離子交換層析結(jié)合反向色譜純化聚二氨基丙酸

夏 軍，許召賢，薄芳芳，馮小海，遲 波，徐 虹

(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，南京211800)

離子交換層析結(jié)合反向色譜純化聚二氨基丙酸

夏 軍，許召賢，薄芳芳，馮小海，遲 波，徐 虹

(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，南京211800)

ε-聚賴氨酸生產(chǎn)菌株StreptomycesalbulusPD-1可合成一種新型非蛋白質(zhì)氨基酸均聚物聚二氨基丙酸，采用離子交換層析和反向色譜，對(duì)聚二氨基丙酸的分離純化進(jìn)行研究。離子交換層析柱選用DEAE-Sepharose Fast Flow填料，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)平衡上樣，含0.5 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)洗脫，收集洗脫液用分子篩Sephadex G-25除去磷酸鹽緩沖液。然后用C18反相色譜進(jìn)一步純化，流動(dòng)相為V(甲醇)/V(0.1%磷酸)=5/95。經(jīng)過離子交換層析和反向色譜，純化得到聚二氨基丙酸純品，回收率為39.8%，樣品純度達(dá)98.4%，為后續(xù)的聚二氨基丙酸的深入研究奠定基礎(chǔ)。

聚二氨基丙酸；純化；離子交換層析；反向色譜

聚氨基酸是由氨基酸單體的羥基和氨基形成的酰胺鍵連接而成的一類聚合物，聚氨基酸的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)有些相似，但是二者的合成機(jī)理是完全不同的。生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成是在DNA指導(dǎo)下通過轉(zhuǎn)錄、翻譯，按照特定的氨基酸順序(mRNA上堿基序列)進(jìn)行合成的，而聚氨基酸一般是在非核糖體多肽合成酶催化下，氨基酸單體聚合而成的具有一定相對(duì)分子質(zhì)量的聚合物[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)的微生物合成均聚氨基酸(包括非蛋白質(zhì)氨基酸)有ε-聚賴氨酸、γ-聚谷氨酸、γ-聚二氨基丁酸[2-4]，此外，微生物合成的多聚氨基酸有聚(精氨酸-組氨酸)、聚-L-精氨酰-聚(L-天冬氨酸)(藻青素)[1，5]。聚氨基酸一般具有水溶性、電荷密度高、可生物降解等許多獨(dú)特的理化和生物學(xué)特性，聚氨基酸及其衍生物在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、電子等諸多領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景[1]。

聚二氨基丙酸 (poly(L-diaminopropionic acid)，PDAP) 是從ε-聚賴氨酸生產(chǎn)菌StreptomycesalbulusPD-1發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)的一種新型非蛋白質(zhì)氨基酸均聚物，是由L-二氨基丙酸單體的羥基和氨基形成的酰胺鍵連接而成的，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。由于側(cè)鏈上擁有大量游離氨基，聚二氨基丙酸屬于一種帶正電荷的多肽類物質(zhì)，對(duì)細(xì)菌、酵母等微生物具有抑制作用[6]。放線菌Streptomycealbulus是工業(yè)生產(chǎn)菌株，其主產(chǎn)物ε-聚賴氨酸具有抑菌譜廣、安全性高、熱穩(wěn)定性高以及試用pH范圍廣等特點(diǎn)，目前包括美國、日本、韓國在內(nèi)的多個(gè)國家已經(jīng)批準(zhǔn)ε-聚賴氨酸作為防腐劑在食品中添加使用。此外，ε-聚賴氨酸衍生物在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、電子等領(lǐng)域也有著廣泛應(yīng)用[7]。PDAP作為Streptomycealbulus生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的副產(chǎn)物，對(duì)于Streptomycealbulus代謝途徑解析以及聚氨基酸聯(lián)產(chǎn)研究具有重要的研究?jī)r(jià)值。本文應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室常用的離子交換層析和反向色譜純化技術(shù)，以預(yù)處理的StreptomycealbulusPD-1的發(fā)酵液為研究對(duì)象，探索PDAP的分離純化工藝。

圖1 聚二氨基丙酸結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of poly (L-diaminopropionic acid)

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

離子交換層析柱填料DEAE-Sepharose Fast Flow、分子篩Sephadex G-25，GE Healthcare公司；SinoChrom ODS-BP反向色譜柱(20 mm×150 mm，10 μm)，大連依利特公司；AKTA FPLC蛋白純化儀，Amersham Bioscience公司；K2HPO4、KH2PO4、甲醇、三氟乙酸及磷酸(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1StreptomycealbulusPD-1的發(fā)酵液的預(yù)處理

取StreptomycealbulusPD-1的發(fā)酵液，過濾除去菌體，濾液中加入V(甲醇)/V(丙酮)=3的混合有機(jī)溶劑至飽和度0～40%，形成沉淀，沉淀用去離子水復(fù)溶，然后超濾得到預(yù)處理的發(fā)酵液。

