代謝木糖重組谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建

張恒麗，蔡 恒， 汪 晨，張 凱，周志惠

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京211800)

代謝木糖重組谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建

張恒麗，蔡 恒， 汪 晨，張 凱，周志惠

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京211800)

為了使谷氨酸棒桿菌較好地利用木糖生產(chǎn)有機(jī)酸，將來自EscherichiacoliK-12的木糖異構(gòu)酶基因xylA構(gòu)建到表達(dá)載體pXMJ19中，導(dǎo)入CorynebacteriumglutamicumATCC13032 Δldh中，成功表達(dá)了該酶基因。結(jié)果表明：重組菌株在以木糖為唯一C源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，木糖的消耗速率為0.54 g/(L·h)，木糖異構(gòu)酶比酶活約為0.54 U/mL；在以木糖和葡萄糖的混合糖為C源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，菌株優(yōu)先利用葡萄糖，在葡萄糖完全消耗后，菌株開始有效利用木糖；以木糖為唯一C源進(jìn)行兩階段發(fā)酵時(shí)，琥珀酸的收率可達(dá)(0.62±0.003)g/g。

谷氨酸棒桿菌；琥珀酸；木糖異構(gòu)酶基因；木糖

隨著全球經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，以石油為主體的化石能源危機(jī)正日益嚴(yán)峻，可持續(xù)替代資源的開發(fā)和利用已成為當(dāng)務(wù)之急。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源之一，廣泛存在于工農(nóng)業(yè)廢棄物中，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，利用酸解或酶解的方法可將其轉(zhuǎn)化為還原性糖，產(chǎn)生大量的五碳糖(D-木糖和L-阿拉伯糖)和六碳糖(葡萄糖、半乳糖和甘露糖)，其中六碳糖約占2/3，五碳糖約占1/3。在半纖維素的水解產(chǎn)物中，D-木糖約占90%[1-3]。

谷氨酸棒桿菌廣泛分布在自然界中，是工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)良菌株，對(duì)木質(zhì)纖維素中的抑制物，如4-羥基苯甲酸、香草醛、丁香醛等具有較好的耐受性，在利用木質(zhì)纖維素降解成分方面具有極大的優(yōu)勢(shì)[4-5]。谷氨酸棒桿菌在進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)時(shí)通常以葡萄糖、蔗糖等作為底物，由于缺乏轉(zhuǎn)化木糖的酶系而不能有效地利用木糖，但能發(fā)酵其異構(gòu)體木酮糖[6]，而木糖的利用是微生物利用木質(zhì)纖維素類降解組分生物轉(zhuǎn)化為乙醇、琥珀酸等大宗化學(xué)品的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此構(gòu)建可以利用木糖的谷氨酸棒桿菌重組菌株極為重要。當(dāng)前，日本的RITE研究所對(duì)CorynebacteriumglutamicumR木糖的利用進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將大腸桿菌的木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶基因整合至C.glutamicumR基因組上，可以實(shí)現(xiàn)其代謝木糖的能力，在以40 g/L葡萄糖、20 g/LD-木糖和10 g/LD-纖維二糖作為C源時(shí)，重組菌株在12 h可以將其完全消耗，且無碳代謝阻遏效應(yīng)的存在[7]。

筆者以C.glutamicumATCC13032 Δldh為出發(fā)菌株，通過克隆E.coliK-12木糖異構(gòu)酶基因xylA，將其連接于誘導(dǎo)型表達(dá)載體pXMJ19上，電轉(zhuǎn)化C.glutamicumATCC13032 Δldh,實(shí)現(xiàn)木糖的利用，以期為后續(xù)的谷氨酸棒桿菌的進(jìn)一步構(gòu)建和改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

CorynebacteriumglutamicumATCC13032 Δldh、E.coliJM109均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏，質(zhì)粒pXMJ19由德國(guó)科隆大學(xué)A Burkovski教授惠贈(zèng)。

1.2 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PCR反應(yīng)試劑、Prime STAR DNA聚合酶及DNA Marker，均購(gòu)自大連Takara公司；氯霉素，購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨，Oxoid公司產(chǎn)品；其余為國(guó)產(chǎn)分析純;引物合成與測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.3.1 培養(yǎng)基

