甲潑尼龍聯(lián)合氨溴索對(duì)急性百草枯中毒家豬肺損傷的影響研究

蘭 超，李海娜，李 莉，王金柱，李 璐，劉蘭萍，狄 敏

百草枯是一種毒性作用很強(qiáng)的除草劑，因誤服等因素造成的百草枯中毒較為常見。人口服致死劑量為20 mg/kg，百草枯的口服吸收率可達(dá)5%～15%，經(jīng)人體吸收后基本不與血漿蛋白結(jié)合，短時(shí)間內(nèi)(通常為2 h)即可達(dá)藥學(xué)峰值[1]。肺臟作為百草枯中毒的主要靶器官，其損害的主要表現(xiàn)為早期的急性肺泡炎、肺水腫，以及后期迅速發(fā)展的肺纖維化[2]。為減輕百草枯中毒引起的肺損傷程度，除了利用導(dǎo)瀉、洗胃、口服吸附劑、血液灌流[3]等臨床手段來減少毒物的吸收外，還可采用激素療法以達(dá)到控制感染的目的。激素對(duì)急性百草枯中毒肺損傷的有效治療作用已通過實(shí)驗(yàn)得到了驗(yàn)證，并獲得了相關(guān)學(xué)者的肯定[4-5]。鹽酸氨溴索是一種臨床常用的黏液溶解劑，近年來有關(guān)鹽酸氨溴索對(duì)肺損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究越來越多，Seifart等[6]和Stetinova等[7]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，氨溴索具有抗氧化及促進(jìn)肺表面活性蛋白生成的作用。本研究旨在通過監(jiān)測(cè)脈搏指示連續(xù)心排血量(PICCO)、氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)及肺表面活性物質(zhì)蛋白-D(SP-D)水平觀察甲潑尼龍聯(lián)合氨溴索對(duì)急性百草枯中毒家豬急性肺損傷(ALI)的治療效果，為急性百草枯中毒肺損傷的診斷及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及藥物 甲潑尼龍(Pfizer,進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20080284)，氨溴索(沈陽(yáng)新馬藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H20050242)，呼吸機(jī)(Servo-s，德國(guó))，氣管插管(6.0 mm)，PICCO導(dǎo)管(4F，PV2014L16，德國(guó))，PICCO2容量監(jiān)測(cè)儀(德國(guó))，心電監(jiān)護(hù)儀(PM-9000，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，血?dú)夥治鰞x(Premier3000，德國(guó))。20%百草枯溶液(美國(guó)Sigma公司)，鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H35020148)，硫酸阿托品注射液(上海禾豐制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H31021172)，丙泊酚注射液(商品名得普利麻，AstraZeneca S.P.A，進(jìn)口藥品注冊(cè)號(hào)H20100648)，順苯磺酸阿曲庫(kù)銨注射液(美國(guó)葛蘭素史克公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)號(hào)H20050516)，枸櫞酸舒芬太尼注射液(宜昌人福藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H20054171)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 健康雌性家豬21只，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，日齡65～70 d，平均體質(zhì)量(25.0±2.1)kg。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。家豬肌肉注射阿托品(0.05 mg/kg)和氯胺酮(15 mg/kg)后仰臥于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，持續(xù)心電監(jiān)護(hù)，建立耳緣靜脈通道輸注乳酸林格液(10 ml·kg-1·h-1)，同時(shí)經(jīng)口氣管插管(6.0 mm)接呼吸機(jī)輔助呼吸。參數(shù)設(shè)置：采用容量控制通氣模式，潮氣量(VT)=12 ml/kg，通氣頻率(RR)=30次/ min，吸氣相和呼氣相比值(I/E)=1∶2，吸入氧濃度(FiO2)為30%，呼氣末正壓(PEEP)設(shè)置為0 cm H2O(1 cm H2O=0.098 kPa)。經(jīng)頸內(nèi)靜脈置入中心靜脈導(dǎo)管，經(jīng)股動(dòng)脈置入PICCO導(dǎo)管，PICCO的具體工作方式見文獻(xiàn)[8-9]。給予每只家豬20%百草枯溶液20 ml腹腔注射，每隔30 min測(cè)定一次動(dòng)脈血?dú)夥治觯敝罰aO2/FiO2≤300 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)并呈進(jìn)行性下降趨勢(shì)，30 min后復(fù)測(cè)血?dú)夥治鋈燥@示PaO2/FiO2≤300 mm Hg，即ALI/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)造模成功[10]。3只家豬在實(shí)驗(yàn)過程中死亡，18只家豬在腹腔注射百草枯溶液后(4.5±0.8)h達(dá)到ALI/ARDS標(biāo)準(zhǔn)。整個(gè)過程中靜脈持續(xù)泵入丙泊酚2.4～2.5 mg·kg-1·h-1和舒芬太尼0.023～0.025 μg·kg-1·h-1，間斷給予順阿曲庫(kù)銨0.08～0.10 mg·kg-1·h-1維持肌松。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 造模成功后將動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表法分為百草枯染毒甲潑尼龍干預(yù)組(A組)，百草枯染毒氨溴索干預(yù)組(B組)，百草枯染毒甲潑尼龍聯(lián)合氨溴索干預(yù)組(C組)，每組6只。A、B兩組家豬分別于頸內(nèi)靜脈輸入甲潑尼龍注射液30 mg/kg、氨溴索35 mg/kg，C組家豬輸入甲潑尼龍注射液30 mg/kg和氨溴索35 mg/kg。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間各組均靜脈給予乳酸林格液(10 ml·kg-1·h-1)，持續(xù)泵入丙泊酚2.4～2.5 mg·kg-1·h-1和舒芬太尼0.023～0.025 μg·kg-1·h-1，間斷給予順阿曲庫(kù)銨0.08～0.10 mg·kg-1·h-1維持肌松。

