腫瘤壞死因子α增強(qiáng)主動(dòng)脈環(huán)收縮在感染性休克中的機(jī)制研究

周 瑩，劉 沛

感染性休克是由病原微生物及其毒素或抗原-抗體復(fù)合物引起的以急性微循環(huán)障礙為主要表現(xiàn)的一組臨床綜合征。主要血流動(dòng)力學(xué)改變包括低血壓、低外周血管阻力、血管對(duì)收縮劑反應(yīng)性下降、血流重新分布等[1]，是由腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素1(IL-1)、血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸代謝產(chǎn)物〔前列環(huán)素(PG)、白三烯(LT3)、血栓素A2(TXA2)〕、一氧化氮(NO)等多種因子共同作用的結(jié)果[2]。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TNF-α是引起感染性休克、多器官功能衰竭(MOF)的主要遞質(zhì)[3]。有證據(jù)表明TNF-α可通過(guò)多種途徑間接參與心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)和支氣管平滑肌細(xì)胞的收縮[4]。感染性休克中血流動(dòng)力學(xué)的改變與血管的收縮、舒張能力變化有關(guān)，為了探討TNF-α在感染性休克血管收縮性變化中的作用，本實(shí)驗(yàn)試圖在器官及細(xì)胞水平上應(yīng)用TNF-α預(yù)處理離體去內(nèi)皮主動(dòng)脈環(huán)，觀察其在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用下的收縮反應(yīng)，并分離培養(yǎng)VSMC，經(jīng)TNF-α預(yù)處理后觀察細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的變化，探討TNF-α影響VSMC功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠60只(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體質(zhì)量200～250 g；乙酰甲酯(Fluo-3/AM)、AngⅡ、乙酰膽堿(Sigma公司)；TNF-α(R&D公司)；2-氨基乙氧基聯(lián)苯硼酸鹽(2-APB，Merck公司)；兔抗α-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)液、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Gibco公司)；25 cm2培養(yǎng)瓶、3.5 cm薄底平皿(Corning公司)；乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、TritonX-100、氯化鈣(CaCl2)等化學(xué)試劑(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)。

張力傳導(dǎo)放大器(TB-611T，Nihon Kohden公司)；激光共聚焦顯微鏡及LSM510軟件(德國(guó)Carl Zeiss公司)。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2012年3—6月，地點(diǎn)為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 離體主動(dòng)脈環(huán)制備及反應(yīng)性測(cè)定

1.2.1.1 離體主動(dòng)脈環(huán)制備 選取24只Wistar大鼠，采用45%烏拉坦和5%氯醛糖混合液1 ml腹腔注射使大鼠致死，開(kāi)胸取胸主動(dòng)脈置于通有95%氧氣(O2)和5%二氧化碳(CO2)的Kreb液中，分離周?chē)闹竞徒Y(jié)締組織后剪成數(shù)個(gè)長(zhǎng)3～5 mm的主動(dòng)脈環(huán)，用內(nèi)皮摩擦法去除內(nèi)皮。將制備好的主動(dòng)脈環(huán)垂直懸掛于裝有Kreb液的浴槽中(pH 7.4，以95%O2和5%CO2的混合氣持續(xù)通氣)，基礎(chǔ)張力1.2 g平衡45 min(每隔15 min換液)，給予40 mmol/L氯化鉀(KCl)使主動(dòng)脈環(huán)收縮，收縮幅度>0.6 g。在收縮頂峰時(shí)給予10-6mol/L乙酰膽堿(檢驗(yàn)有無(wú)內(nèi)皮，如舒張幅度大于30%認(rèn)為內(nèi)皮完整，如無(wú)舒張則為去內(nèi)皮)，無(wú)舒張的標(biāo)本留用。留用標(biāo)本沖洗后重復(fù)給予40 mmol/L KCl直至前后連續(xù)2次得到的收縮幅度之差小于0.1 g的標(biāo)本進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.1.2 實(shí)驗(yàn)分組和給藥 留用的主動(dòng)脈環(huán)在給予KCl后每隔15 min換液1次，平衡30 min后隨機(jī)分為4組：去內(nèi)皮對(duì)照組(浴槽液為Kreb液)、去內(nèi)皮TNF-α組(浴槽液為含5 μg/L TNF-α的Kreb液)、去內(nèi)皮無(wú)鈣對(duì)照組(浴槽液為無(wú)鈣的Kreb液)和去內(nèi)皮無(wú)鈣TNF-α組(浴槽液為含5 μg /L TNF-α的無(wú)鈣的Kreb液)，每組6只。各組主動(dòng)脈環(huán)在孵育1 h后給予10-7mol/L(終濃度)AngⅡ，記錄收縮幅度。