培養(yǎng)菌體培養(yǎng)基為L(zhǎng)B(g/L)：蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10、pH 7.0，固體培養(yǎng)基再加瓊脂20。

電轉(zhuǎn)化所用SOC培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物5，NaCl 0.5，KCl 0.19,MgCl2·6H2O 0.2,葡萄糖3.6。

發(fā)酵用BT培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO47,KH2PO40.5,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.006,MnSO4·H2O 0.004,生物素 0.000 2，維生素B10.000 2。

發(fā)酵用A培養(yǎng)基(g/L)：尿素 2，酵母粉 2，酪蛋白氨基酸 7，(NH4)2SO47,KH2PO40.5,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.006,MnSO4·H2O 0.004,生物素 0.000 2，維生素B10.000 2。

大腸桿菌培養(yǎng)用抗生素質(zhì)量濃度為50 μg/mL，谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)用抗生素質(zhì)量濃度為10 μg/mL 。

1.3.2 培養(yǎng)條件

1)種子培養(yǎng)條件 在平板中將一環(huán)菌接入至裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。

2)有氧培養(yǎng)條件 將種子液按5%的比例接種到裝有100 mL培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)。

3)厭氧培養(yǎng)條件 將有氧培養(yǎng)后的菌液室溫8 000 r/min離心10 min，棄上清，用無菌水洗滌2次后用少量厭氧培養(yǎng)基重懸菌泥，并接入裝有50 mL培養(yǎng)基的血清瓶中，通入CO2氣體1 min，確保血清瓶中為厭氧環(huán)境，30 ℃、150 r/min條件下厭氧發(fā)酵18 h。

1.4 目的基因的克隆

DNA酶切、連接、轉(zhuǎn)化和大腸桿菌感受態(tài)制備等基本基因操作技術(shù)參照文獻(xiàn)[8]及有關(guān)公司提供的操作手冊(cè)進(jìn)行，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備參照文獻(xiàn)[9]。基因組DNA提取采用天根生化科技有限公司的試劑盒，PCR反應(yīng)采用Biometra公司PCR儀，電轉(zhuǎn)化采用Bio-Rad公司高壓脈沖電擊轉(zhuǎn)化儀。

1.5 目的基因xylA的克隆

參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的E.coliK-12xylA基因序列，分別設(shè)計(jì)含有Hind III和XbaI酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基的上下游引物。F：5′-GATAAGCTTACCTGATTATGGAGTTCAAT-3′，下劃線部分為引入的Hind III酶切位點(diǎn)；R：5′-GATTCTAGACATATCGATCGTTCCTTAAA-3′，下劃線部分為引入的XbaI酶切位點(diǎn)。

以E.coliK-12基因組DNA為模板，采用Prime STAR DNA 聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，50 μL體積反應(yīng)體系為：上下游引物(100 pmol/μL)各2 μL；模板DNA 0.5 μL；5×Prime buffer 10 μL；dNTP 4 μL；Prime STAR 0.5 μL；雙蒸水33 μL。

PCR循環(huán)參數(shù)為：預(yù)變性95 ℃，5 min；(95 ℃，1 min，56 ℃，15 s，72 ℃，2 min)，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。

1.6 谷氨酸棒桿菌中木糖代謝途徑的構(gòu)建

將純化的PCR產(chǎn)物和pXMJ19質(zhì)粒分別使用Hind III和XbaI雙酶切后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，通過酶切鑒定陽(yáng)性克隆子，命名為pXMJ19-xylA。將pXMJ19-xylA電轉(zhuǎn)化到C.glutamicumATCC13032 Δldh中，經(jīng)氯霉素抗性平板篩選后，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定陽(yáng)性重組子，命名為C.glutamicumNC-2。

1.7 木糖異構(gòu)酶的活性檢測(cè)

1.7.1 粗酶液的制備

取5 mL菌液于4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌2次后，菌體重懸于1 mL PBS(pH 7.2)緩沖液，于冰浴中超聲破碎細(xì)胞，離心取上清液即為粗酶液。