1.2.3 監(jiān)測(cè)項(xiàng)目 (1)動(dòng)脈血?dú)夥治觯撼槿∷幬镏委熀?2 h(t12)、24 h(t24)及36 h(t36)時(shí)的動(dòng)脈血，并按照血?dú)夥治鰞x說明行血?dú)夥治觯涗浉鲿r(shí)點(diǎn)的動(dòng)脈血pH值、氧分壓(PaO2)及二氧化碳分壓(PaCO2)等指標(biāo)，計(jì)算PaO2/FiO2。(2)PICCO相關(guān)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目：分別于造模前、造模成功(t0)、t12、t24及t36時(shí)各測(cè)定一次PICCO相關(guān)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。具體方法為：頸內(nèi)靜脈導(dǎo)管連接PICCO溫度探頭，股動(dòng)脈導(dǎo)管連接PICCO檢測(cè)儀，每次測(cè)量時(shí)經(jīng)頸內(nèi)靜脈導(dǎo)管快速(<5 s)注入10 ml冰(0～4 ℃)0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)檢測(cè)3次取平均值。記錄血管外肺水指數(shù)(EVLWI)、肺血管通透性指數(shù)(PVPI)、心率(HR)和平均動(dòng)脈壓(MAP)。(3)肺組織病理及SP-D水平檢測(cè)：各組在造模前、t0、t12、t24、t36時(shí)分別用穿刺針取右肺下葉組織置于4%甲醛溶液中固定，待標(biāo)本收集完畢后統(tǒng)一制作石蠟切片、蘇木精-伊紅(HE)染色后在光鏡下觀察造模前、t0及t36時(shí)肺組織的病理變化并拍照。通過Western bloot方法檢測(cè)SP-D水平。

2 結(jié)果

2.1 HR及MAP變化 組間比較：3組家豬HR和MAP造模前和t0時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，t12、t24、t36時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)比較：t0時(shí)3組家豬HR和MAP均較造模前明顯上升(P<0.05)；t12、t24、t36時(shí)HR和MAP均較t0時(shí)明顯下降(P<0.05，見表1)。

2.2 PaO2/FiO2變化 t0時(shí)3組家豬PaO2/FiO2均較造模前降低，t12時(shí)3組PaO2/FiO2均較t0升高，C組升高最為明顯(P<0.05)；t24、t36時(shí)較t12時(shí)降低(P<0.05，見圖1)。

2.3 SP-D水平變化 t0時(shí)3組家豬肺組織SP-D水平均較造模前降低，t12時(shí)3組家豬SP-D水平升高，以C組升高最明顯(P<0.05)；t24、t36時(shí)較t12時(shí)明顯降低(P<0.05，見圖2)。

圖1 PaO2/FiO2變化趨勢(shì)圖

圖2 SP-D水平變化趨勢(shì)圖

2.4 EVLWI和PVPI變化 組間比較：3組家豬EVLWI和PVPI造模前及t0時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，t12、t24、t36時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)比較：t0時(shí)3組家豬EVLWI和PVPI均較造模前明顯上升(P<0.05)；造模成功后，3組家豬EVLWI在t12、t24和t36時(shí)與組內(nèi)t0時(shí)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；t12、t24、t36時(shí)3組家豬PVPI與組內(nèi)t0時(shí)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.5 肺組織病理 肺組織HE染色顯示，正常肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺間質(zhì)無異常滲出物(見圖3a)；t0時(shí)肺組織肺泡結(jié)構(gòu)破壞，充血水腫嚴(yán)重，肺間質(zhì)可見大量紅細(xì)胞滲出，肺泡間隔增寬(見圖3b)；t36時(shí)，C組肺組織肺泡壁基本完整，肺間質(zhì)內(nèi)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖3c)；t36時(shí)A組肺組織肺間質(zhì)內(nèi)多量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張(見圖3d)；t36時(shí)B組肺組織肺間質(zhì)內(nèi)亦可見多量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡破裂融合(見圖3e)。

