甲基磺酸乙酯誘變選育竹紅菌甲素高產(chǎn)菌株

楊珠英，潘魏松，聶 云，羅 晗，王劍文

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，蘇州215123)

甲基磺酸乙酯誘變選育竹紅菌甲素高產(chǎn)菌株

楊珠英，潘魏松，聶 云，羅 晗，王劍文

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，蘇州215123)

以從短穗竹(Brachystachyumdensiflorum)莖稈中分離獲得的竹黃菌(Shiraiasp.S8)菌株為出發(fā)菌株，以0.5%～2.5%甲基磺酸乙酯(EMS)處理竹黃菌懸浮孢子10～30 min，結(jié)合平板初篩和高效液相色譜(HPLC)分析進(jìn)行復(fù)篩。經(jīng)誘變篩選得到高產(chǎn)菌株10-5，發(fā)現(xiàn)其竹紅菌甲素產(chǎn)量達(dá)到26.8 mg/L，與原始出發(fā)菌株相比提高了46.4%，且遺傳穩(wěn)定性良好，具有較高的醫(yī)藥及工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

甲基磺酸乙酯；竹紅菌素；選育；竹黃菌

竹紅菌素(hypocrellin)屬于苝醌類化合物，包括竹紅菌甲素(hypocrellin A，簡(jiǎn)稱HA)、乙素、丙素和丁素4種化合物，竹紅菌甲素是其中的主要成分，是目前已知的可用于可見光區(qū)的優(yōu)良光敏劑。竹紅菌甲素、乙素具有殺傷腫瘤細(xì)胞、抗病毒、抑制微血管病變等功能，并對(duì)HIV-1型病毒有抑制作用[1]。竹紅菌甲素主要來源于野生竹黃菌，但野生竹黃菌采收期短、產(chǎn)量低、地域分布不平衡，使得竹紅菌甲素目前尚未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，其應(yīng)用也受到了很大限制。高產(chǎn)菌株的篩選有利于實(shí)現(xiàn)竹紅菌素的規(guī)?；a(chǎn)，從而大大加快竹紅菌素及竹黃相關(guān)藥品、產(chǎn)品的開發(fā)，同時(shí)也有利于對(duì)野生竹黃的資源保護(hù)。

甲基磺酸乙酯(EMS)是一種常用的化學(xué)誘變劑，可用于處理甘藍(lán)型油菜獲得高油酸材料[2]，以及誘變篩選馬鈴薯莖段離體耐鹽變異體[3]和誘變選育低產(chǎn)蛋白酶A啤酒酵母[4]等。目前，針對(duì)竹黃菌的菌株選育尚少見報(bào)道，筆者所在實(shí)驗(yàn)室通過采用紫外與亞硝基胍基因改組，提高了該菌的產(chǎn)量[5]。筆者利用分離得到的竹紅菌甲素產(chǎn)生菌——竹黃無性型菌株ShiraiabambusicolaS8為出發(fā)菌株，使用EMS對(duì)竹黃菌的孢子進(jìn)行化學(xué)誘變，選育出高產(chǎn)竹紅菌甲素的變異菌株，以期為利用竹黃菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)提供菌種基礎(chǔ)，也為竹紅菌素的生物技術(shù)開發(fā)提供生產(chǎn)資源和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

出發(fā)菌株：分離自南京紫金山麓短穗竹Brachystachyumdensiflorum(Rendle)莖稈的竹黃無性型菌株(Shiraiasp. S8)，由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，編號(hào)為CGMCC No.3984。

菌體生長(zhǎng)固體培養(yǎng)基：PDA固體平板。

生孢培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，酵母膏2.5，KCl 1.8，NaAc 8.2，瓊脂15。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：土豆20,葡萄糖2，KH2PO40.3，MgSO40.15，VB10.001，酵母膏0.5。

甲基磺酸乙酯(EMS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 主要儀器

SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；MLS-3780高壓蒸氣滅菌鍋，日本三洋公司；Agilent液相系統(tǒng)，美國(guó)Agilent公司；Allegra 64R型冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；CKX41型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；PYX-DHS-40X50-S-Ⅱ型恒溫培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 單孢子懸液制備

出發(fā)菌株接種到生孢培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，用無菌生理鹽水吹打收集孢子，得到的孢子懸液經(jīng)兩層孔徑為75 μm的尼龍篩過濾除去菌絲體，經(jīng)3 000 r/min離心10 min收集孢子，小心洗滌沉淀3次，以磷酸鹽緩沖液重懸并調(diào)節(jié)孢子密度約為107個(gè)/mL。