1.7.2 酶活力的測(cè)定

酶活力測(cè)定采用半胱氨酸-咔唑法[10]。PBS緩沖液(pH 7.2)50 μL ，0.1 molD-木糖50 μL，10 mmol/L MnCl250 μL于50 ℃反應(yīng)1 h后，沸水浴終止反應(yīng)；取50 μL立即加入1.5%的半胱氨酸鹽酸鹽0.2 mL，13 mol/L的H2SO46 mL，混勻，25 ℃反應(yīng)30 min后于540 nm處測(cè)定光吸收，根據(jù)木酮糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得木酮糖含量。

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物中，酶活力單位(U)定義為每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol 木酮糖所需的酶量。

1.8 分析方法

1.8.1 菌體密度的測(cè)定

采用UV-3000掃描型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司 )于600 nm 處測(cè)定吸光值OD600。

1.8.2 糖濃度的測(cè)定

葡萄糖濃度采用SBA 240C型生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定，木糖濃度測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[11]。

1.8.3 發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定

采用HPLC測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物，色譜條件：美國(guó)Alltech公司Prevail Organic Acid色譜柱(250 nm×4.6 mm,5 μm)，柱溫 室溫，流動(dòng)相 25 mmol/L KH2PO4、pH 2.5，流速 1 mL/min，進(jìn)樣量 25 μL；檢測(cè)器為紫外，檢測(cè)波長(zhǎng) 215 nm[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 目的基因xylA的克隆

以E.coliK-12基因組為模板，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，所克隆片段大小約為1.4 kb(圖1)，與預(yù)期片段大小一致，經(jīng)過測(cè)序分析，與Genebank中已知基因序列一致。

M—λ-EcoT14 I digest DNA Marker; 1—PCR product圖1 木糖異構(gòu)酶基因(xylA)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR product of xylA gene

2.2 重組菌株C.glutamicum NC-2的構(gòu)建

將酶切后的xylA片段和載體pXMJ19進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM109，經(jīng)氯霉素抗性平板篩選，提取質(zhì)粒通過EcoRI單酶切驗(yàn)證，通過瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，酶切后的片段大小約為8 kb，與預(yù)期結(jié)果一致，結(jié)果見圖2。將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到C.glutamicumATCC13032 Δldh中，經(jīng)氯霉素抗性篩選，提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I單酶切鑒定，獲得重組菌株C.glutamicumNC-2。

2.3 重組菌株C.glutamicum NC-2對(duì)木糖的利用

在添加20 g/L木糖或者葡萄糖的BT發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min有氧培養(yǎng)24 h,考察重組菌株C.glutamicumNC-2對(duì)木糖的利用情況，并與利用葡萄糖的情況進(jìn)行比較，結(jié)果見圖3。

M—λ-EcoT14 I digest DNA Marker;1—pXMJ19-xylA(+)/EcoR I圖2 表達(dá)重組子pXMJ19(+)-xylA的酶切鑒定Fig.2 EcoRI digest of recombinant plasmid pXMJ19-xylA(+)

圖3 C.glutamicum ATCC13032 Δldh和 C.glutamicum NC-2利用葡萄糖或 木糖的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of C. glutamicum ATCC13032 Δldh and C. glutamicum NC-2 strain in mineral medium containing either glucose or xylose

由圖3可知：在好氧條件下，重組菌株C.glutamicumNC-2與對(duì)照菌株C.glutamicumATCC13032 Δldh利用葡萄糖的生長(zhǎng)情況大致相同，但是在以木糖為唯一C源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，對(duì)照菌株C.glutamicumATCC13032 Δldh不能有效地利用木糖生長(zhǎng)，而重組菌株C.glutamicumNC-2經(jīng)過24 h的培養(yǎng)后其菌體生長(zhǎng)量超過其利用葡萄糖的菌體水平，木糖的消耗速率達(dá)到0.54 g/(L·h)，略低于葡萄糖(0.62 g/(L·h))，經(jīng)檢測(cè)重組菌木糖異構(gòu)酶比酶活約為0.54 U/mL。表明xylA的基因表達(dá)使菌株C.glutamicumATCC13032 Δldh具有利用木糖生長(zhǎng)的能力，拓寬了其底物利用范圍。

