沙柳原料高濃度底物酶解發(fā)酵乙醇工藝

林增祥，李榮秀，劉 莉，沈兆兵，史吉平

(1.中國科學院上海高等研究院可持續(xù)技術(shù)研究中心，上海201210；2.上海交通大學生命科學技術(shù)學院生物制造實驗室，上海200240)

沙柳原料高濃度底物酶解發(fā)酵乙醇工藝

林增祥1,2，李榮秀2，劉 莉1，沈兆兵1，史吉平1

(1.中國科學院上海高等研究院可持續(xù)技術(shù)研究中心，上海201210；2.上海交通大學生命科學技術(shù)學院生物制造實驗室，上海200240)

為了提高沙柳生物轉(zhuǎn)化過程的經(jīng)濟可行性，考察了沙柳原料經(jīng)過蒸爆、超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀堿預(yù)處理后高濃度底物補料酶解的效果，并對其高濃度水解糖液進行了乙醇發(fā)酵。結(jié)果表明：蒸爆處理法水解效果最好，通過補料酶解，底物質(zhì)量分數(shù)可以達到30%，酶解液中總糖質(zhì)量濃度達到132 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度105 g/L； 超微粉碎+稀酸預(yù)處理原料底物質(zhì)量分數(shù)可以達到22%，酶解液中總糖質(zhì)量濃度達到123 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度73 g/L；超微粉碎+稀堿預(yù)處理原料底物質(zhì)量分數(shù)可以達到22%，酶解液中總糖質(zhì)量濃度133 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度77 g/L。3種預(yù)處理使沙柳原料的酶解糖液都可以較好地被釀酒酵母利用發(fā)酵產(chǎn)乙醇，蒸爆處理原料的酶解糖液乙醇發(fā)酵效果最好，乙醇質(zhì)量濃度達到47 g/L。

乙醇；發(fā)酵；高濃酶解；預(yù)處理；沙柳

沙柳(Salixpsammophila)是一種常見的沙生灌木，具有良好的防風固沙、保持水土、改善生態(tài)的特性，廣泛生長在內(nèi)蒙古、青海、甘肅、新疆等地區(qū)。沙柳平均3～4年平茬一次，平茬以后可繼續(xù)茂盛生長，否則會自然衰敗枯死。目前，平茬下來的枝條除少部分被用來造紙及生產(chǎn)人造板外[1]，大部分未被充分利用。

沙柳可以作為纖維素乙醇等生化產(chǎn)品潛在的木質(zhì)纖維原料，其生物轉(zhuǎn)化過程主要有3個環(huán)節(jié)：首先是對沙柳進行預(yù)處理，其次是將原料中的纖維素、半纖維素水解為可發(fā)酵的糖，最后是以水解糖液利用酵母菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇。由于木質(zhì)纖維素內(nèi)部致密復(fù)雜的天然結(jié)構(gòu)及纖維素結(jié)晶的特點，阻礙了纖維素酶對纖維素的水解，因此需要采用合適的預(yù)處理方法，以提高纖維素的酶水解效率。原料經(jīng)過預(yù)處理過程可以實現(xiàn)木質(zhì)纖維素原料的組分分離和結(jié)構(gòu)改變，從而進一步提高酶水解效率[2-4]。近年來,研究應(yīng)用較多的木質(zhì)纖維原料預(yù)處理方法中主要有蒸氣爆破預(yù)處理、稀酸預(yù)處理和稀堿預(yù)處理等。雖然科研人員對木質(zhì)纖維素的預(yù)處理方法進行了大量研究，但是針對沙柳原料的預(yù)處理及高濃度底物酶解發(fā)酵的研究仍相對比較少[5-9]。

纖維素乙醇原料的酶解過程廣泛采用提高底物濃度的方法，以提高纖維素乙醇生產(chǎn)工藝的經(jīng)濟性。這樣不僅可以提高原料水解液的糖濃度，還可以提高發(fā)酵液中乙醇的濃度。這樣就可以減小設(shè)備的規(guī)模,降低乙醇濃縮時的能耗以及整個工藝過程的水耗。但是如果纖維素酶水解時的初始干物質(zhì)含量高于15%，整個反應(yīng)體系基本以濕的固體物料的形態(tài)存在，會嚴重影響酶解過程的傳質(zhì)和傳熱問題，大大降低酶解反應(yīng)的速率，不利于酶解反應(yīng)進行。通過分批補料酶解工藝是解決這一難題的重要方法。

