效應(yīng)面法優(yōu)化石榴皮抑菌物的提取工藝

遲 雪，張丹丹

(青島科技大學化工學院，青島266042)

效應(yīng)面法優(yōu)化石榴皮抑菌物的提取工藝

遲 雪，張丹丹

(青島科技大學化工學院，青島266042)

采用單因素和效應(yīng)面法對石榴皮抑菌物提取條件進行優(yōu)化，并對結(jié)果進行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：最佳提取溫度為59 ℃、時間為73 min、液料比為40∶1(mL/g)。實驗證明石榴皮提取物對枯草桿菌具有很強的抑制作用，且所用工藝簡單易行，說明效應(yīng)面優(yōu)化法建立的數(shù)學模型預(yù)測結(jié)果可靠。

抑菌；提取；石榴皮；效應(yīng)面優(yōu)化法

石榴皮(PericarpiumGranati)是石榴科石榴屬植物石榴(PunicagranatumL.)的干燥果皮。具有鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病、抑菌[1-3]等功效。

目前多用正交法考察各實驗條件對石榴皮抑菌能力的影響，采用效應(yīng)面法的報道則較罕見。效應(yīng)面法比正交法簡化，試驗精度高，可對未做過的試驗進行預(yù)測[4-5]。因此，本實驗采用效應(yīng)面法對石榴皮中抑菌物質(zhì)的提取條件進行優(yōu)化，以期建立的數(shù)學模型可以準確預(yù)測不同實驗條件下的抑菌能力，并確定最大抑菌能力下的提取條件。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

石榴皮(由新鮮石榴皮曬干后粉碎)，購于青島京城百草廳大藥房；牛肉膏，北京鴻潤寶順科技有限公司；蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司；瓊脂，青島正業(yè)試劑儀器有限公司；乙醇，煙臺三和化學試劑有限公司；NaOH，天津博迪化工股份有限公司；NaCl，天津市瑞金特化學品有限公司；枯草芽胞桿菌，青島科技大學生物實驗室提供。

FA1004型電子天平，上海精密科學儀器分公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；四兩裝高速中藥粉碎機，山東青州精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RXZ智能型人工氣候箱，寧波市科技園新江南儀器有限公司；立式壓力滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司；Sw-Cj-1F型單人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 抑菌直徑的測定

將粉碎的石榴皮在不同條件下用乙醇超聲提取，水浴干燥。用6 mm打孔器將培養(yǎng)皿中含有細菌的培養(yǎng)基打孔，將石榴皮提取物稀釋至相同體積，用移液槍吸取80 μL加至各孔中。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測抑菌直徑，發(fā)現(xiàn)與汝紹剛等[6]的研究結(jié)果一致，抑菌直徑越大，抑菌能力越強。

1.3 石榴皮粗提物的提取

1.3.1 單因素實驗

稱取石榴皮2.0 g，用超聲波提取法，考察不同液料比、溫度、提取時間對抑菌能力的影響。

1.3.2 星點實驗

在單因素基礎(chǔ)上，進行三因素五水平實驗，并通過Statistica 6.0軟件進行優(yōu)化，確定最佳提取條件。

1.3.3 驗證實驗

根據(jù)模型確定最佳提取條件，在該相同條件下分別進行3次提取及抑菌實驗，測定抑菌直徑以驗證抑菌能力的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 液料比對抑菌結(jié)果的影響

稱取石榴皮2.0 g，采用體積分數(shù)60%乙醇，提取時間和溫度各組相同，進行平行的4組實驗。液料比(mL/g)分別設(shè)為20∶1、30∶1、40∶1和50∶1，抑菌結(jié)果如圖1所示。

圖1 液料比對抑菌直徑的影響Fig.1 Effects of raw liquid to solid on different inhibition diameters

從圖1可以看出:液料比為40∶1(mL/g)時，石榴皮粗提物的抑菌能力最大?？赡苁怯捎谝毫媳刃∮?0∶1(mL/g)時石榴皮中有效成分沒有被完全提取出來，所以抑菌能力會隨著液料比的增加而增強；當超過40∶1(mL/g)時提取出來的有效成分趨于穩(wěn)定，但因為溶液體積的增加導致過濾及旋干的時間增加而使一些不穩(wěn)定的成分有少量降解繼而導致抑菌能力降低。

2.1.2 溫度對抑菌結(jié)果的影響

稱取石榴皮2.0 g，液料比為40∶1(mL/g)，乙醇濃度60%，提取時間同上，在溫度分別為50、60、70和80 ℃時進行提取，抑菌結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溫度對抑菌直徑的影響Fig.2 Effects of different extraction temperatures on inhibition diameters

從圖2可以看出:溫度為60 ℃時，石榴皮粗提物抑菌能力最大。這可能是由于溫度越高，溶劑分子運動速度越快，促進了有效成分的溶解，然而溫度過高會破壞藥物中的有效成分而導致抑菌能力下降。

2.1.3 提取時間對抑菌結(jié)果的影響

稱取石榴皮2.0 g，液料比為40∶1(mL/g)，乙醇濃度60%，提取溫度為60 ℃，分別提取45、60、75和90 min，抑菌結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時間對抑菌直徑的影響Fig.3 Effects of extraction time on different inhibition diameters

