氯過(guò)氧化物酶發(fā)酵相關(guān)指標(biāo)及其關(guān)聯(lián)性分析

李梅梅，戴佳偉，李新國(guó)，陳 軍，吳霞琴

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234)

氯過(guò)氧化物酶發(fā)酵相關(guān)指標(biāo)及其關(guān)聯(lián)性分析

李梅梅，戴佳偉，李新國(guó)，陳 軍，吳霞琴

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234)

通過(guò)考察氯過(guò)氧化物酶(CPO)發(fā)酵相關(guān)參數(shù)的動(dòng)力學(xué)特征，探究酶產(chǎn)量與參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明：CPO發(fā)酵過(guò)程中慢速C源麥芽糖比葡萄糖更有利于調(diào)控CPO的穩(wěn)定合成，前者CPO最高比酶活(179.50 U/mL)比后者(135 U/mL)高出44.5 U/mL，而且產(chǎn)酶高峰期延遲1～2 d；發(fā)酵過(guò)程pH波動(dòng)與C源消耗速率密切相關(guān)，且對(duì)CPO合成具有明顯的指標(biāo)性作用。通過(guò)生物量曲線及糖消耗曲線與產(chǎn)酶特征對(duì)比判斷，菌株合成CPO為中期合成類(lèi)型。副產(chǎn)物黑色素是菌體成熟時(shí)期的一種次生代謝物質(zhì)，與酶的生物合成存在時(shí)間上的同步性。控制C源基質(zhì)和pH對(duì)提高CPO穩(wěn)定化生產(chǎn)具有一定成效。

Leptoxyphiumfumago；氯過(guò)氧化物酶；發(fā)酵；關(guān)聯(lián)性分析

氯過(guò)氧化物酶(chloroperoxidase,EC 1.11.1.10，CPO)是一種十分有應(yīng)用前景的“手性生物催化劑”[1-2]。作為一種過(guò)氧化物酶，由于其輔基是高鐵(IX)原卟啉，因而使它不僅具備類(lèi)似過(guò)氧化氫酶的結(jié)合位點(diǎn)，而且有與細(xì)胞色素P-450高度相似的光譜學(xué)和化學(xué)性質(zhì)，可以催化鹵素離子、芳香族化合物、脂肪族化合物和醇類(lèi)化合物等多種物質(zhì)進(jìn)行過(guò)氧化反應(yīng)[3-5]。目前，CPO已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種手性物質(zhì)的合成生產(chǎn)，可減少反應(yīng)過(guò)程中手性異構(gòu)體的損失，去除藥物手性對(duì)映體的毒性，減輕廢棄物對(duì)環(huán)境的污染[6-7]。

CPO主要來(lái)源于微生物的發(fā)酵生產(chǎn)，海洋真菌Caldariomycesfumago是最早用于CPO發(fā)酵的菌種[8-12]。但是，CPO發(fā)酵過(guò)程中酶產(chǎn)量波動(dòng)幅度大、濃度積累低(一般小于100 mg/L)、酶活性穩(wěn)定性差、色素等副產(chǎn)物多，是造成CPO生產(chǎn)成本居高不下的主要原因，嚴(yán)重限制了CPO的開(kāi)發(fā)與使用[13-15]。影響CPO生產(chǎn)穩(wěn)定的因素很多，其中主要發(fā)酵參數(shù)之間的協(xié)同變化對(duì)產(chǎn)酶穩(wěn)定性具有顯著的影響，而現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)CPO發(fā)酵產(chǎn)量與參數(shù)的相關(guān)性研究并不多見(jiàn)[16-17]。筆者在孫凌燕[18]工作的基礎(chǔ)上通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察CPO發(fā)酵相關(guān)指標(biāo)變化特征，分析其中的關(guān)聯(lián)性，探討CPO的穩(wěn)定化生產(chǎn)的條件。

1 材料與方法

1.1 菌種

Leptoxyphiumfuming，購(gòu)自英國(guó)CABI Europe-UK。

1.2 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基[19]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L(或麥芽糖20 g/L)，(NH4)2SO41.5 g/L，NaNO32 g/L，酵母粉 7 g/L，馬鈴薯浸出液150 mL/L，KCl 2.2 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 6.0。0.1 MPa滅菌30 min。裝液量為250 mL三角瓶中裝液50 mL。

