功效[1]，近期研究發(fā)現(xiàn)：合歡皮還具有抗炎[2]、抗生育[3]、抗腫瘤[4-5]、抗氧化[6]、鎮(zhèn)靜催眠[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]等藥理活性，其活性成分之一的合歡皮多糖與抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性相關(guān)[9-10]。

殼聚糖是一種天然的鏈狀高分子絮凝劑，由葡萄糖胺通過β-1,4-糖苷鍵連接而成[11]。由于分子中含有氨基，使殼聚糖在酸性條件下帶有正電荷，因此具有中和電荷與吸附架橋的雙重絮凝作用[12]。殼聚糖作為絮凝劑具有安全、無毒、穩(wěn)定的優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于污水處理等工業(yè)。近年來，絮凝劑被逐步應(yīng)用于中藥有效成分的分離純化過程，而中藥絮凝純化技術(shù)是利用絮凝劑使藥液中的蛋白質(zhì)、膠體、鞣質(zhì)等微粒絮凝沉降，再通過過濾實現(xiàn)分離純化的方法。

筆者以多糖保留率和脫蛋白率為指標，考察殼聚糖對合歡皮總多糖提取液的絮凝純化工藝，并通過數(shù)據(jù)分析優(yōu)化工藝參數(shù)，以期獲得殼聚糖絮凝純化合歡皮總多糖的最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

UV1900PC型紫外分光光度計，上海市亞研電子公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵、DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；AL104型電子天平，上海市Mettle Toledo儀器有限公司；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海市予華儀器有限公司；RJ-TGL-16C型臺式高速離心機，無錫市瑞江分機儀器有限公司；PHS-3C型酸度計，上海理達儀器廠。

葡萄糖為標準品(質(zhì)量純度>95%)，上海市天蓮精細化工有限公司；牛血清白蛋白和考馬斯亮藍G-250均為分析純，上海市源聚生物科技有限公司；殼聚糖，上海市偉康生物制品有限公司；合歡皮藥材，購自上海市藥材公司雷允上藥店；無水乙醇、苯酚、H2SO4、HCl、NaOH均為市售分析純。

1.2 試樣及試劑的制備

1.2.1 試樣溶液的制備

1)藥材的預(yù)處理 稱取合歡皮藥材適量，加入10倍量的95%工業(yè)乙醇，回流提取2 h，冷卻，上清液回收乙醇，殘渣揮干溶劑，干燥至恒質(zhì)量，用于提取多糖。

2)試樣溶液的制備 精確稱取預(yù)處理后的合歡皮試樣50 g，加入適量去離子水，加熱回流2 h，冷卻至常溫，過濾、濾渣再提取一次，合并兩次提取液，減壓濃縮，定容備用。

1.2.2 試劑的配制

1)考馬斯亮藍試劑的制備 取100 mg考馬斯亮藍G-250，用95%乙醇50 mL溶解，加入85% H3PO4100 mL，然后用去離子水定容至1 000 mL，過濾，備用。

2)殼聚糖溶液的配制 稱取1.0 g殼聚糖，加入適量1%醋酸溶液，攪拌溶解，配制成1%的殼聚糖溶液，靜置24 h，充分溶脹后備用。

1.3 分析方法的建立及計算

1.3.1 合歡皮總多糖含量的測定

精密稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標準品50.0 mg，加去離子水溶解，并定容至500 mL，搖勻，即得0.1 mg/mL葡萄糖溶液。

分別精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL的標準品溶液，采用苯酚-H2SO4法[13]，于485 nm處測定吸光度，以質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：A=14.23 80ρ-0.000 86，發(fā)現(xiàn)在0.010 5～ 0.073 5 mg/mL范圍內(nèi)R2=0.999 5。

準確移取2 mL試樣溶液，按相同的顯色操作，測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算試樣溶液中總多糖的濃度，通過式(1)計算合歡皮總多糖的含量。

(1)

式中:m1為總多糖的含量，mg；ρ1為試樣中總多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為試樣中溶劑體積，mL。

(2)

式中：m1為絮凝前總多糖含量，mg；m2為絮凝后總多糖含量，mg。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定

稱取0.02 g結(jié)晶牛血清白蛋白，用去離子水溶解稀釋，并定容至100 mL，即得0.20 mg/mL蛋白質(zhì)標準溶液。

分別量取標準蛋白質(zhì)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，采用考馬斯亮藍G-250染色法[14]，于595 nm處測定吸光度，繪制蛋白質(zhì)標準曲線，得回歸方程：A=4.533 7ρ1-0.033 2，R2=0.999 1，且在0.02～0.20 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取試樣溶液1.0 mL，按相同的顯色操作，測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算試樣中的蛋白質(zhì)濃度，通過式(3)求得蛋白質(zhì)含量。