本研究以經(jīng)過蒸爆、超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀堿3種預(yù)處理的沙柳枝條為原料，在高濃度底物條件下對原料酶解發(fā)酵效果進行考察，以期為沙柳原料的低成本、高效率的生物轉(zhuǎn)化，同時對我國沙化土地治理模式、促進沙地生態(tài)能源林基地建設(shè)提供參考[10-11]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1)原料 沙柳(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古鄂爾多斯，水份含量5.5%)；

2)纖維素酶制劑 纖維素酶(上海尤特爾生化有限公司，濾紙酶活：346 FPU/g)；

3)釀酒酵母 超級釀酒高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)；

4)原料預(yù)處理設(shè)備 QBS-80型汽爆工藝試驗臺(河南鶴壁市正道重機集團有限公司)，超微氣流粉碎機(上海高等研究院微納粉體設(shè)備研發(fā)實驗室)。

1.2 沙柳原料的預(yù)處理

根據(jù)本實驗室前期的研究基礎(chǔ)，確定了沙柳原料的蒸氣爆破預(yù)處理、超微粉碎+稀酸預(yù)處理、超微粉碎+稀堿預(yù)處理的最優(yōu)條件如下[12-14]：

1)超微粉碎+稀堿處理 超微粉碎原料粒度(15 μm)、NaOH 0.8%(質(zhì)量體積比)、95 ℃、45 min。

2)超微粉碎+稀酸處理 超微粉碎原料粒度(15 μm)、固液比1∶12(g/mL)、溫度160 ℃、H2SO40.5%、時間20 min。

3)蒸氣爆破預(yù)處理 蒸爆處理條件為壓力3.5 MPa、維壓時間300 s。

將經(jīng)過預(yù)處理的沙柳原料用自來水沖洗，紗布過濾，取濾渣自然晾干，然后用自封塑料袋封裝儲藏。

1.3 預(yù)處理沙柳原料的酶解

1) 批式酶解 蒸氣爆破預(yù)處理、超微粉碎+稀酸預(yù)處理、超微粉碎+稀堿預(yù)處理的沙柳原料，各準確稱取12.0 g(干質(zhì)量)，加入0.05 mol/L檸檬酸緩沖液，1 g底物纖維素酶加量為20 FPU，酶解體系底物質(zhì)量分數(shù)為12%，三角搖瓶酶解，酶解糖化條件為：pH 4.8、恒溫搖床轉(zhuǎn)速250 r/min、溫度50 ℃、酶解72 h后，酶解液離心，取上清液測定酶解液中糖濃度，沙柳原料酶解率(Y)按下式(1)計算。

(1)

式中：m1為酶解液中還原糖質(zhì)量,g；m2為底物中纖維素質(zhì)量，g；m3為底物中半纖維素質(zhì)量,g。

2)補料酶解 酶解初始底物濃度為12%，酶解糖化條件同上。在酶解24 h后補料，蒸爆處理原料最終底物質(zhì)量分數(shù)達到30%，酶加量分別達到30、40和60 FPU/g底物；稀酸、稀堿處理底物達到22%，酶加量分別達到30、40和60 FPU/g底物，補料酶解96 h后，取酶解樣液分析總糖濃度與葡萄糖濃度。

1.4 酶解液的乙醇發(fā)酵

取50 mL補料酶解得到的沙柳酶解液，裝入100 mL三角瓶中，添加安琪酵母粉4.0 g/L，于37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速100 r/min，發(fā)酵60 h后取發(fā)酵液，離心，取上清液檢測分析。

1.5 分析方法

1.5.1 水解液中葡萄糖含量的分析

利用山東省科學院生物研究所SBA-40D型生物傳感分析儀測定。

1.5.2 水解液中總還原糖含量的分析

采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定[15]。

1.5.3 發(fā)酵液中乙醇含量的分析

采用氣相色譜(GC)法測定乙醇含量[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理方法對沙柳原料組分的影響

圖1 預(yù)處理方法對沙柳原料中纖維素與 半纖維素含量的影響Fig.1 Effects of pretreatment methods on cellulose and hemicelluloses components in Salix

參照文獻[17]的原料分析方法，對不同預(yù)處理沙柳原料中纖維素與半纖維素含量進行分析，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出：經(jīng)過預(yù)處理后的原料其組分含量發(fā)生了較大的變化。超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀堿處理過程中由于酸堿對原料的水解作用，使得處理后的沙柳原料中半纖維素含量減少，纖維素組分相對不易被水解導(dǎo)致其含量在原料中相對增高。在蒸氣爆破過程中，蒸爆處理原料的纖維素和半纖維素組分由于受到高溫高壓水的作用而發(fā)生水解、熱降解，導(dǎo)致纖維素和半纖維素含量降低。尤其半纖維素組分在高溫長時間的處理過程中大部分發(fā)生了自水解和降解，使其在原料處理中含量最低[18-19]。