馬鈴薯浸出液制備：去皮馬鈴薯100 g，加水至500 mL，煮沸15 min，紗布過(guò)濾取清液。

1.3 主要試劑

MCD-磷酸鉀緩沖溶液：1,1-二甲基-4-氯3,5-環(huán)己二酮(MCD)0.1 mmol/L，溶于含有20 mmol/L KCl的0.1 mol/L的K3PO4緩沖溶液中。

過(guò)氧化氫溶液：10 mmol/L，每周配制新鮮溶液并在4 ℃保存于棕色瓶中。

3，5-二硝基水楊酸(DNS)試劑：將6.3 g DNS和262 mL 2 mol/L NaOH溶液，加到500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g結(jié)晶酚和5 g Na2SO3，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中備用。

1.4 主要設(shè)備

SHpH系列6通道補(bǔ)料搖床，上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司；UV6280型掃描式紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用設(shè)備有限公司；TGL-16G型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司；PVDF型超濾膜過(guò)濾器，坎普爾設(shè)備有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 發(fā)酵基礎(chǔ)條件

接種量為2 cm2菌苔/瓶，培養(yǎng)溫度為25 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速240 r/min。

1.5.2 糖測(cè)定方法

葡萄糖和麥芽糖均用DNS法[9]測(cè)定。

1.5.3 酸度測(cè)定

酸度測(cè)定采用中和滴定法[19]。

1.5.4 菌絲生物量測(cè)定

菌絲生物量測(cè)定采用干質(zhì)量法[19]。

1.5.5 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[19]。

1.5.6 CPO的酶濃度測(cè)定

酶活力是以MCD在被轉(zhuǎn)化成1,1-二甲基-4,4-二氯-3,5-環(huán)己二酮時(shí)在278 nm處吸光度的減少來(lái)確定的[8]。酶活力單位定義：在特定實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘催化生成1 μmol 1,1-二甲基-4,4-二氯-3,5-環(huán)己二酮所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖消耗速率與CPO產(chǎn)量的關(guān)聯(lián)性

分別以麥芽糖和葡萄糖為C源，動(dòng)態(tài)跟蹤了C源在發(fā)酵過(guò)程中的變化與產(chǎn)酶特征關(guān)系，對(duì)比結(jié)果如圖1所示。

圖1 麥芽糖和葡萄糖產(chǎn)酶特征曲線Fig.1 Curves of enzyme production in maltose and glucose

由圖1可見(jiàn)：菌體在高濃度C源時(shí)期CPO并不合成，當(dāng)C源濃度下降到10 mg/mL以下時(shí)才開(kāi)始產(chǎn)酶；CPO發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖利用速率比麥芽糖快，但麥芽糖可以使酶濃度增加速度更快更穩(wěn)定，最高酶產(chǎn)量可到達(dá)179.50 U/mL，比葡萄糖的高峰值135 U/mL高出了30%左右，而且產(chǎn)酶高峰期延長(zhǎng)1～2 d。雖然發(fā)酵后期酶濃度都呈下降趨勢(shì)，但麥芽糖的波動(dòng)稍小些。這可能是因?yàn)?種糖在細(xì)胞體內(nèi)的產(chǎn)能反應(yīng)速率不同，麥芽糖利用速率較慢，更有利于調(diào)控CPO穩(wěn)定合成。雖然葡萄糖是CPO發(fā)酵普遍采用的C源，但高濃度葡萄糖易對(duì)菌體合成CPO產(chǎn)生分解代謝阻遏效應(yīng)，阻止酶的合成。Axley等[20]認(rèn)為葡萄糖會(huì)抑制CPO酶的mRNA的產(chǎn)生和蛋白質(zhì)的翻譯，從而延緩CPO合成，而麥芽糖的產(chǎn)能速率相對(duì)慢些，從而在一定程度上緩和了這種阻遏作用。

2.2 發(fā)酵過(guò)程pH變化對(duì)酶合成量的影響

pH變化是基質(zhì)利用和菌體代謝共同作用的結(jié)果。以麥芽糖為C源考察發(fā)酵過(guò)程pH的變化與CPO濃度的關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH與CPO合成的關(guān)系Fig.2 The relationship between pH and CPO synthesis

