白酒丟糟的多酶復(fù)配降解制備可發(fā)酵性糖

劉躍紅,吳正云,楊 健,吳艷萍,袁玉菊,張文學(xué)，2

(1.四川大學(xué)食品工程系，成都610065； 2.四川大學(xué)錦江學(xué)院白酒學(xué)院，眉山620860)

白酒丟糟的多酶復(fù)配降解制備可發(fā)酵性糖

劉躍紅1,吳正云1,楊 健1,吳艷萍1,袁玉菊1,張文學(xué)1，2

(1.四川大學(xué)食品工程系，成都610065； 2.四川大學(xué)錦江學(xué)院白酒學(xué)院，眉山620860)

為有效利用纖維質(zhì)原料制備可發(fā)酵性糖生產(chǎn)燃料酒精，通過NaOH-過氧乙酸預(yù)處理白酒丟糟，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%NaOH和體積分?jǐn)?shù)6%過氧乙酸處理后，白酒丟糟中木質(zhì)素去除率達(dá)66.13%～77.02%，總纖維素回收率78.04%～90.73%。對處理后的白酒丟糟進(jìn)行多酶復(fù)配糖化降解，通過均勻設(shè)計實(shí)驗(yàn)確定白酒丟糟酶降解的數(shù)學(xué)模型，得出總糖降解率與各酶添加量之間的回歸關(guān)系，在最優(yōu)條件下白酒丟糟降解率為(0.432 8±0.013 5) g/g。

NaOH-過氧乙酸；白酒丟糟；多酶復(fù)配；均勻設(shè)計

白酒生產(chǎn)過程中最主要副產(chǎn)物之一的白酒丟糟不及時處理，會腐敗變質(zhì)，不僅浪費(fèi)資源，而且嚴(yán)重污染環(huán)境[1]。白酒丟糟的主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[2]， Zhao等[3-4]用NaOH-過氧乙酸處理，再用纖維素酶等相關(guān)酶系糖化，得到較好的降解效果。Charles等[5]研究發(fā)現(xiàn)纖維素經(jīng)氨水處理后會產(chǎn)生膨脹現(xiàn)象，造成原料的結(jié)晶度降低，從而顯著提高纖維素和半纖維素的反應(yīng)活性，便于酶水解的進(jìn)行。Zhang等[6]認(rèn)為堿處理對連接半纖維素和其他組分分子間的酯鍵起到皂化作用，膨脹纖維素，脫除木質(zhì)素，提高酶解糖化率；趙雪冰等[7]、Teixeira等[8]利用過氧乙酸的強(qiáng)氧化性和良好的脫木質(zhì)素和漂白能力的特點(diǎn)，通過過氧乙酸與木質(zhì)素進(jìn)行羥基化反應(yīng)等有效地脫除了木質(zhì)素類大分子。

目前，國內(nèi)外對纖維質(zhì)原料生產(chǎn)燃料酒精的研究主要集中在不同預(yù)處理方法對單酶糖化效果的影響上，Tabka等[9]、Kataria等[10]、Rabelo等[11]也對多酶復(fù)配做了一定的研究，但是對多酶復(fù)合糖化降解運(yùn)用于白酒丟糟的研究報道較少。本文中筆者研究NaOH-過氧乙酸預(yù)處理白酒丟糟，用4種不同的酶復(fù)配糖化降解白酒丟糟，以期得到較好的糖化效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白酒鮮丟糟由四川水井坊股份有限公司提供，含水率65%左右，冷凍保存，使用前置于70 ℃烘箱干燥至恒質(zhì)量，烘干后總纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(51.24±1.7)%，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(18.62±2.1)%；過氧乙酸體積分?jǐn)?shù)16%，使用前需滴定濃度[12]，購于長征試劑公司；葡萄糖試劑盒，購于長春匯力生物技術(shù)有限公司；纖維素酶NS22086(FPU比酶活為25.47 IU/mL)、β-葡萄糖苷酶NS22118(比酶活為15.12 IU/mL)、木聚糖酶NS22083(比酶活為17.08 IU/mL)、復(fù)合酶NS22119(其中主要的β-葡萄糖苷酶比酶活為6.77 IU/mL)，購于諾維信天津分公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-1100型紫外分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；HZO-X100型氣浴搖床，太倉市豪誠實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；LX-400型管式離心機(jī)，深圳市賽亞泰科儀器設(shè)備有限公司；HWS28型電熱恒溫水浴鍋，DHG-905A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；100～1 000 μL百得移液槍，上海摩億科貿(mào)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)流程

