黃連解毒湯有效部位調(diào)控VEGF表達(dá)對(duì)中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)

龍建飛張秋霞鄒海艷趙 暉王 蕾邊寶林趙海譽(yù)

（1首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100069；2中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700）

實(shí)驗(yàn)研究

黃連解毒湯有效部位調(diào)控VEGF表達(dá)對(duì)中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)

龍建飛1張秋霞1鄒海艷1趙 暉1王 蕾1邊寶林2趙海譽(yù)2

（1首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100069；2中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700）

目的：觀察黃連解毒湯有效部位（總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜）對(duì)中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。并通過(guò)檢測(cè)缺血中心區(qū)（尾殼核）和遠(yuǎn)隔腦區(qū)（海馬）血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)，探討其作用機(jī)制。方法：建立中動(dòng)脈栓塞大鼠模型，免疫熒光染色技術(shù)觀察神經(jīng)元核蛋白NeuN及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)。結(jié)果：腦缺血7 d大鼠海馬神經(jīng)元核蛋白NeuN表達(dá)下調(diào)，尾殼核、海馬VEGF免疫染色強(qiáng)度降低，差異較假手術(shù)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。黃連解毒湯水提取物和總黃酮可提高海馬神經(jīng)元NeuN表達(dá)（P＜0.05）；總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜組大鼠海馬CA1區(qū)VEGF表達(dá)較模型組增強(qiáng)（P＜0.05）；總黃酮還可明顯上調(diào)尾殼核VEGF表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論：黃連解毒湯總黃酮對(duì)缺血中心區(qū)、遠(yuǎn)隔腦區(qū)VEGF均有調(diào)節(jié)作用，可減輕腦梗死遠(yuǎn)隔部位海馬CA1區(qū)神經(jīng)元繼發(fā)性損害。

黃連解毒湯；中動(dòng)脈栓塞；神經(jīng)核抗原；VEGF

臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，大腦中動(dòng)脈缺血后，腦梗死損害并不僅僅限于梗死灶局部，遠(yuǎn)隔缺血腦區(qū)海馬CA1區(qū)也會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)元變性［1］。采取有效手段減輕腦梗死遠(yuǎn)隔部位繼發(fā)性損害，對(duì)卒中康復(fù)具有重要意義。黃連解毒湯源于唐·王燾《外臺(tái)秘要》，可用于急性腦卒中及腦血管后遺癥的臨床治療［2-4］，本研究重點(diǎn)觀察黃連解毒湯水提物3個(gè)主要有效部位（總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜）對(duì)中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬神經(jīng)元標(biāo)記蛋白NeuN表達(dá)的影響，并通過(guò)檢測(cè)缺血中心區(qū)（尾殼核）和遠(yuǎn)隔腦區(qū)（海馬）血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)，探討黃連解毒湯對(duì)腦梗死后遠(yuǎn)隔腦區(qū)繼發(fā)性損害的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量320～350 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)條件下自然飲食，適應(yīng)環(huán)境3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 受試藥物 黃連解毒湯水提物及3個(gè)有效部位（總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜），由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供。水提取物粉末得率為20%；總生物堿主要成分有黃連堿、表小檗堿、小檗堿、巴馬汀，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.50%；總黃酮主要成分是黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.22%；總環(huán)稀醚萜主要成分是梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、京尼平苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.08%。

1.3 試劑 鼠抗NeuN（Millpore，Cat.＃MAB377，Lot＃1991263）；兔抗VEGF（Abcam，批號(hào)：ab46154）；二抗：Alexa Flur 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、Dylight594-山羊抗兔IgG（北京中杉金橋有限公司）。

1.4 儀器 全自動(dòng)脫水機(jī)（BLEICA ASP300型，德國(guó)）；輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（LEICA RM2235型，德國(guó)）；攤片機(jī)（LEICA HI1210型，德國(guó)）；包埋機(jī)（LEICA EG1150H型，德國(guó)）；Nikon生物顯微鏡、NIS-Elements Basic Research圖像采集分析系統(tǒng)（日本）。

2 方法

2.1 中動(dòng)脈栓塞大鼠模型制備 參照文獻(xiàn)［5］制作。大鼠麻醉后，分離右頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）及頸外動(dòng)脈（ECA），同側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎，于ECA與ICA分叉處作一切口，將制備好的線栓沿CCA順行插入，插入深度為距動(dòng)脈分叉17～18 mm，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。動(dòng)物入選的標(biāo)準(zhǔn)：大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)明顯左側(cè)偏癱體征（不能完全伸展左前肢、行走時(shí)向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈者）納入，無(wú)此體征者被棄去。2.2 分組、給藥 黃連解毒湯3個(gè)有效部位的給藥劑量由藥理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體臨床等效劑量換算而成。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、總生物堿組44 mg/kg、總黃酮組50 mg/kg、總環(huán)烯醚萜組80 mg/kg。造模后2 h給藥組大鼠灌胃給藥1次，造模24 h再次灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d，1次/d，給藥體積為0.5 mL/100 g。假手術(shù)組、模型組灌胃等容量生理鹽水。