2.4 重組菌株C.glutamicum NC-2利用混合糖的生長(zhǎng)情況

在添加12 g/L木糖和14 g/L葡萄糖的BT發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min有氧培養(yǎng)36 h,考察重組菌株C.glutamicumNC-2利用混合糖的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知：在混合糖發(fā)酵過程中，重組菌株首先利用葡萄糖，在發(fā)酵24 h時(shí)，葡萄糖幾乎被消耗完，而木糖為9.8 g/L，僅消耗了15%，發(fā)酵至36 h時(shí)，60%的木糖被利用，該結(jié)果表明，由于碳代謝阻遏效應(yīng)的存在[13-14]，菌株不能夠同時(shí)對(duì)葡萄糖和木糖進(jìn)行利用。

圖4 C.glutamicum NC-2利用混合糖的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of C.glutamicum NC-2 strain in mineral medium containing mixed sugar

2.5 重組菌株C.glutamicum NC-2的兩階段發(fā)酵情況

為了考察重組菌株利用木糖生產(chǎn)有機(jī)酸的情況，本研究采用兩階段發(fā)酵模式，即利用添加20 g/L木糖的100 mL A培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h進(jìn)行好氧發(fā)酵，然后通過添加40 g/L木糖的50 mL BT培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)18 h進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，結(jié)果如表1所示。

由表1可知：對(duì)照菌株C.glutamicumATCC13032 Δldh不能夠以木糖作為唯一C源生產(chǎn)有機(jī)酸，而重組菌株C.glutamicumNC-2在厭氧條件下發(fā)酵18 h內(nèi)，可消耗(26.0±0.08)g/L木糖，發(fā)酵產(chǎn)物主要是琥珀酸，其收率可達(dá)到(0.62±0.003)g/g，與對(duì)照菌株相同條件下消耗葡萄糖發(fā)酵結(jié)果大致相同。

在谷氨酸棒桿菌中，運(yùn)輸己糖主要通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)[15]，但是機(jī)制尚不清楚，對(duì)于其他革蘭氏陽(yáng)性菌中戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制已有報(bào)道[16]：比如，突變的枯草芽胞桿菌通過AraE蛋白運(yùn)輸木糖，自身的H+同向運(yùn)輸載體負(fù)責(zé)阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[17]；幾種重組的釀酒酵母菌株通過非特異性的單糖運(yùn)輸系統(tǒng)吸收木糖，但是對(duì)木糖的親和力比葡萄糖低將近200倍[18]。本研究則通過表達(dá)xylA基因?qū)崿F(xiàn)了谷氨酸棒桿菌對(duì)木糖的利用，表明在谷氨酸棒桿菌中存在與木糖吸收有關(guān)的運(yùn)輸載體。

表1 菌株兩階段發(fā)酵結(jié)果Table 1 Results of two-stage fermentation

3 結(jié) 論

以拓寬谷氨酸棒桿菌底物利用譜進(jìn)行有機(jī)酸發(fā)酵為目標(biāo)，將E.colixylA基因成功構(gòu)建到誘導(dǎo)型表達(dá)載體pXMJ19，酶活測(cè)定證明轉(zhuǎn)入C.glutamicumATCC13032 Δldh中的酶基因得到了活性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明，該工程菌株C.glutamicumNC-2可以在木糖為唯一C源的培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h后的菌體生長(zhǎng)量與利用葡萄糖的菌體水平基本相同，木糖的消耗速率達(dá)到0.54 g/(L·h),與葡萄糖消耗速率相比略低。在添加葡萄糖和木糖的BT培養(yǎng)基中發(fā)酵時(shí)，重組菌優(yōu)先利用葡萄糖，在葡萄糖完全消耗后開始有效利用木糖，以木糖為唯一C源進(jìn)行兩階段發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)物主要為琥珀酸，收率為(0.62±0.003)g/g。木糖異構(gòu)酶對(duì)于木糖利用起著極為重要的作用。

[1] Gong C S,Cao N J,Du J,et al.Ethanol production from renewable resource[J].Adv Biocehm Eng/Biotechnol,1999,65:207-241.

[2] 張穎,馬瑞強(qiáng),洪浩舟,等.重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的構(gòu)建及木糖利用特性研究[J].生物技術(shù)通報(bào),2009(7):160-165.