1.3.2 EMS誘變方法

參照文獻(xiàn)[4]的方法，略有修改：取19.6 mL孢子懸液加入0.4 mL EMS(終體積分?jǐn)?shù)2%)混勻后振蕩誘變10～120 min，對(duì)照組加入等量生理鹽水。誘變結(jié)束后加入等體積的2% Na2S2O3終止反應(yīng)，靜置10 min，離心棄上清，再用2% Na2S2O3和無菌生理鹽水各洗2次后，用無菌生理鹽水重懸孢子，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布于PDA固體平板培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)。同時(shí)涂布等量對(duì)照組孢子，根據(jù)誘變后孢子和對(duì)照組的再生菌落數(shù)計(jì)算存活率。

1.3.3 篩選方法

1)初篩：挑取上述誘變后培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的菌落接種到新的PDA培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)6 d，觀察比較平板上紅色色素圈的大小，選取生長(zhǎng)良好、色素圈直徑大的菌株進(jìn)行復(fù)篩[6]。

2)復(fù)篩：采用三角瓶發(fā)酵法，經(jīng)初篩得到的高產(chǎn)菌株打孔接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，150 r/min振蕩培養(yǎng)10 d后測(cè)定竹紅菌甲素產(chǎn)量，每個(gè)菌株重復(fù)3瓶取平均值。

1.3.4 遺傳穩(wěn)定性測(cè)試

將篩選得到的高產(chǎn)突變菌株連續(xù)傳代5次，經(jīng)液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，通過HPLC測(cè)定產(chǎn)量，觀察其遺傳穩(wěn)定性。

1.3.5 分析測(cè)定方法

1)致死率計(jì)算 誘變后孢子再生菌落數(shù)記為A，對(duì)照組再生菌落數(shù)記為B，按下式(1)計(jì)算存活率。

(1)

2)竹紅菌甲素產(chǎn)量的測(cè)定：取干燥研碎的竹黃菌體粉末0.1 g，加入5 mL丙酮浸提24 h，重復(fù)此步驟一次，合并2次提取液，定容到10 mL，得到竹紅菌甲素提取液，提取液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后經(jīng)HPLC分析。色譜條件為色譜柱SinoChrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)=75∶25，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為300 nm，進(jìn)樣量為20 μL[7]。此條件下，竹紅菌甲素的保留時(shí)間為23.5 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC測(cè)定竹紅菌甲素的含量

竹黃菌菌絲經(jīng)過干燥、粉碎和丙酮浸提后，收集提取液，蒸干后以甲醇重溶。以竹紅菌甲素標(biāo)準(zhǔn)品作為外標(biāo)對(duì)照，對(duì)提取液進(jìn)行HPLC分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。圖1(a)為竹紅菌甲素標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，圖1(b)為提取液分析圖譜，目標(biāo)峰用星號(hào)表示。經(jīng)測(cè)定，出發(fā)菌株的竹紅菌甲素產(chǎn)量為18.3 mg/L。

圖1 竹紅菌甲素HPLC分析圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of hypocrellin A

2.2 EMS最佳誘變條件的確定

圖2 竹黃菌菌絲和孢子的顯微鏡觀察Fig.2 Microscopic examination of mycelia and spores of shiraia sp.

在顯微鏡下觀察竹黃菌的菌絲體形態(tài)如圖2(a)所示，根據(jù)1.3.2的方法，使用不同濃度EMS處理竹黃菌孢子(圖2 (b))懸液不同的時(shí)間，所得存活率結(jié)果見表1。由表1可知，經(jīng)過EMS處理的竹黃菌孢子存活率均低于對(duì)照，而且隨著EMS濃度的提高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。綜合考慮誘變效果和存活率，本實(shí)驗(yàn)最終選取濃度為1.5%～2%的EMS溶液，誘變完成后在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行孢子再生，挑選單菌落進(jìn)行高產(chǎn)菌株的篩選。

表1 不同濃度EMS處理后的孢子存活率Table 1 Survival rate of spores after EMS treatments

2.3 高產(chǎn)菌株的篩選

孢子經(jīng)EMS誘變、再生后，選取菌絲長(zhǎng)勢(shì)好、產(chǎn)孢能力強(qiáng)的菌株接種至PDA平板，總共挑取了40株誘變菌株，發(fā)現(xiàn)竹紅菌素產(chǎn)量變化范圍從幾乎不產(chǎn)竹紅菌素到最高為30 mg/L。