1.2.2 原代培養(yǎng)VSMC及其內(nèi)[Ca2+]i測(cè)定

1.2.2.1 改進(jìn)的原代VSMC培養(yǎng)及鑒定 參照Chamley-Campbell等[5]歸納的VSMC培養(yǎng)方法。無(wú)菌取出3只Wistar大鼠胸主動(dòng)脈，用0.9%氯化鈉注射液沖洗5遍。剝?nèi)ネ饽?，縱向剖開(kāi)血管。用0.25%胰蛋白酶室溫消化內(nèi)膜2～3 min，加入2～3 ml含20%胎牛血清的DMEM終止消化。然后刮去內(nèi)膜，將留下的中膜切成1 mm2大小的組織碎塊，間隔0.5 cm置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37 ℃ 5%CO2孵箱中2～4 h，加入5 ml含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。3～7 d可見(jiàn)組織塊邊緣出現(xiàn)新生細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)融合后傳代。在光鏡下進(jìn)行形態(tài)鑒定，用抗α-肌動(dòng)蛋白抗體熒光染色鑒定細(xì)胞及純度。

1.2.2.2 VSMC的準(zhǔn)備及分組 把生長(zhǎng)穩(wěn)定的第4～12代VSMC隨機(jī)分為對(duì)照組(正常細(xì)胞30個(gè))、TNF-α組(加入TNF-α后孵育8 h的細(xì)胞27個(gè))；另設(shè)上述2組于加AngⅡ前10 min加入2-APB，即2-APB拮抗對(duì)照組和2-APB拮抗TNF-α組，各30個(gè)細(xì)胞。預(yù)實(shí)驗(yàn)2-APB濃度為20、40、80、100 μmol/L，本實(shí)驗(yàn)采用具有完全阻斷效應(yīng)的最低濃度40 μmol/L。

1.2.2.3 VSMC內(nèi)[Ca2+]i測(cè)定[6]培養(yǎng)液中加入Fluo-3/AM(終濃度為5 μmol/L)，37 ℃CO2培養(yǎng)箱中避光負(fù)載45 min，Hank′s液洗去細(xì)胞外液中殘余的Fluo-3/AM，加無(wú)鈣D-Hank′s緩沖液1 ml后，采用confocal顯微鏡測(cè)定單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度(發(fā)射波長(zhǎng)505 nm，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm)。測(cè)定基礎(chǔ)值(靜息時(shí))后，依次加入AngⅡ(終濃度10-7mol/L)、CaCl2(原液為1 mol/L，加入D-Hank′s至過(guò)量)、TritonX-100(終濃度1%)、EGTA(終濃度10 μmol/L)。動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放引起的鈣熒光強(qiáng)度(FI)的變化。采用LSM510軟件對(duì)數(shù)據(jù)、圖形進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)測(cè)量與分析，根據(jù)給藥(AngⅡ)前后單個(gè)細(xì)胞的FI值計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i，公式如下：[Ca2+]i(nmol/L)=kd×(F-Fmin)/(Fman-F)。kd 為Fluo-3/AM與Ca2+結(jié)合反應(yīng)的解離參數(shù)，室溫下kd=320 nmol/L；F為實(shí)際測(cè)得的FI值；Fmin為加入EGTA將細(xì)胞內(nèi)Ca2+全部螯合，使細(xì)胞內(nèi)無(wú)Ca2+時(shí)的FI值；Fmax為加入CaCl2、TritonX-100細(xì)胞內(nèi)Ca2+飽和時(shí)的FI值。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α對(duì)主動(dòng)脈環(huán)收縮功能的影響 有鈣條件下，去內(nèi)皮TNF-α組給予AngⅡ后主動(dòng)脈環(huán)的收縮幅度高于去內(nèi)皮對(duì)照組；無(wú)鈣條件下，去內(nèi)皮無(wú)鈣TNF-α組給予AngⅡ后主動(dòng)脈環(huán)的收縮幅度亦高于去內(nèi)皮無(wú)鈣對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.2 VSMC鑒定 VSMC細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)多有突起，核呈圓形、卵圓形。細(xì)胞可出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象，光鏡下觀察呈峰谷樣生長(zhǎng)；免疫熒光抗α-肌動(dòng)蛋白抗體染色陽(yáng)性，沿細(xì)胞長(zhǎng)軸與肌絲相同呈絲狀排列，陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的95%以上，表明所獲細(xì)胞為VSMC，純度可達(dá)95%以上，電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)束狀肌絲結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)。