2.3 取材與標(biāo)本處理 缺血7 d后，每組隨機(jī)取4只大鼠，麻醉后，進(jìn)行4%多聚甲醛心內(nèi)灌注固定，恒定灌注時(shí)間45 min，待固定充分后，開顱取腦，切取視交叉前2 mm至視交叉后2 mm組織塊，投入相同固定液于4℃固定1周后，常規(guī)石蠟包埋，切片。

2.4 免疫熒光組織化學(xué)染色 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（PH6.0）20 min修復(fù)抗原，10%羊血清封閉，每片滴加一抗70μL（NeuN抗體稀釋1∶100、VEGF抗體稀釋1∶200），于濕盒中4℃孵育40 h。每片滴加二抗試劑70μL，室溫孵育2 h后，0.01M PBS洗滌，DAPI封片。2.5 圖像處理 NIS-Elements Basic Research圖像采集分析系統(tǒng)采集每張切片右側(cè)（缺血側(cè)）遠(yuǎn)隔腦區(qū)海馬CA1區(qū)以及缺血腦區(qū)尾殼核相互不重疊的5個(gè)視野，分析每個(gè)視野的陽(yáng)性表達(dá)，以熒光強(qiáng)度反映陽(yáng)性表達(dá)的免疫強(qiáng)度。

3 結(jié)果

3.1 黃連解毒湯有效部位對(duì)中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬神經(jīng)元NeuN表達(dá)的影響 NeuN為神經(jīng)細(xì)胞特異性抗體，可反映神經(jīng)元損傷程度。圖像分析結(jié)果顯示，腦缺血7 d大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元NeuN表達(dá)較假手術(shù)組明顯下調(diào)（P＜0.05）。水提取物和總黃酮可明顯提高海馬CA1區(qū)神經(jīng)元NeuN熒光強(qiáng)度，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見表1）

表1 黃連解毒湯有效部位對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元NeuN表達(dá)的影響（±s，例數(shù)＝4）

表1 黃連解毒湯有效部位對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元NeuN表達(dá)的影響（±s，例數(shù)＝4）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

熒光強(qiáng)度假手術(shù)-1410.59±673.60組別劑量（mg·kg-1）* 80 1204.70±631.36模型-892.55±481.11水提取物800 1447.45±988.36**總生物堿44 764.48±617.70總黃酮50 1382.20±799.60*總環(huán)烯醚萜

3.2 黃連解毒湯有效部位對(duì)中動(dòng)脈栓塞大鼠VEGF表達(dá)的影響 VEGF是血管新生的正性調(diào)節(jié)因子，同時(shí)又是一個(gè)多效性的神經(jīng)保護(hù)因子。圖像分析結(jié)果顯示：腦缺血7 d大鼠海馬CA1區(qū)、尾殼核VEGF表達(dá)較假手術(shù)組明顯下調(diào)（P＜0.05）；黃連解毒湯水提取物及3個(gè)有效部位總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜均可明顯上調(diào)海馬CA1區(qū)VEGF表達(dá)（P＜0.05），總黃酮還可增強(qiáng)缺血中心區(qū)尾殼核VEGF的熒光強(qiáng)度，較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（見表2）

表2 黃連解毒湯有效部位對(duì)腦缺血大鼠VEGF表達(dá)的影響（±s，例數(shù)＝4）

表2 黃連解毒湯有效部位對(duì)腦缺血大鼠VEGF表達(dá)的影響（±s，例數(shù)＝4）

注：與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

91.09±34.73模型-159.66±104.19 49.13±25.68水提取物800 172.98±93.99 115.40±96.91**總生物堿44 146.63±76.30 92.17±81.87*總黃酮50 310.38±247.86**112.97±92.42**總環(huán)烯醚萜80 200.13±158.57 103.43±78.77尾殼核海馬CA1區(qū)熒光強(qiáng)度假手術(shù)-69.80±45.83*組別劑量（mg/kg）*

附圖：

圖1 黃連解毒湯有效部位對(duì)大鼠腦缺血7 d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元NeuN表達(dá)的影響（免疫熒光染色，×400）

圖2 黃連解毒湯有效部位對(duì)大鼠腦缺血7 d后海馬CA1區(qū)VEGF表達(dá)的影響（免疫熒光染色，×400）

4 討論

NeuN是神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白，在缺血、缺氧、神經(jīng)損傷等多種病理?xiàng)l件下，NeuN免疫活性的降低可誘導(dǎo)神經(jīng)元的死亡［6］。在本次實(shí)驗(yàn)中我們觀察到中動(dòng)脈栓塞7 d大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元NeuN表達(dá)明顯減弱，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)大腦中動(dòng)脈栓塞后并不直接影響海馬的供血，卻引起了海馬神經(jīng)元變性［1］。同時(shí)我們注意到，伴隨神經(jīng)元NeuN免疫活性降低，缺血中心區(qū)尾殼核及遠(yuǎn)隔腦區(qū)海馬血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)果提示，中動(dòng)脈栓塞后遠(yuǎn)隔缺血區(qū)海馬神經(jīng)元變性與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)變化存在必然的聯(lián)系。