根據(jù)菌株的生長(zhǎng)情況及竹紅菌甲素產(chǎn)量進(jìn)行誘變株的初步篩選。發(fā)現(xiàn)誘變后的菌株有的表現(xiàn)出竹紅菌甲素產(chǎn)量提升，有的反而幾乎不產(chǎn)竹紅菌甲素，表明采用EMS進(jìn)行化學(xué)誘變對(duì)菌株性狀的影響具有隨機(jī)性，因此在菌種選育工作中實(shí)現(xiàn)定向育種依然是研究中的一個(gè)重要方向。

比較誘變菌株紅色色素圈大小，結(jié)果如圖3所示。從挑取的單菌落中選出色素圈直徑大于原代且生長(zhǎng)良好的9株突變菌株用于復(fù)篩。

a～d:不同誘變菌株的色素圈形態(tài)圖3 竹紅菌甲素高產(chǎn)菌株的初篩Fig.3 Primary screen on mutant strain of higher production of HA

將經(jīng)初篩得到的性狀、產(chǎn)量提升的9株誘變菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，如1.3.5中的方法通過HPLC測(cè)定竹紅菌甲素產(chǎn)量，每個(gè)菌株重復(fù)3組，測(cè)得的竹紅菌甲素產(chǎn)量結(jié)果取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，從初篩得到的菌株HA產(chǎn)量均有一定程度的提升，其中10-5菌株表現(xiàn)最佳，HA產(chǎn)量達(dá)到26.8 mg/L，與出發(fā)菌株相比提高了46.4%，且菌株生長(zhǎng)情況也有改善，可以應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)竹紅菌甲素。

表2 竹黃菌誘變株與出發(fā)菌株竹紅菌甲素產(chǎn)量的比較Table 2 Comparison of HA production between mutated and original strains

2.4 遺傳穩(wěn)定性的測(cè)試

將篩選得到的菌株10-5連續(xù)傳代5次，經(jīng)液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，通過HPLC測(cè)定產(chǎn)量，結(jié)果見表3。由表3可知，10-5菌株的竹紅菌甲素產(chǎn)量較穩(wěn)定，遺傳穩(wěn)定性良好。

3 結(jié) 論

通過實(shí)驗(yàn)首先確定了竹黃菌孢子EMS誘變的適宜誘變劑量：1.5%～2%EMS溶液。篩選獲得的竹紅菌甲素高產(chǎn)突變株，經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)量相比出發(fā)菌株提高46.4%，且遺傳穩(wěn)定性良好。說明本研究應(yīng)用的EMS化學(xué)誘變技術(shù)在竹紅菌甲素產(chǎn)量提升上具有很好的效果，但誘變后菌株性狀的變化具有隨機(jī)性，篩選的工作量很大。今后的研究中，筆者將進(jìn)一步探討竹紅菌甲素的生物合成途徑和誘導(dǎo)技術(shù)，并將運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)合成途徑中的關(guān)鍵酶等進(jìn)行表達(dá)修飾，通過生物反應(yīng)器生產(chǎn)技術(shù)的探討，為竹紅菌甲素生物技術(shù)生產(chǎn)提供基礎(chǔ)和參考。

表3 10-5菌株傳代穩(wěn)定性的測(cè)試結(jié)果Table 3 Verification of the mutation strain 10-5

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(責(zé)任編輯 周曉薇)

Breeding of Shiraia sp.strain with high-yield hypocrellin by EMS mutation

YANG Zhuying，PAN Weisong，NIE Yun,LUO Han,WANG Jianwen

(School of Pharmaceutical Sciences，Medical College，Soochow University，Suzhou 215123，China)

One isolated strainShiraiasp. S8 from the stems ofBrachystachyumdensiflorumwas breeding candidates for higher production of hypocrellin A (HA) by ethyl methane sulphonate (EMS) mutation． EMS at 0.5% to 2.5% was used to treat the suspension spores for 10 min to 30 min.Through the combined methods with the preliminary screening on the diameter of the red pigment ring and HPLC,the mutant 10-5 with higher HA yield was obtained and the production was verified to be genetically stable.HA yield by mutant 10-5 was increased by 46.4% than that of the original strain.The EMS mutant had industrial potential and pharmaceutical importance for HA.

ethyl methane sulphonate;hypocrellin;screening;Shiraiasp.

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.005

2012-10-11

教育部留學(xué)基金(K513201011);國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(5731502710);大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科研基金(KY2013558B)

楊珠英(1978—),女，浙江義烏人,碩士研究生,研究方向:天然藥物生物技術(shù);王劍文(聯(lián)系人),研究員，E-mail:jwwang@suda.edu.cn

Q784

A

1672-3678(2014)02-0024-04