由圖2可以發(fā)現(xiàn)：pH在開(kāi)始4 d內(nèi)呈持續(xù)下降趨勢(shì)，從初始pH 6下降接近3后可以穩(wěn)定2～3 d，此后開(kāi)始上升，與此同時(shí)，酶的快速合成現(xiàn)象開(kāi)始出現(xiàn)，直到pH再回升到6時(shí)，酶濃度開(kāi)始出現(xiàn)拐點(diǎn)，由上升到下降。對(duì)照?qǐng)D1可以發(fā)現(xiàn)，pH上升期與C源消耗密切相關(guān)聯(lián)，酶產(chǎn)量的下降與C源基質(zhì)的耗盡以及酶活性的穩(wěn)定有一定相關(guān)性。這說(shuō)明當(dāng)糖充足時(shí)，酸性代謝物質(zhì)積累使pH不斷下降，當(dāng)糖消耗到不阻遏酶合成時(shí)，CPO快速合成，由于此階段(第6天開(kāi)始)發(fā)酵液中殘?zhí)橇枯^低，使得菌體開(kāi)始利用前期積累的酸性代謝物質(zhì)，造成發(fā)酵液的pH反彈，pH上升到6時(shí)，殘?zhí)呛退嵝源x物質(zhì)都被消耗完了，酶濃度上升趨緩，產(chǎn)酶期接近結(jié)束，由于酶活性的不穩(wěn)定，就造成了表觀酶濃度下降。

2.3 菌絲生物量合成與產(chǎn)酶的同步性分析

生物量能夠反映出菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)和生理狀態(tài)，對(duì)判斷產(chǎn)酶的特征具有一定的指示作用。測(cè)試發(fā)酵過(guò)程中菌絲生物量形成與產(chǎn)酶量的變化，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中菌絲生物量與產(chǎn)酶量的變化Fig.3 The changes of mycelia biomass and enzyme production in fermentation

從圖3可以明顯發(fā)現(xiàn)，菌絲體質(zhì)量增加與酶濃度的變化是不完全同步的，菌絲體生長(zhǎng)早于酶濃度增長(zhǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)第6天時(shí)，生長(zhǎng)速率出現(xiàn)拐點(diǎn)，速率趨慢，而此時(shí)酶合成速率加快。對(duì)照?qǐng)D1，此時(shí)培養(yǎng)基中殘?zhí)琴|(zhì)量濃度只有26.93 mg/mL，說(shuō)明在維持較低基質(zhì)濃度水平下就能保持很好的CPO的合成速率。從發(fā)酵第10天開(kāi)始，CPO產(chǎn)量明顯下降可能是酶不合成和酶失活雙重因素造成的。

綜上說(shuō)明，CPO合成不僅在發(fā)酵早期受阻遏，而且在后期受抑制，體現(xiàn)出較為典型的中期合成型特征，這對(duì)如何提高菌株產(chǎn)酶提供了重要依據(jù)。

2.4 黑色素形成對(duì)CPO合成的影響

在CPO發(fā)酵過(guò)程中一般都會(huì)伴隨著黑色素的形成，黑色素的形成與產(chǎn)酶是否存在關(guān)聯(lián)性，Pickard等[13]研究了10株產(chǎn)CPO菌株，認(rèn)為黑色素的形成會(huì)影響CPO合成能力。筆者試圖驗(yàn)證這一產(chǎn)酶的特征，結(jié)果如圖4所示。

圖4 黑色素的產(chǎn)生對(duì)酶產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of melanin on enzyme production

由圖4可見(jiàn)：菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)第3天后會(huì)產(chǎn)生黑色素，色素產(chǎn)生的時(shí)間與菌體產(chǎn)酶幾乎是同時(shí)發(fā)生，這不僅可能會(huì)影響酶的合成產(chǎn)量，降低酶的轉(zhuǎn)化率，而且還會(huì)使酶的分離純化變得復(fù)雜。隨著色素不斷增多，發(fā)酵液透光度不斷下降，發(fā)酵液pH和酶產(chǎn)量也開(kāi)始快速增大，說(shuō)明黑色素的形成與CPO合成存在伴生現(xiàn)象，但兩者形成的速率并不一致?？梢酝茰y(cè)黑色素物質(zhì)可能是菌體成熟時(shí)期的一種次生代謝物質(zhì)，與酶的生物合成只是時(shí)間上的同步。