2.2 預(yù)處理方法對酶解的影響

比較經(jīng)過不同預(yù)處理方法的沙柳原料在相同的酶解條件下的水解效果結(jié)果見圖2。由圖2可以看出：蒸氣爆破預(yù)處理沙柳原料水解效率最高，原料的水解率可以達到93.8%。這是由于沙柳原料經(jīng)蒸汽爆破預(yù)處理后,物料的粒度變小、致密的纖維束相互分開松散、原料比表面積增大、天然纖維的部分結(jié)晶結(jié)構(gòu)破壞、物料中半纖維素和部分木質(zhì)素被降解以及纖維素內(nèi)部氫鍵的破壞等，有利于增加纖維素酶的可及度，從而提高了纖維素酶的水解效率和原料的酶水解率[12,20]。

圖2 預(yù)處理方法對酶解的影響Fig.2 Effects of pretreatment mehods on batch enzymatic hydrolysis of Salix

超微粉碎+稀堿預(yù)處理的過程機制與蒸氣爆破處理法不同，稀堿處理法利用NaOH中OH-，使木質(zhì)素的醚鍵斷裂，削弱纖維素、半纖維素的氫鍵，皂化半纖維素和木質(zhì)素之間的酯鍵。隨著醚鍵的減少，部分果膠、木質(zhì)素和半纖維素等低分子雜質(zhì)溶解于反應(yīng)液中，同時纖維素膨脹，半纖維素溶解，原料的空隙率增加。稀堿處理后的原料中纖維素得到潤脹，結(jié)晶度降低，天然纖維素復(fù)雜的剛性結(jié)構(gòu)被破壞，進而提高了超微粉碎沙柳原料的酶解率。超微粉碎+稀酸預(yù)處理過程可以將木質(zhì)纖維素原料中半纖維素水解為木糖，隨著半纖維素的水解，原料中纖維素的結(jié)晶度降低，原料變得疏松，從而可以增大纖維素與纖維素酶的接觸面積，進而提高原料的酶解效率，使預(yù)處理原料水解率可以達到70%[13-14，21-22]。

2.3 高濃度底物補料對酶解的影響

為了獲得較高的發(fā)酵產(chǎn)物濃度，木質(zhì)纖維素原料在酶解過程中通常采用增大底物濃度的方法。但是較高的初始底物濃度會給原料的水解過程帶來嚴重的傳熱傳質(zhì)問題，因此為了加快原料的酶水解反應(yīng)速度以及強化反應(yīng)過程，通過分批補料的酶解方式可以解決這一難題。

考察經(jīng)不同預(yù)處理法后的沙柳原料在高濃度底物條件下的水解效果，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出：蒸爆處理原料的水解效果最好，在30%底物濃度，30 FPU/g底物的條件下，原料的水解率為87%，葡萄糖質(zhì)量濃度91 g/L；當加酶量為60 FPU/g底物時，原料水解率可以達到最大值，酶解液中葡萄糖質(zhì)量濃度105 g/L，總糖質(zhì)量濃度132 g/L。相對來講，以超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀堿處理原料時，由于原料無法充分酶解，為濕的物料團塊，非流體狀態(tài)的酶解液，所以當酶加量達到60 FPU/g底物時，酶解體系為較黏稠的流體狀態(tài)酶解液。在此條件下，超微粉碎+稀酸處理原料水解率為73%，酶解液中葡萄糖質(zhì)量濃度75 g/L，總糖質(zhì)量濃度123 g/L。超微粉碎+稀堿處理原料水解率72%，酶解液中葡萄糖質(zhì)量濃度77 g/L，總糖質(zhì)量濃度133 g/L。

圖3 高濃底物補料對酶解的影響Fig.3 Effects of high solid concentration on enzymatic hydrolysis

2.4 高濃度底物水解液的乙醇發(fā)酵結(jié)果

通過比較蒸爆、超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀堿預(yù)處理原料高濃度底物酶解液的發(fā)酵效果，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出：蒸爆預(yù)處理原料酶解糖液的乙醇發(fā)酵效果最好，發(fā)酵后的乙醇質(zhì)量濃度最高可以達到47 g/L。相對來講，發(fā)酵液中殘留葡萄糖質(zhì)量濃度也較高，主要是因為蒸爆處理原料酶解液的發(fā)酵體系中固形物含量較高所致，而較高的固形物濃度易導(dǎo)致發(fā)酵糖液的流體狀態(tài)比較黏稠，進而影響了發(fā)酵過程的傳質(zhì)效果，使得有部分的葡萄糖殘留。相比較而言，超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀堿處理原料的酶解液中殘留的葡萄糖質(zhì)量濃度較低，這是由于固形物濃度相對較低，因此發(fā)酵過程中發(fā)酵糖液的黏度也比較小，促進了發(fā)酵過程的傳質(zhì)效果，而發(fā)酵液中總糖殘留較高說明在酵母發(fā)酵過程中，酶解液中還有不能被酵母利用的木糖等其他糖成分殘留。