表1 3組家豬HR及MAP變化比較

注：與同組造模前比較，*P<0.05；與同組t0比較，△P<0.05；HR=心率，MAP=平均動(dòng)脈壓

表2 3組家豬EVLWI和PVPI變化比較

注：與組內(nèi)造模前相比，*P<0.05；與組內(nèi)t0比較，△P<0.05;EVLWI=血管外肺水指數(shù)，PVPI=肺血管通透性指數(shù)

注：a為正常肺組織，b為t0時(shí)肺組織，c為t36時(shí)C組肺組織，d為t36時(shí)A組肺組織，e為t36時(shí)B組肺組織

圖3 肺組織病理變化(HE染色，×400)

Figure3 Pathological changes in lung histology

3 討論

百草枯吸收入血后主要蓄積在肺組織內(nèi)，其水平可達(dá)其他組織的10倍以上，這可能與肺組織內(nèi)存在胺類攝取系統(tǒng)有關(guān)[11-12]。關(guān)于百草枯中毒肺損傷的機(jī)制目前尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)百草枯中毒后人體會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，如氫氧過氧化物和羥自由基等，引起組織細(xì)胞尤其是肺組織的氧化性損傷及肺部病理學(xué)改變[13]，因此需積極抗氧化治療以減輕百草枯中毒造成的肺組織損傷。甲潑尼龍和地塞米松是急性百草枯中毒臨床治療中的常用激素[14]，陳文清[15]進(jìn)行的一項(xiàng)隨機(jī)臨床對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，甲潑尼龍治療急性百草枯中毒的效果優(yōu)于地塞米松，早期應(yīng)用甲潑尼龍可以有效緩解病情，降低病死率。所以，本研究選擇甲潑尼龍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。鹽酸氨溴索是一種臨床上常用的黏液溶解劑，具有抗氧化、穩(wěn)定肺泡細(xì)胞的作用[16]。有文獻(xiàn)報(bào)道氨溴索在肺組織中的水平高出血清20倍，可以減輕百草枯中毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺損傷[17]。馬玉騰等[18]利用大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在給予百草枯中毒大鼠大劑量鹽酸氨溴索治療后，大鼠的急性肺損傷減輕，此項(xiàng)研究表明氨溴索可以減輕百草枯中毒大鼠全身及肺組織內(nèi)的炎性反應(yīng)，并通過促進(jìn)肺表面活性物質(zhì)的合成進(jìn)一步減輕肺損傷，保護(hù)肺功能。由此推測(cè)甲潑尼龍聯(lián)用氨溴索治療百草枯中毒肺損傷的效果應(yīng)該更好。此外，既往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多在百草枯染毒后立即進(jìn)行藥物干預(yù)[19]，但在實(shí)際臨床中由于轉(zhuǎn)運(yùn)耗時(shí)等各種因素的影響，百草枯中毒患者中毒后多不能立即得到治療，故本實(shí)驗(yàn)在肺組織病理符合ALI/ARDS改變時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)。

百草枯中毒所致ALI的主要病理改變?yōu)橹|(zhì)過氧化反應(yīng)引起肺泡毛細(xì)血管膜損傷，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的肺淤血、肺水腫、肺順應(yīng)性降低和嚴(yán)重的通氣/血流比例失調(diào)等一系列ARDS的病理改變[20]。本研究中t0時(shí)肺泡組織呈明顯充血水腫，肺間質(zhì)可見大量紅細(xì)胞滲出，肺泡間隔增寬，部分可見透明膜形成，符合ALI/ARDS改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在t36時(shí)，以甲潑尼龍聯(lián)合氨溴索治療家豬的肺損傷最輕，肺組織SP-D水平最高。這表明在治療百草枯中毒所致的ALI方面，氨溴索和甲潑尼龍具有協(xié)同作用，提示在百草枯中毒的救治中單用激素治療效果欠佳時(shí)可以考慮加用氨溴索。近些年，在危重病的管理中，血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)處于非常重要的地位，與肺動(dòng)脈導(dǎo)管相比，PICCO具有創(chuàng)傷小、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)[21-23]。通過PICCO技術(shù)獲得的EVLWI的準(zhǔn)確性已經(jīng)得到研究證實(shí)[24]，且有研究顯示，ALI/ARDS的重要病理生理特點(diǎn)之一為EVLW增多，EVLW增多是導(dǎo)致低氧血癥的重要原因[25]。本研究t0時(shí)，3組家豬的EVLWI均較造模前增多，t12時(shí)3組家豬EVLWI均較t0時(shí)下降，t24、t36時(shí)較t0時(shí)升高，其中C組的EVLWI值最小，EVLWI的變化與本實(shí)驗(yàn)中肺損傷的總體變化一致。

總之，甲潑尼龍聯(lián)合氨溴索在減輕百草枯中毒家豬ALI方面具有協(xié)同作用，二者聯(lián)合應(yīng)用可以更好地改善百草枯中毒家豬的氧合狀況，促進(jìn)肺表面活性物質(zhì)的合成。本實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性，即由于觀察時(shí)間短，對(duì)于甲潑尼龍聯(lián)合氨溴索能否降低降低急性百草枯中毒家豬的病死率還需進(jìn)一步探討。

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