從圖3可以看出:提取時間為75 min時，石榴皮粗提物抑菌能力最大。抑菌能力隨時間的增加呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，這可能是由于超聲時間越長，細胞破壞越完全，有效成分溶出越多，但超過一定時間后有效成分被破壞的量超過溶出的量，從而導致了抑菌能力下降。

2.2 以效應(yīng)面法實驗設(shè)計優(yōu)化因素和條件

2.2.1 效應(yīng)面法的實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對液料比(X1)、溫度(X2)，時間(X3)進行三因素五水平的星點實驗，用Statistica6.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，星點設(shè)計因素水平見表1[7]。

表1 星點設(shè)計的因素和水平表Table 1 Variables and codes of central composite design

2.2.2 效應(yīng)面法實驗設(shè)計的優(yōu)化結(jié)果與分析

效應(yīng)面法實驗的結(jié)果見表2。分別用二項式擬合和線性擬合對表2的實驗數(shù)據(jù)進行處理。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)二項式擬合所得的r值相對于線性擬合有了較大幅度的提高，因此，選擇二項式擬合模型處理數(shù)據(jù)。

表2 星點設(shè)計實驗結(jié)果Table 2 Results of experiment designed by central composite design test

表3 二次多項式非線性估計的結(jié)果Table 3 Results of binomial model fitting

2.3 響應(yīng)面的優(yōu)化和預(yù)測

利用Statistica6.0軟件分別繪制各因素的三維效應(yīng)面(圖4、圖5和圖6)。

圖4 X1和X2與抑菌直徑的二維等高線圖Fig.4 X1, X2 and inhibition diameters of contour plot

圖5 X1和X3與抑菌直徑的二維等高線圖Fig.5 X1, X3 and inhibition diameters of contour plot

圖6 X2和X3與抑菌直徑的二維等高線圖Fig.6 X2, X3 and inhibition diameters of contour plot

二維等高線圖中心的最小圈是最佳提取范圍，綜合3個等高線圖，可以看出提取條件的最佳范圍：X1液料比(mL/g)為(37∶1～41∶1)；X2溫度為(57.2～60.8) ℃；X3時間為(71.2～75.1) min。

2.4 優(yōu)選工藝的驗證

根據(jù)效應(yīng)面法的最佳提取工藝，在液料比為40∶1(mL/g)、溫度59 ℃、時間73 min條件下提取，抑菌結(jié)果見表4。

表4 驗證實驗表Table 4 Verification form of experimental results

由表4可知：抑菌直徑的實際平均值為2.80 cm，和預(yù)測值2.83 cm基本吻合，說明效應(yīng)面法的提取工藝是比較可靠穩(wěn)定的，對未做的實驗條件具有較好的預(yù)測性。本實驗最佳工藝條件下的抑菌直徑為2.80 cm，明顯高于孔陽等[1]的最大抑菌直徑2.10 cm，說明效應(yīng)面法具有一定的優(yōu)勢。

3 結(jié) 論

通過單因素和效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化了石榴皮抑菌成分的提取條件，主要考察了液料比、溫度、時間對抑菌能力的影響。得出最佳提取條件為液料比40∶1(mL/g)、溫度59 ℃、時間73 min。發(fā)現(xiàn)最佳條件下驗證實驗的抑菌直徑與預(yù)測值基本吻合，說明本方法具有較好的預(yù)測性。

[1] 孔陽，馬養(yǎng)民，李彥軍，等.石榴皮粗提物抗菌活性的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010,38(5):8995-8897.

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[4] 吳偉，崔光華.星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法及其在藥學中的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學藥學分冊，2000，27(5):292-298.

[5] 邱影，朱玲，孫曉英.星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法與正交設(shè)計和均勻設(shè)計及其在藥劑研究中的應(yīng)用[J].海峽藥學，2011，23(2):18-20.

[6] 汝紹剛，崔波，遲玉霞，等.提取方法和溶劑對石榴皮中抑菌成分提取的影響[J].化學與生物工程，2011，28(12):43-45.

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(責任編輯 周曉薇)

Extraction of antimicrobials from pomegranate peel optimized byresponse surface methodology

CHI Xue,ZHANG Dandan

(College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

The extraction condition of pomegranate bacteriostatic materials was optimized by single factor test and response surface methodology.The optimum conditions were found as follows:the liquid to solid ratio 40∶1,extraction time 73 min,temperature 59 ℃.The result showed that the pomegranate extracts had strong antimicrobial effects onBacillussubtilis.The extraction method was simple,and the model established by response surface methodology could provide predictive accuracy.

antimicrobial;extraction;pomegranate peel;response surface methodology

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.007

2013-05-14

山東省自然科學基金(ZR2012HL48)

遲 雪(1988—)，女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，研究方向：中藥活性成分的提取與活性研究及新藥開發(fā)；張丹丹(聯(lián)系人)，副教授，E-mail:312685423@qq.com

R284.2

A

1672-3678(2014)02-0033-05