圖4 沙柳原料水解液乙醇發(fā)酵結(jié)果Fig.4 Ethanol fermentation results of Salix hydrolyzate

3 結(jié) 論

通過對蒸爆預(yù)處理、超微粉碎+稀酸預(yù)處理、超微粉碎+稀堿預(yù)處理沙柳原料在相同酶解條件下的酶水解效果的考察，可以看出蒸氣爆破預(yù)處理沙柳原料水解效率最高，原料的水解率可以達到93.8%；超微粉碎+稀酸、超微粉碎+稀堿處理法水解效果則相差不大。

通過對高濃度底物補料酶解效果的考察，可以看出蒸氣爆破預(yù)處理原料水解速度最快，酶解最終底物質(zhì)量濃度可以達到30%，酶解4 d后酶解液中總糖質(zhì)量濃度達到132 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度105 g/L；超微粉碎+稀酸預(yù)處理原料底物質(zhì)量濃度可以達到22%，酶解液中總糖質(zhì)量濃度123 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度73 g/L；超微粉碎+稀堿預(yù)處理原料底物質(zhì)量濃度可以達到22%，酶解液中總糖質(zhì)量濃度133 g/L，葡萄糖質(zhì)量濃度77 g/L。

通過對酶解液發(fā)酵效果的考察可以看出，3種預(yù)處理方法所得沙柳水解液都可以較好地被釀酒酵母利用發(fā)酵產(chǎn)乙醇，蒸爆預(yù)處理的原料酶解液葡萄糖濃度最高，因而發(fā)酵液中乙醇含量也最高，可以達到47 g/L。但是發(fā)酵液中葡萄糖有殘留，利用不充分，主要是因為高固含量的酶解發(fā)酵體系影響了發(fā)酵過程的傳質(zhì)效果，使得水解液中糖成分不能被充分的利用。因此，為了提高葡萄糖的利用率，后續(xù)的研究可以通過改進發(fā)酵反應(yīng)器設(shè)計增加傳質(zhì)效果，或者采取固液分離的發(fā)酵方法。

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(責任編輯 周曉薇)

Process of high-solid loadings on enzymatic hydrolysis andethanol fermentation of Salix biomass

LIN Zengxiang1,2,LI Rongxiu2,LIU Li1,SHEN Zhaobing1，SHI Jiping1

(1.Research Center for Sustainable Technology,Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai,201210,China; 2.Key Laboratory of Microbial Metabolism of the Ministry,College of Life Science and Biotechnology,Shanghai JiaoTong University,Shanghai 200240,China)

In order to improve the economic benefit of theSalixbiorefinery process,this paper examined theSalixpretreatment by steam explosion,ultrafine grinding with dilute acid,ultrafine grinding with dilute alkali,followed by high solid concentration of enzymatic hydrolysis,and ethanol fermentation by yeast.The results showed that steam explosion is the best pretreatment method forSalixenzymatic hydrolysis.The substrate concentration could reach 30% by feeding enzymatic method.The enzymatic hydrolyzate of total sugar concentration was 132 g/L and the glucose was 105 g/L.When using the ultrafine grinding and dilute acid pretreated material,the substrate concentration could reach 22%, the enzymatic hydrolyzate of total sugar concentration was 123 g/L and glucose concentration was 73 g/L.When using the ultrafine grinding and dilute alkali pretreated material,the substrate concentration could reach 22%,the enzymatic hydrolyzate of total sugar concentration was 133 g/L and glucose concentration was 77 g/L.The enzymatic hydrolyzate of three pretreatment methods forSalixcould be fermented to ethanol by yeast and the hydrolyzate of steam explosion pretreated materials could reach 47 g/L ethanol by fermentation.

ethanol;fermentation；high-solid loading hydrolysis；pretreatment；Salix

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.001

2013-01-05

上海市科委項目(10dz1210400)；上海浦東博士后基金(Y234081D01)

林增祥(1980—)，男，新疆博樂人，博士后，研究方向：生物化工；史吉平(聯(lián)系人)，研究員,E-mail:shijp@sari.ac.cn

S216.2

A

1672-3678(2014)02-0001-05