白酒丟糟預(yù)處理后多酶糖化降解工藝流程如圖1所示。工藝流程中，白酒丟糟干燥均為70 ℃恒溫至恒質(zhì)量。

圖1 白酒丟糟降解工藝流程Fig.1 Flow chart of distillers′ grains degradation experiment

1)鮮丟糟干燥與檢測。從酒廠提取白酒鮮丟糟置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，70 ℃恒溫至恒質(zhì)量得干糟，并測定其指標(biāo)。2)預(yù)處理Ⅰ用2%NaOH溶液按固液比1∶ 10(g/mL)添加白酒干丟糟，在85 ℃水浴恒溫槽中處理1.5 h。3)預(yù)處理Ⅱ用6%過氧乙酸按固液比1∶ 5(g/mL)添加白酒干丟糟，在60 ℃水浴恒溫槽中處理5 h。4)酶降解用pH 4.8～5.0的檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)白酒丟糟百分比，于50 ℃、150 r/min的氣浴搖床處理48 h。

1.3.2 成分分析

白酒丟糟中纖維素和半纖維素含量分析參照文獻(xiàn)[13]，酶解液中總糖、葡萄糖及木糖含量的測定方法分別采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)法[14]、葡萄糖試劑盒法和間苯三酚法測定[15]。酶解液中總糖、葡萄糖及木糖得率計算見式(1)：

(1)

式中：Y為酶解液中總糖、葡萄糖或木糖產(chǎn)率,mg/g；0.9為修正系數(shù)；m為酶解液中還原糖、葡萄糖或木糖質(zhì)量，g；m′為白酒丟糟預(yù)處理后干質(zhì)量，g；2次平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值。

1.3.3 木質(zhì)素的測定

按照國標(biāo)GB/T2677.8—1994測定白酒丟糟中木質(zhì)素的含量。

(2)

式中：R為木質(zhì)素去除率,%；m0為白酒丟糟處理前木質(zhì)素質(zhì)量,g；m1為白酒丟糟處理后木質(zhì)素質(zhì)量,g。

1.3.4 總纖維素的測定

按照國標(biāo)GB/T2677.10—1995測定白酒丟糟中總纖維素的含量。

(3)

式中：Z為總纖維素回收率,%；m3為白酒丟糟處理前總纖維質(zhì)量,g；m4為白酒丟糟處理后總纖維質(zhì)量,g。

1.3.5 樣品酶降解

白酒丟糟經(jīng)預(yù)處理后用pH 4.8～5.0的檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)底物濃度，添加2%疊氮化鈉1 mL，同時添加纖維素酶NS22086、β-葡萄糖苷酶NS22118、木聚糖酶22083和復(fù)合酶22119，于50 ℃、150 r/min的氣浴搖床糖化降解48 h，離心得上清液[16-17]。將上清液稀釋一定倍數(shù)后，測定酶解液中總糖、葡萄糖和木糖濃度及產(chǎn)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 NaOH-過氧乙酸處理白酒丟糟

根據(jù)文獻(xiàn)[18]，稱取100 g白酒干丟糟于1 000 mL燒杯中，按照圖1所示工藝條件進(jìn)行白酒丟糟預(yù)處理，該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，處理后白酒丟糟中總纖維素回收率和木質(zhì)素去除率如表1所示。由表1可知：總纖維素回收率為78.04%～90.73%，木質(zhì)素去除率為66.13%～77.02%。

表1 白酒丟糟預(yù)處理前后組分變化

注：a—文獻(xiàn)[19]的數(shù)據(jù)； b—木質(zhì)素去除率=100%-回收率。

2.2 預(yù)處理后白酒丟糟酶降解

2.2.1 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計

通過比較前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[18]及查閱相關(guān)文獻(xiàn)[20]，總結(jié)5個影響白酒丟糟復(fù)合酶糖化降解的因素X1、X2、X3、X4、X5。①X1：白酒丟糟百分比(g/100 mL)；②X2：纖維素酶NS211086體積(mL)；③X3：β-葡萄糖苷酶NS22118體積(mL)；④X4：木聚糖酶NS22083體積(mL)；⑤X5：復(fù)合酶NS22119體積(mL)。以總糖降解率為考察指標(biāo)，用DPS(date processing system)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[21]設(shè)計 U8(85)均勻設(shè)計表，設(shè)計方案結(jié)果見表2。根據(jù)表2實(shí)驗(yàn)方案，分別在4、11、23、33、48 h測定酶解液中的總糖、葡萄糖和木糖濃度。結(jié)果如圖2～圖4所示。

表2 U8(85)均勻設(shè)計方案

由圖2～圖4可以看出：酶解液中糖濃度隨著酶解時間的延長而增加。在開始4 h內(nèi)，酶解速率較高，隨后酶解液中葡萄糖濃度逐漸增大，葡萄糖濃度的升高會延緩酶降解速率，在11～23 h內(nèi)酶解速率降低，糖濃度增加緩慢；當(dāng)33 h時，酶解液中糖濃度達(dá)到最高，之后糖濃度不再增加或增加很少，主要是因?yàn)槿芤褐衅咸烟菨舛鹊脑龃笥绊懥嗣傅幕钚?，使得酶解速率降低直至停止。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，用復(fù)配酶處理白酒丟糟33 h，對各酶添加量進(jìn)行均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計優(yōu)化，總糖降解率見表2。由表2可以得出，總糖降解率最高為0.4 g/g，為第3組實(shí)驗(yàn)，該組實(shí)驗(yàn)中，底物濃度和纖維素酶NS22086為主要影響總糖降解率的因素。