(3)

式中:m2為蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；ρ2為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL；V2為蛋白質(zhì)溶液體積，mL。

(4)

式中:m3為絮凝前蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m4為絮凝后蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg。

1.3.3 合歡皮多糖純度的計算方法

對合歡皮總多糖提取液進行絮凝純化，取上清液，減壓濃縮至浸膏狀，真空干燥，稱質(zhì)量，根據(jù)式(5)計算總多糖的純度：

(5)

式中：ρ總多糖為藥液中總多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V3為藥液體積，mL；m5為藥液濃縮后的干膏質(zhì)量，mg。

1.4 實驗方法

1.4.1 殼聚糖絮凝實驗

移取一定濃縮比的藥液50 mL，在電磁攪拌狀態(tài)下，緩慢加入1%的殼聚糖醋酸溶液，攪拌5 min，水浴保溫一定時間后取出，離心分離，取上清液測定多糖和蛋白質(zhì)的含量。

1.4.2 水提醇沉實驗

向濃縮后的合歡皮總多糖提取液中加入適量無水乙醇，使乙醇體積分數(shù)達到80%左右，置于冰箱中醇沉24 h，離心取沉淀，用無水乙醇、丙酮洗滌數(shù)次，真空干燥，得粗多糖；稱質(zhì)量后，用去離子水溶解，定容，測定多糖濃度，計算總多糖的純度。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖加入量的影響

以藥液濃縮比1∶10(g/mL)的合歡皮多糖提取液為原料，于50 ℃、不調(diào)pH的實驗條件下，分別加入不同量的1%(質(zhì)量分數(shù))殼聚糖醋酸溶液，絮凝保溫2 h后，測定藥液的多糖和蛋白質(zhì)含量變化，實驗結(jié)果見圖1。

圖1 殼聚糖的加入量對絮凝純化多糖效果的影響Fig.1 Effects of chitosan dosages on flocculating purification of polysaccharides

由圖1可知:隨著殼聚糖加入量的增多，多糖保留率不斷減小，而脫蛋白率先逐漸增加，最后達到穩(wěn)定狀態(tài)。這是因為當殼聚糖加入量較少時，殼聚糖分子與膠體顆粒和雜質(zhì)等的碰撞幾率較小，吸附架橋和電中和作用不足，導致絮凝作用不充分；隨著殼聚糖加入量的增加，分子間碰撞的幾率增大，絮凝作用加強，脫蛋白率增大，多糖保留率降低；當殼聚糖加入量達到一定程度后，殼聚糖對蛋白質(zhì)等的絮凝作用逐步達到飽和，脫蛋白率變化趨緩。綜合考慮，選擇殼聚糖加入量以生藥量0.8 mL/g為宜。

2.2 絮凝時間的影響

以藥液濃縮比為1∶10的合歡皮多糖提取液為原料，殼聚糖加入量為0.8 mL/g生藥量，在50 ℃、不調(diào)pH的實驗條件下，分別絮凝保溫1、2、3、4、5和6 h后，測定藥液的多糖和蛋白質(zhì)含量變化，實驗結(jié)果見圖2。

圖2 絮凝時間對絮凝純化多糖效果的影響Fig.2 Effects of time on flocculating purification of polysaccharides

由圖2可知:隨著絮凝時間的增加，多糖保留率逐漸降低；而脫蛋白率先迅速增大，后緩慢增加。這可能是因為當絮凝時間較短時，殼聚糖高分子鏈分散不均勻，與懸浮顆粒、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不能充分接觸，導致絮凝效果較差；隨著時間的延長，高分子鏈均勻分散，絮凝效果增強，脫蛋白率迅速增加，同時多糖也有所損失；當絮凝時間大于4 h后，殼聚糖對蛋白質(zhì)等的絮凝作用逐漸達到平衡，但多糖易被絮團包裹而使損失增加。綜上所述，絮凝時間選擇4 h左右。

2.3 絮凝溫度的影響

以藥液濃縮比為1∶10的合歡皮多糖提取液為原料，殼聚糖加入量為0.8 mL/g生藥量，不調(diào)pH，分別在不同的絮凝溫度下，絮凝保溫4 h后，測定藥液的多糖和蛋白質(zhì)含量的變化，實驗結(jié)果見圖3。

圖3 絮凝溫度對絮凝純化多糖效果的影響Fig.3 Effects of temperature on flocculating purification of polysaccharides