1.2.2 離子交換層析

將填料DEAE-Sepharose Fast Flow裝入柱中，用1 mol/L NaOH沖洗1～2 h，流速40 cm/h，然后用去離子水洗滌至pH近中性，再用2～4個(gè)柱體積的70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇沖洗1～2 h，去離子水洗滌至pH近中性。

取預(yù)處理的發(fā)酵液，以50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液平衡上樣，pH分別6.5、7.5和8.5，含0.5 mol/L NaCl的K2HPO4-KH2PO4緩沖液作為洗脫液，流速2.0 mL/min，洗脫液經(jīng)紫外檢測(cè)儀，檢測(cè)波長215 nm，選擇分離效果最好的pH為7.5的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相，根據(jù)檢測(cè)峰收集樣品。

收集的含有PDAP的洗脫液經(jīng)過減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以去離子水為流動(dòng)相，上樣分子篩Sephadex G-25，流速4 mL/min，洗脫液經(jīng)紫外檢測(cè)后收集，檢測(cè)波長215 nm。

1.2.3 C18反向色譜

收集分子篩純化后的洗脫液，加入C18反向色譜柱中，分別以V(甲醇)/V(水)=5/95、V(甲醇)/V(水)=15/85、V(甲醇)/V(0.1%三氟乙酸)=5/95和V(甲醇)/V(0.1%磷酸)=5/95做流動(dòng)相，選擇分離效果最好的V(甲醇)/V(0.1%磷酸)=5/95作為流動(dòng)相，流速4 mL/min，洗脫液經(jīng)紫外檢測(cè)儀，檢測(cè)波長215 nm，根據(jù)檢測(cè)峰收集樣品。

1.3 檢測(cè)方法

PDAP的檢測(cè)采用高效液相色譜(HPLC)法[7]，色譜柱：TSKgel ODS-120T色譜柱(4.6 mm×250 mm，日本 TOSOH公司)，流速 0.4 mL/min，紫外檢測(cè)波長為215 nm。用V(0.05%三氟乙酸)/V(乙腈)為95/5的溶液作為初始流動(dòng)相平衡色譜柱。洗脫分為兩階段，在第一階段，進(jìn)樣后以初始流動(dòng)相洗脫，持續(xù)10 min后進(jìn)入第二階段洗脫，V(0.05%三氟乙酸)/V(乙腈)的比值，在5 min內(nèi)由初始的95/5，線性梯度上升至85/15。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子交換層析結(jié)果

在DEAE-Sepharose Fast Flow型離子交換層析純化PDAP的過程中，用不同pH的磷酸鹽緩沖液洗上樣洗脫，選擇分離效果較好的pH 7.5磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相，收集含有目的組分的洗脫液后，用分子篩Sephadex G-25做進(jìn)一步純化，以除去離子交換層析中引入的小相對(duì)分子質(zhì)量的磷酸鹽，純化圖譜如圖2所示。

以pH分別為6.5、7.5和8.5的磷酸鹽緩沖液上樣預(yù)處理后的發(fā)酵液，PDAP均在穿透峰里被檢測(cè)到，提高洗脫液的比例后，陸續(xù)有其他雜質(zhì)峰被洗脫下來。由于PDAP是由堿性氨基酸聚合而成，其等電點(diǎn)高于緩沖鹽最高pH 8.5，在3種pH的條件下PDAP帶正電，而DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換填料屬于弱陰型，該填料的正電基團(tuán)與PDAP不能吸附結(jié)合，因此PDAP存在于穿透峰中。

用HPLC法分別檢測(cè)pH為6.5、7.5和8.5條件下收集的含有PDAP的洗脫液，結(jié)果顯示pH 7.5的條件下收集液中雜質(zhì)較少些，從圖2可以看出，pH 7.5的條件下穿透液中PDAP與其他雜質(zhì)的分離度較好，提高離子強(qiáng)度洗脫后除去的雜質(zhì)比較多一些，因此選擇pH 7.5的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行純化?？紤]到使用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相，收集的純化液中也含有這些磷酸鹽，需要除去，聚二氨基丙酸相對(duì)分子質(zhì)量與磷酸鹽相差較大，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量差異性，用分子篩Sephadex G-25除去磷酸鹽(圖2(d))。

圖2 DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換層析和分子篩Sephadex G-25純化聚二氨基丙酸的洗脫曲線Fig.2 Elution curves of PDAP purification by DEAE-Sepharose Fast Flow and Sephadex G-25

2.2 C18反向色譜純化結(jié)果

用C18反向色譜純化離子交換層析處理后的發(fā)酵液，首先使用V(甲醇)/V(水)=5/95、V(甲醇)/V(水)=15/85的流動(dòng)相，純化圖譜如圖3所示，分別收集洗脫峰1、2、3和4進(jìn)行HPLC檢測(cè)，如圖4所示。