2.5 補(bǔ)料發(fā)酵對(duì)CPO生產(chǎn)穩(wěn)定化的影響

上述實(shí)驗(yàn)確定了Leptoxyphiumfuming菌株產(chǎn)CPO是中間合成產(chǎn)酶類(lèi)型，針對(duì)這種代謝調(diào)控類(lèi)型提出穩(wěn)定CPO發(fā)酵的措施，通過(guò)間隙補(bǔ)料麥芽糖，流加稀H3PO4調(diào)節(jié)pH恒定在5.5～6.0，考察CPO的發(fā)酵狀況，結(jié)果如圖5所示。

圖5 補(bǔ)料發(fā)酵狀態(tài)下的產(chǎn)酶發(fā)酵Fig.5 The curve of fermentation condition in fed-batch fermentation

將圖5與圖1～圖4比較可以發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)料發(fā)酵可以增加發(fā)酵液中的菌體生物量，最高菌體濃度可以達(dá)到8.560 mg/mL，比非補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)的7.517 mg/mL增加了約20%；CPO比酶活最高為222.6 U/mL，比非補(bǔ)料培養(yǎng)時(shí)的185.456 U/mL也增加了約20%，而且在發(fā)酵后期，CPO下降速度有明顯的減緩。說(shuō)明控制C源基質(zhì)濃度和pH能提高菌體生物量，增加CPO的合成能力，對(duì)CPO的活力衰減速度有一定的緩和作用，但不能完全防止酶活力損失。

3 結(jié) 論

探究了關(guān)聯(lián)發(fā)酵狀態(tài)的幾組重要參數(shù)變化特征，分析過(guò)程變化與發(fā)酵產(chǎn)酶的相關(guān)性，明確CPO發(fā)酵過(guò)程中慢速C源麥芽糖更有利于調(diào)控菌體的CPO穩(wěn)定合成。過(guò)程pH波動(dòng)與C源消耗密切相關(guān)，對(duì)產(chǎn)酶期有明顯的指示性作用。將生物量及耗糖曲線與產(chǎn)酶特征比較，認(rèn)為該菌株產(chǎn)CPO為中期合成類(lèi)型。同時(shí)，筆者認(rèn)為黑色素物質(zhì)的形成可能是菌體合成的一種次生代謝物質(zhì)，與酶的生物合成只是時(shí)間上的同步?；趲捉M參數(shù)對(duì)CPO合成特征的影響實(shí)驗(yàn)，改進(jìn)了發(fā)酵C源基質(zhì)和pH的調(diào)控方法，明顯提高了CPO產(chǎn)量和穩(wěn)定化程度。此論可以為氯過(guò)氧化物酶的高效率生產(chǎn)提供參考。

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(責(zé)任編輯 管 珺)

Correlation of fermentation parameters in chloroperoxidase production

LI Meimei,DAI Jiawei,LI Xinguo,CHEN Jun,WU Xiaqin

(College of Life and Environment Science,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

We correlated fermentation parameters of chloroperoxidase (CPO) fermentation to study the relationship between enzyme yield and the parameters.The experimental results show that maltose,a slow carbon source,is more conducive to control CPO synthesis than glucose in the CPO fermentation process. CPO concentrations reach 179.50 U/mL,when maltose is used,higher than that of glucose (135 U/mL). The fluctuation of pH is closely related to carbon consumption.Based on the pattern of growth,glucose consumption and enzymatic production,CPO synthesis is parallel to growth.The black pigment is a by-product in the secondary metabolism, indicating of the maturation period of the cell,and it is parallel to enzyme synthesis.Carbon source matrix and pH in fermentation have effect on CPO production.

Leptoxyphiumfumago; chloroperoxidase;fermentation;connectional analytical

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.005

2013-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(50678102,50978164);上海師范大學(xué)科技基金(SK201228)

李梅梅(1990—)，女，江蘇鹽城人，碩士研究生，研究方向：微生物分子生物學(xué); 陳 軍(聯(lián)系人)，副教授，E-mail:cj7206@shnu.edu.cn

Q814.4

A

1672-3678(2014)06-0023-04