由圖3可知，該變化趨勢與不同溫度下分子的熱運動有關(guān)。當溫度過低時，分子熱運動較慢，分子間的碰撞幾率較小，絮凝作用不充分；隨著溫度的升高，體系內(nèi)各分子熱運動加劇，絮凝劑分子與溶液中微粒的碰撞幾率增加，電中荷、吸附架橋作用較充分，脫蛋白率和多糖保留率逐漸增加；當溫度超過50 ℃時，殼聚糖高分子鏈收縮，縮短了架橋長度，絮凝作用減弱，脫蛋白率降低。綜合考慮，選擇絮凝溫度以50 ℃左右為宜。

2.4 藥液濃縮比的影響

分別以不同藥液濃縮比的合歡皮多糖提取液為原料，殼聚糖加入量為生藥量0.8 mL/g，在50 ℃、不調(diào)pH的實驗條件下，絮凝保溫4 h后，測定藥液的多糖和蛋白質(zhì)含量，實驗結(jié)果見圖4。

由圖4可知:多糖保留率和脫蛋白率隨藥液濃度的變化呈拋物線的變化趨勢。因為藥液濃度過高時，溶液黏度較大，不利于殼聚糖高分子鏈的分散，絮凝效果較差，脫蛋白率很低；同時，多糖易被沉淀、絮團等吸附和包裹，損失較大；藥液濃度過低時，分子間距大，高分子鏈間的吸附架橋作用不充分，且吸附選擇性較差，脫蛋白率和多糖保留率均降低。因此，選擇藥液濃縮比以1∶10左右為宜。

2.5 pH的影響

以藥液濃縮比為1∶10的合歡皮多糖提取液為原料，殼聚糖加入量為0.8 mL/g生藥量，在50 ℃、不同pH的實驗條件下，絮凝保溫4 h后，測定藥液的多糖和蛋白質(zhì)含量，實驗結(jié)果見圖5。

圖5 pH對絮凝純化多糖效果的影響Fig.5 Effects of pH on flocculating purification of polysaccharides

由圖5可知:多糖保留率和脫蛋白率兩項指標均隨pH的增大呈先增大后減小的趨勢，在pH 3～5的范圍內(nèi)，多糖保留率和脫蛋白率較高，這主要是由于氨基的存在，使得殼聚糖在弱酸性條件下帶正電荷，可與溶液中帶負電荷的膠體顆粒、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)等發(fā)生電中和作用，因此隨著酸性的增強，殼聚糖所帶的正電荷增多，絮凝能力增強，即脫蛋白率和多糖保留率隨pH的減小而增大；但酸性的增強同時會破壞膠體、蛋白質(zhì)等表面的負電荷結(jié)構(gòu)，使其與殼聚糖的結(jié)合能力減弱，所以當酸性過強(pH<3)時，脫蛋白率和多糖保留率明顯下降。因此，體系pH在3～5范圍內(nèi)較適宜，為節(jié)約成本，選擇原藥液(pH=5)進行操作。

2.6 殼聚糖絮凝純化的正交試驗

2.6.1 正交試驗因素的選擇

根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，選取殼聚糖用量、絮凝時間、絮凝溫度3個因素，采用L9(34)正交試驗設(shè)計(表1)，優(yōu)化工藝條件。

表1 殼聚糖絮凝純化L9(34)因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

2.6.2 正交試驗結(jié)果的分析

以多糖保留率與脫蛋白率為指標，根據(jù)L9(34)正交表設(shè)計實驗，結(jié)果與極差分析見表2，多糖保留率、脫蛋白率方差分析分別見表3和表4。

表2 殼聚糖絮凝純化實驗結(jié)果與分析表Table 2 Results and analysis of polysaccharides flocculating purification by chitosan

表3 多糖保留率方差分析表Table 3 Variance analysis of polysaccharide retention rate

由表2可知：以多糖保留率為評價指標，發(fā)現(xiàn)三因素對純化工藝的影響作用依次為C、A、B，最佳工藝條件為A2B2C2；由表3可知，各因素對多糖保留率均無顯著性影響。

表4 脫蛋白率方差分析表Table 4 Variance analysis of protein removal rate

以表2中的脫蛋白率為評價指標，三因素對純化工藝的影響作用依次為A、B、C，最佳工藝條件為A2B1C2；由表4可知：PA<0.05，PB<0.05，即殼聚糖用量、絮凝溫度對脫蛋白率的影響顯著。

綜合考慮，本實驗優(yōu)化的工藝條件為A2B1C2(殼聚糖用量0.8 mL/g，絮凝溫度35 ℃，絮凝時間4 h)，與正交設(shè)計中的第4組實驗條件相符，此時，脫蛋白率為22.26%，多糖保留率為91.23%。