[3] Kawaguchi H,Sasaki M,Vertès A A,et al.Engineering of anL-arabinose metabolic pathway inCorynebacteriumglutamicum[J].Appl Microbiol Biotechnol,2008,77(5):1053-1062.

[4] Cheung S W,Anderson B C.Laboratory investigation of ethanol production from municipal primary waste water solids[J].Bioresour Technol,1997,59:81-96.

[5] Sakai S,Tsuchida Y,Okion S,et al.Effect of lignocellulose-derived inhibitors on growth of and ethanol production by growth-arrestedCorynebacteriumglutamicumR[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(7):2349-2353.

[6] Blombach B,Seibold G M.Carbohydrate metabolism inCorynebacteriumglutamicumand applications for the metabolic engineering ofL-lysine production strains[J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,86(5):1313-1322.

[7] Sasaki M,Jojima T,Inui M,et al.Simultaneous utilization ofD-cellobiose,D-glucose,andD-xylose by recombinantCorynebacteriumglutamicumunder oxygen-deprived conditions[J].Appl Microbiol Biotechnol,2008,81(4):691-699.

[8] 薩姆布魯克 J，拉塞爾D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].3版.北京:科學(xué)出版社,2002.

[9] 余秉琦，沈徽，諸葛健.適用于異源DNA高效整合轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒桿菌電轉(zhuǎn)化法[J].中國(guó)生物工程雜志,2005,25(2):78-81.

[10] Dische Z,Borenfreund E.A new spectrophotometric method for the detection anddetermination of keto sugars and trioses[J].J Biol Chem,1951,912:583-587.

[11] 寧正祥.食品成分分析手冊(cè)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社,1998.

[12] Liu R,Liang L,Chen K,et al.Fermentation of xylose to succinate by enhancement of ATP supply in metabolically engineeredEscherichiacoli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,94(4):959-968.

[13] Magasanik B.Catabolite repression[J].Cold Spring Harbor Symp Quant Biol,1961,26:249-256.

[14] Deutscher J.The mechanisms of carbon catabolite repression in bacteria[J].Curr Opin Microbiol,2008,11(2):87-93.

[15] Kotrba P,Inui M,Yukawa H.TheptsI gene encoding enzyme I of the phosphotransferase system ofCorynebacteriumglutamicum[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,289:1307-1313.

[16] Stülke J,Hillen W.Regulation of carbon catabolism inBacillusspecies[J].Annu Rev Microbiol,2000,54:849-880.

[17] Krispin O,Allmansberger R.TheBacillussubtilisAraE protein displays a broad substrate specificity for several different sugars[J].J Bacteriol,1998,180:3250-3252.

[18] Hamacher T,Becher J,Gárdonyi M,et al.Characterization of the xylose-transporting properties of yeast hexose transporters and their influence on xylose utilization[J].Microbiol,2002，148:2783-2788.

(責(zé)任編輯 荀志金)

Construction of xylose-utilizing recombinant Corynebacterium glutamicum strain

ZHANG Hengli,CAI Heng,WANG Chen,ZHANG Kai,ZHOU Zhihui

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

In order to construct a strain ofCorynebacteriumglutamicumby using the xylose to produce organic acids,thexylAgene fromEscherichiacoliK-12,encoding xylose isomerase,was integrated in the expression vector of pXMJ19.The gene was expressed in theCorynebacteriumglutamicumATCC13032 Δldhstrain.The recombinant strain was capable of growth on xylose as a sole carbon source,the xylose consumption rate was 0.54 g/(L·h).The xylose isomerase activity reached 0.54 U/mL.In medium containing glucose and xylose,the recombinant strain consumed glucose first，after the glucose was consumped entirely,the effective utilization of xylose was started.The yield of succinate was (0.62±0.003) g/g during the two-stage fermentation on xylose as a sole carbon source.

Corynebacteriumglutamicum;succinic acid;xylA;xylose

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.006

2012-10-30

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2011CB707405)

張恒麗(1985—)，女，河北邢臺(tái)人，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)，基因工程；蔡 恒(聯(lián)系人)，副教授，E-mail:cheng@njtech.edu.cn

Q786

A

1672-3678(2014)02-0028-05