黃連解毒湯源于唐·王燾《外臺(tái)秘要》，由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成，為清熱解毒代表方?；A(chǔ)研究與臨床報(bào)道表明黃連解毒湯可用于治療缺血性腦血管?。?，7-11］。本次實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)對(duì)黃連解毒湯3個(gè)主要有效部位總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜防治腦梗死后遠(yuǎn)隔部位繼發(fā)性損害的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，黃連解毒湯水提物及有效部位總黃酮可明顯增強(qiáng)中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬CA1區(qū)NeuN陽(yáng)性表達(dá)，提示總黃酮是黃連解毒湯減輕海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷的主要有效部位。VEGF是高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂因子［12］，不僅可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及毛細(xì)血管瓣生成，促進(jìn)微血管形成，有利于側(cè)支循環(huán)的建立［13-14］，還能直接作用于皮質(zhì)、海馬、小腦神經(jīng)細(xì)胞，發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)和神經(jīng)再生作用［12-15］。已有報(bào)道表明，黃連解毒湯可促進(jìn)VEGF表達(dá)［16］，對(duì)多種因素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用［17-18］。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步分析了黃連解毒湯總生物堿、總黃酮、總環(huán)烯醚萜對(duì)中動(dòng)脈栓塞大鼠缺血中心區(qū)尾殼核及缺血遠(yuǎn)隔腦區(qū)海馬VEGF表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總黃酮、總生物堿、總環(huán)烯醚萜均可增加遠(yuǎn)隔腦區(qū)海馬VEGF表達(dá)，而總黃酮還可明顯上調(diào)缺血中心區(qū)VEGF表達(dá)。綜合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為黃連解毒湯總黃酮可通過(guò)調(diào)節(jié)缺血中心區(qū)、遠(yuǎn)隔腦區(qū)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)，對(duì)減輕腦梗死后遠(yuǎn)隔部位繼發(fā)性損害具有重要意義。

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（2014-04-03收稿 責(zé)任編輯：曹柏）

Active Fractions of Huanglian Jiedu Decoction Regulating the Exp ression of VEGF and Protecting the Hippocampal Neurons of Ratswith M idd le Cerebral Artery Occlusion

Long Jianfei1，Zhang Qiuxia1，Zou Haiyan1，Zhao Hui1，Wang Lei1，Bian Baolin2，Zhao Haiyu2
（1 School of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Key Laboratory for Collateral-Disease Theory of TCM，Beijing 100069，China；2 Instituteof ChineseMateia Madica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100070，China）

Objective：To investigate the effects of Huanglian Jiedu Decoction（HLJDDAF）which consists of total alkaloids，total flavonoids and total iridoids on the expression of VEGF in caudate putamen and hippocampal CA1 region of rats afterm iddle cerebral artery occlusion and to explore the mechanism of the effects.Methods：Cerebral ischemia was induced by midd le cerebral artery occlusion（MACO）.The expressions of NeuN and VEGFwere observed by immunofluorescence staining.Results：The expression of NeuN in distant brain regions of rats inmodelgroup were significantly reduced，and the expression of VEGF in caudate putamen and hippocampal region were reduced compared with those of the sham group（P＜0.01-0.05）.Aqueous extract，total flavonoidswere capable of increasing the expression of the NeuN compared with those of themodel group（P＜0.01-0.05）；total alkaloids，total flavonoids and total iridoidswere capable of increasing the expression of the VEGF in hippocampal CA1 region compared with those of themodel group（P＜0.01-0.05）.Especially the total flavonoids also increased the expression of VEGF in caudate putamen（P＜0.01）.Conclusion：Total flavonoids of HLJDD is inherently capable of regulating the expression of VEGF in caudate putamen and distant brain regions，and reducing hematogenously secondary damage of hippocampal CA1 region after cerebral infarction.

HLJDDAF；Middle cerebral artery occlusion；NeuN；VEGF

R289.9；R-332

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.10.023

國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題“中藥有效成分群功效關(guān)聯(lián)性評(píng)價(jià)技術(shù)研究”（編號(hào)：2008BAI51B02）；北京市自然科學(xué)基金（編號(hào)：7102014，編號(hào)：7122018）；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃-長(zhǎng)城學(xué)者項(xiàng)目資助（編號(hào)：CIT＆TCD20140329）；北京市屬高等學(xué)校人才強(qiáng)教深化計(jì)劃“中青年骨干人材培養(yǎng)計(jì)劃”項(xiàng)目（編號(hào)：PXM2011014226）

龍建飛，女，2012級(jí)在讀碩士研究生，E-mail：ljfbeijing2012＠163.com

趙暉，女，博士研究生，副教授，E-mail：zhaohui8957＠sina.com；王蕾，女，博士研究生，教授，E-mail：tmwangl＠ccmu.edu.cn