2.7 純化工藝的比較

不同純化工藝的各項指標比較結(jié)果如表5所示。由表5可知：殼聚糖絮凝純化法的脫蛋白率雖低于水提醇沉的效果，但其多糖保留率和純度均明顯高于醇沉效果，分別為其2.55和1.99倍。

表5 純化工藝的比較Table 5 Comparison of different purification processes

3 結(jié) 論

通過單因素和正交試驗研究，確定了殼聚糖絮凝純化合歡皮多糖的優(yōu)化工藝條件：殼聚糖用量0.8 mL/g，絮凝溫度35 ℃，藥液濃縮比(質(zhì)量體積比)1∶10(g/mL)，不調(diào)藥液pH，絮凝時間4 h，發(fā)現(xiàn)此時多糖保留率為91.23%、脫蛋白率為22.26%。

通過與傳統(tǒng)醇沉法各項指標的比較可以發(fā)現(xiàn)，雖然水提醇沉工藝脫蛋白效果較好，但多糖損失嚴重，而殼聚糖絮凝法對有效成分的保留率和純度均較高，純化效果較好，且殼聚糖絮凝工藝實驗周期短，操作簡便，可以作為現(xiàn)代中藥制藥工藝改革的發(fā)展方向。

[1] 鄭虎占.中藥臨床應(yīng)用備要之二十四[J].中國臨床醫(yī)生，2012，40(12):67-69.

[2] 喬善義，蔚冬紅，郭繼芬，等.組合LC-MS-MS鑒定技術(shù)的生物活性導向研究合歡皮抗炎活性部位[J].中國中藥雜志，2007，32(19):2021-2025.

[3] 馬錦媚，孫秀義，毛福祥，等.合歡總甙抗早孕作用的機理研究[J].中國藥學雜志，1995，30(2):111.

[4] 吳鵬西，周峰盛，朱巧英，等.“合歡皮298”對小鼠肝癌血管生成作用的實驗研究[J].徐州醫(yī)學院學報，2012，32(1):36-40.

[5] 劉玲艷，杜芳芳，馮磊，等.合歡皮不同提取組分對HMEC細胞和3B11細胞的作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22(3):762-764.

[6] Jung M J，Chung H Y，Kang S S，et al.Antioxidant Activity from the Stem Bark ofAlbizziajulibrissin[J].Archives of Pharmacal Research，2003，26(6):458-462.

[7] 李浩.合歡皮與山合歡皮鎮(zhèn)靜催眠作用的比較研究[J].時珍國醫(yī)國藥， 2005，16(6):488.

[8] 李富強.合歡皮皂苷的免疫學活性研究[D].杭州:浙江大學，2010.

[9] 韓莉，崔景榮.合歡皮多糖對S180荷瘤小鼠的抑瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J].實用醫(yī)學進修雜志，2000，28(3):144-146.

[10] 田維毅,武孔云,白惠卿.合歡皮紅細胞免疫活性成分及其機制的研究[J].四川中醫(yī)，2003，21(10):17-19.

[11] 成慶利.殼聚糖的結(jié)構(gòu)及抗菌作用研究進展[J].生物技術(shù)，2006，16(4):88-91.

[12] Renault F，Sancey B，Badot P M，et al.Chitosan for coagulation/flocculation processes：an eco-friendly approach[J].European Polymer Journal，2009，45:1337-1348.

[13] 黎晶晶，徐格非.苯酚-硫酸法測定靈芝多糖含量的研究[J].杭州化工，2008，38(1):23-26.

[14] 南亞，李宏高.考馬斯亮藍G-250法快速測定牛乳中的蛋白質(zhì)[J].飲料工業(yè)，2007，10(12):41-42.

(責任編輯 周曉薇)

Flocculating purification process of total polysaccharides from bark of Albizzia julibrissin by using chitosan

HAN Le,SUN Xiaohai,HAN Wei

(Engineering Center for Tradition Chinese Medicine Modernization，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China )

Through single factor and orthogonal experimental designs,the optimun conditions were obtained as follows:the dosage of chitosan was 0.8 mL/g,temperature 35 ℃,flocculation time 4 h,determined as 1∶10 of drug density.Under the optimum conditions,polysaccharide retention rate,protein removal rate,and the purity of polysaccharide were obtained as follows:91.23%,22.26% and 47.27%,respectively.The flocculating purification of total polysaccharides was superior to the traditional method of extracting with water and depositing with alcohol.

Albizziajulibrissin;chitosan;flocculating;polysaccharide

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.008

2013-07-02

國家大學生創(chuàng)新計劃(111025124)

韓 樂(1989—)，女，山東威海人，碩士研究生，研究方向：中藥制藥工程；韓 偉(聯(lián)系人)，教授，E-mail：whan@ecust.edu.cn

R284.2

A

1672-3678(2014)02-0038-06