表1 有鈣條件和無(wú)鈣條件下各組主動(dòng)脈環(huán)對(duì)AngⅡ的反應(yīng)性

Table1 In Ca2+-present and Ca2+-free Kreb buffer，the reactiveness of aorta ring induced by AngⅡ in different groups

組別只數(shù)主動(dòng)脈環(huán)對(duì)AngⅡ的反應(yīng)性平均值(x±s)有鈣條件下 去內(nèi)皮對(duì)照組6014015044021024028024±011 去內(nèi)皮TNF-α組6030025045069087060053±024?無(wú)鈣條件下 去內(nèi)皮無(wú)鈣對(duì)照組6015000015002004021010±008 去內(nèi)皮無(wú)鈣TNF-α組6021014023014015024019±005△

注：與去內(nèi)皮對(duì)照組比較，*t=-2.645，P=0.025；與去內(nèi)皮無(wú)鈣對(duì)照組比較，△t=-2.35，P=0.047

注：A為新生VSMC(×200)，B為傳代VSMC(×400)，C為α-肌動(dòng)蛋白抗體熒光染色(×100)，D為光鏡下細(xì)胞內(nèi)的肌絲結(jié)構(gòu)(×10 000)

圖1 VSMC細(xì)胞鑒定結(jié)果

Figure1 Identification result of VSMC

2.3 VSMC內(nèi)[Ca2+]i測(cè)定 4組VSMC靜息狀態(tài)下[Ca2+]i無(wú)自主上升，在無(wú)鈣緩沖液中，靜息狀態(tài)下4組VSMC內(nèi)[Ca2+]i間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。加入AngⅡ后，4組[Ca2+]i升高值間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中TNF-α組VSMC內(nèi)[Ca2+]i均高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而2-APB拮抗對(duì)照組、2-APB拮抗TNF-α組VSMC內(nèi)[Ca2+]i間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表2)。測(cè)鈣圖見(jiàn)圖2。

3 討論

許多學(xué)者認(rèn)為在感染性休克時(shí)由感染促發(fā)的全身炎性反應(yīng)為介導(dǎo)的二次打擊對(duì)器官的損害比原發(fā)感染作用更大，常造成血流動(dòng)力學(xué)的紊亂和器官功能衰竭。TNF-α被公認(rèn)為是引起感染性休克、MOF的主要遞質(zhì)。Hollenberg等[7]應(yīng)用主動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)證實(shí)大劑量TNF-α(1 000 U/ml)不僅作用于血管內(nèi)皮，也可直接作用于血管平滑肌，導(dǎo)致血管舒張，對(duì)收縮劑反應(yīng)性下降，但其所采用的TNF-α劑量明顯高于臨床報(bào)道范圍(200～800 mg/ml，相當(dāng)于10～40 U/ml)，而Murphey等[8]在注射脂多糖(LPS)前給豬注射小劑量TNF-α(500 ng/kg)，發(fā)現(xiàn)可以降低死亡率并減輕低血壓的程度，提示小劑量TNF-α具有保護(hù)作用。說(shuō)明TNF-α作為一種多效性的細(xì)胞因子，其效應(yīng)有害或有利于機(jī)體主要取決于產(chǎn)生的數(shù)量、組織特異性定位、局部TNF-α結(jié)合蛋白的活性及細(xì)胞因子的環(huán)境等[9]。有報(bào)道指出，在失血性休克時(shí)，VSMC內(nèi)[Ca2+]i的調(diào)節(jié)能力紊亂可能是造成休克的原因[10]；一些治療休克的藥物作用靶點(diǎn)也是調(diào)節(jié)VSMC內(nèi)[Ca2+]i[11]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的去內(nèi)皮主動(dòng)脈環(huán)的反應(yīng)性變化代表了VSMC的舒縮狀態(tài)，VSMC的收縮受AngⅡ等多種血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)，后者與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合，激活磷脂酶C的β亞型，催化質(zhì)膜磷脂酰肌醇二磷酸水解，生成三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯。IP3與1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3Rs)結(jié)合促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)備Ca2+釋放引起細(xì)胞收縮。細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i變化能反映VSMC的功能狀態(tài)，因此監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i變化能反映細(xì)胞的舒縮狀態(tài)。而Fluo-3/AM是常用的鈣熒光指示劑，其與細(xì)胞內(nèi)游離鈣呈高度特異性結(jié)合，其FI值與[Ca2+]i呈正比。細(xì)胞內(nèi)Ca2+來(lái)源于細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫(kù)的鈣釋放[12]。而IP3Rs及RYR受體是主要的細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)備Ca2+釋放通道，在VSMC內(nèi)主要受IP3Rs調(diào)控，這一點(diǎn)可被2-APB阻斷Ca2+釋放實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