從圖4可以看出，使用甲醇/水作為流動(dòng)相，分離效果并不好，收集的洗脫峰中除了PDAP以外均含有雜質(zhì)。值得注意的是，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，保留時(shí)間10 min以后的雜質(zhì)被除去了，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)上升至15%，保留時(shí)間10 min以后雜質(zhì)又出現(xiàn)了。由此得出結(jié)論：上樣前的料液中，PDAP的疏水性明顯弱于其他雜質(zhì)，因此，要想除去這些雜質(zhì)，首先應(yīng)該保證流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)不超過5%，使疏水性較強(qiáng)的雜質(zhì)與色譜柱填料相結(jié)合，后期可以通過提高流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)將其洗脫除去。同時(shí)，嘗試在流動(dòng)相水相成分中加入三氟乙酸或者磷酸，以改善分離效果，結(jié)果見圖5。

圖3 C18反向色譜純化聚二氨基丙酸的洗脫曲線Fig.3 Elution curves of PDAP purification by C18 reversed-phase chromatography

圖4 高效液相色譜檢測(cè)圖3中C18反向色譜洗脫峰Fig.4 HPLC detection of C18 reversed-phase chromatography elution peaks in figure 3

圖5 加入三氟乙酸或磷酸后C18反向色譜純化聚二氨基丙酸的洗脫曲線Fig.5 Elution curves of PDAP purification by C18 reversed-phase chromatography with trifluoroaceticacid and phosphoric acid

由圖5可以看出:使用V(甲醇)/V(0.1%三氟乙酸)=5/95的流動(dòng)相，分離效果沒有得到明顯改善，有拖尾現(xiàn)象，而使用V(甲醇)/V(0.1% H3PO4)=5/95的流動(dòng)相時(shí)，分離效果得到明顯改善，收集箭頭所指的洗脫峰進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果洗脫峰內(nèi)收集到的是PDAP純品，沒有其他雜質(zhì)，表明使用該流動(dòng)相，可以達(dá)到分離純化聚二氨基丙酸的目的，收集的洗脫液經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以除去洗脫液中的少量甲醇，然后透析處理除去洗脫液中的少量磷酸后進(jìn)行冷凍干燥。將得到的固體進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，表征圖譜如圖6所示。由圖6可知：質(zhì)譜、核磁共振碳譜和紅外圖譜表明純化得到的PDAP結(jié)構(gòu)與圖1相符，由于聚合度分布在6～17之間，PDAP相對(duì)分子質(zhì)量分布在500～1 500之間，各純化步驟的收率和樣品純度如表1所示，純化后的PDAP樣品純度達(dá)98.4%。

圖6 聚二氨基丙酸純品表征圖譜Fig.6 Characterization spectra of PDAP purified sample

分離步驟得率/%純度/%離子交換層析724582分子篩592667反向色譜398984

3 結(jié) 論

采用離子交換層析結(jié)合C18反向色譜技術(shù)，對(duì)菌株StreptomycealbulusPD-1發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，獲得PDAP純品，純化的回收率為39.8%，PDAP樣品純度達(dá)98.4%。離子交換層析柱選用DEAE-Sepharose Fast Flow填料，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)平衡上樣，含0.5 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)洗脫，洗脫液用分子篩Sephadex G-25除去磷酸鹽緩沖液，然后用C18反相色譜進(jìn)一步純化，流動(dòng)相為V(甲醇)/V(0.1% H3PO4)=5/95。PDAP是聚陽離子物質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量分布在500～1 500之間，親水性較強(qiáng)。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Purification of poly (L-diaminopropionic acid) by ion-exchange andreversed-phase chromatography

XIA Jun,XU Zhaoxian,BO Fangfang,FENG Xiaohai,CHI Bo,XU Hong

(College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Theε-polylysine producing strainStreptomycesalbulusPD-1 could synthesize a novel non-proteinic amino acid oligomer:poly(L-diaminopropionic acid) (PDAP).Ion-exchange and reversed-phase chromatography were used to study the purification conditions of PDAP.In the ion-exchange chromatography purification,DEAE-Sepharose Fast Flow was selected,50 mmol/L phosphate buffer was used as mobile phase and 0.5 mol/L NaCl in the phosphate buffer acted as elution.In the reversed-phase chromatography purification,ratio of methanol to 0.1% phosphoric acid was 5/95 (V/V) and was used as the mobile phase.Pure PDAP sample was obtained by ion-exchange and reversed-phase chromatography,the recovery rate of the purification was 39.8%,and the purity of the sample was 98.4%.

poly(L-diaminopropionic acid); purification; ion-exchange chromatography; reversed-phase chromatography

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.011

2013-06-26

國家自然科學(xué)基金(21176123、21006050)；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2013CB733600)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20113221130001)；長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT1066)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃(CXZZ13_0464)

夏 軍(1986—)，男，江蘇句容人，博士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；徐 虹(聯(lián)系人)，教授，E-mail:xuh@njtech.edu.cn

TQ028.8

A

1672-3678(2014)06-0057-05