圖2 酶解液中總糖濃度隨時間的變化Fig.2 Changes of total sugar over time in the enzyme solution

圖3 酶解液中葡萄糖濃度隨時間的變化Fig.3 Changes of glucose over time in the enzyme solution

圖4 酶解液中木糖濃度隨時間變化Fig.4 Changes of xylose over time in the enzyme solution

2.2.2 回歸方程的建立和分析

通過均勻設(shè)計和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析，根據(jù)各因素對酶降解白酒丟糟總糖降解率的影響顯著程度進(jìn)行多元二次回歸，所得多元二次回歸方程：

復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.998 6，F(xiàn)值為58.125 8，顯著水平P值為0.007 8，剩余標(biāo)準(zhǔn)差為0.009 5，復(fù)相關(guān)系數(shù)R和F值越大。剩余標(biāo)準(zhǔn)差越小，說明數(shù)據(jù)和方程的擬合度越高。從回歸方程可以得出，X2與X5之間存在相互作用，X2、X3和X4對酶解的作用明顯，因?yàn)閄2(纖維素酶NS211086)的主要組分是葡萄糖內(nèi)切酶、葡萄糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。只有當(dāng)這3個主要組分的活性比例適當(dāng)時，才能協(xié)同完成對纖維素的高效降解[22-23]。如果再添加因素3(β-葡萄糖苷酶NS22118)，會顯著提高纖維素酶糖化效率[24]。同時半纖維素被木聚糖酶水解后，可降低物料對纖維素酶的無效吸附，提高單糖產(chǎn)率[25]。根據(jù)回歸方程，由DPS得出最佳復(fù)配酶降解白酒丟糟組合，見表3。

表3 總糖降解率最高時各個因素組合

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的分析及預(yù)測，總糖降解率最高時，白酒丟糟百分比0.12 g/mL，纖維素酶NS211086添加量2.965 5 mL，β-葡萄糖苷酶NS22118添加量1.303 9 mL，木聚糖酶NS22083添加量0.078 4 mL，復(fù)合酶NS22119添加量0.633 1 mL。由回歸方程計算出總糖理論最大得率為0.464 8 g/g，在此實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到總糖的實(shí)際得率為(0.432 8±0.013 5) g/g，低于理論值，但明顯高于前述各實(shí)驗(yàn)條件下得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)值。

3 結(jié) 論

1)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%NaOH溶液和體積分?jǐn)?shù)6%過氧乙酸溶液相結(jié)合的方法對白酒丟糟進(jìn)行預(yù)處理，白酒丟糟中木質(zhì)素去除率達(dá)到66.13%～77.02%，總纖維回收率為78.04%～90.73%左右，木質(zhì)素的脫除有利于下一步酶的糖化降解。

2)對白酒丟糟復(fù)配酶降解首次采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)設(shè)計均勻試驗(yàn)并分析數(shù)據(jù)，通過回歸分析得出影響總糖降解得率的各因素之間存在一定的相互作用。根據(jù)本研究的前期實(shí)驗(yàn)選定主要影響白酒丟糟總糖降解率的因素及各因素的取值范圍，由回歸方程計算出總糖理論最大得率為0.464 8 g/g，經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出總糖實(shí)際得率為(0.432 8±0.013 5) g/g，與理論值接近。

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(責(zé)任編輯 管 珺)

Preparing of fermentable sugars from pretreatment Chinese liquor distillers′ grains by using multi-enzyme hydrolysis

LIU Yuehong1,WU Zhengyun1,YANG Jian1,WU Yanping1,YUAN Yuju1,ZHANG Wenxue1,2

(1.Department of Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China; 2.College of China Spirits,Jinjiang College,Sichuan University,Meishan 620860,China)

We used NaOH-peracetic acid pretreatment of distillers′ waste grains to convert holocellulose to fermentable sugars for bioethanol production.The results show that when the distillers′ grains is pretreated with a mixture of 2% (m/m) NaOH solution and 6% (V/V) peracetic acid solution,66.13% to 77.02% lignin was removed and 78.04%-90.73% cellulose was recovered.The experiment of multienzyme hydrolysis with multiple factors and multiple levels was designed by the date processing system according to U8(85).The mathematic model for total sugars degradation rate was acquired and it showed that under the optimal condition,the total sugars degradation rate was (0.432 8±0.013 5) g/g.

NaOH-peracetic acid；distillers′ grains；multienzyme；uniform design

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.004

2013-08-06

科技部國際合作項目(2009DFA60890)；四川省科技支撐計劃(2013GZX0161)

劉躍紅(1985—)，男，江西南昌人，博士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；張文學(xué)(聯(lián)系人)，教授，E-mail:foodbitech@126.com

TQ261

A

1672-3678(2014)06-0018-05