注：A為對(duì)照組，B為T(mén)NF-α組，C為2-APB拮抗TNF-α組

圖2 各組VSMC在AngⅡ刺激下細(xì)胞內(nèi)FI的時(shí)間變化曲線

Figure2 AngⅡ-induced VSMC intracellular calcium fluorescence intensity(FI)-time curves in different groups

表2 AngⅡ刺激下4組VSMC內(nèi)[Ca2+]i比較

注：與TNF-α組比較，*P<0.001

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)與對(duì)照組比較，在有鈣條件下加入5 g/L TNF-α能使去內(nèi)皮主動(dòng)脈環(huán)對(duì)AngⅡ的反應(yīng)性升高；在無(wú)鈣條件下加入5 g/L TNF-α仍能使去內(nèi)皮主動(dòng)脈環(huán)對(duì)AngⅡ的反應(yīng)性升高，提示主動(dòng)脈環(huán)對(duì)AngⅡ的反應(yīng)性升高與細(xì)胞內(nèi)鈣釋放有關(guān)。(2)對(duì)照組、TNF-α組、2-APB拮抗對(duì)照組和2-APB拮抗TNF-α組VSMC靜息狀態(tài)下[Ca2+]i間無(wú)差異，而加入AngⅡ后，對(duì)照組和TNF-α組VSMC在短時(shí)間內(nèi)(約20 s)FI迅速增加(即峰值升高相)，TNF-α組[Ca2+]i升高值顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明TNF-α能促進(jìn)VSMC內(nèi)儲(chǔ)備鈣釋放，與Song等[13]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)感染性休克大鼠VSMC內(nèi)[Ca2+]i明顯增加的結(jié)果一致。由于胞外液無(wú)鈣，胞內(nèi)鈣儲(chǔ)庫(kù)排空后得不到再充盈，F(xiàn)I并未出現(xiàn)緩慢持久升高；當(dāng)向細(xì)胞外液加入過(guò)量的CaCl2時(shí)兩組細(xì)胞均出現(xiàn)鈣飽和狀態(tài)且Fmax一致，提示兩組細(xì)胞的Fluo-3/AM負(fù)載水平及活性無(wú)差異。在加入2-APB后，2-APB拮抗對(duì)照組和2-APB拮抗TNF-α組VSMC此效應(yīng)均可被40 μmol/L的2-APB完全阻斷，表現(xiàn)為對(duì)AngⅡ刺激無(wú)反應(yīng)，[Ca2+]i升高值無(wú)差異。故TNF-α 間接影響細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i是通過(guò)IP3Rs通路起作用的。

總之，TNF-α通過(guò)IP3Rs通路增強(qiáng)VSMC內(nèi)鈣釋放，能夠使主動(dòng)脈環(huán)對(duì)縮血管物質(zhì)的反應(yīng)性增強(qiáng)，這條信號(hào)通路與TNF-α促進(jìn)核因子-κB受體活化因子配體-RANKL誘導(dǎo)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞破骨細(xì)胞形成與分化的信號(hào)通路以及TNF-α調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸內(nèi)鈣信號(hào)的通路是一致的[14-15]，這也許是感染性休克早期機(jī)體維持血壓穩(wěn)定的機(jī)制之一。進(jìn)一步推測(cè)TNF-α在休克早期促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)備鈣大量釋放使細(xì)胞內(nèi)鈣耗竭，可能是導(dǎo)致休克晚期血管收縮性下降難以維持血壓的原因之一，進(jìn)一步明確這一信號(hào)通路及其下游調(diào)控機(jī)制是未來(lái)的研究方向。

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