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    消風(fēng)宣竅湯對(duì)TDI致過敏性鼻炎模型豚鼠血清IL-5、IL-12表達(dá)水平的影響

    2014-02-06 01:26:26魏肖云汪受傳
    世界中醫(yī)藥 2014年7期
    關(guān)鍵詞:消風(fēng)豚鼠鼻炎

    李 萌 魏肖云 汪受傳

    (南京中醫(yī)藥大學(xué),南京,210029)

    消風(fēng)宣竅湯對(duì)TDI致過敏性鼻炎模型豚鼠血清IL-5、IL-12表達(dá)水平的影響

    李 萌 魏肖云 汪受傳

    (南京中醫(yī)藥大學(xué),南京,210029)

    目的:觀察消風(fēng)宣竅湯對(duì)過敏性鼻炎豚鼠行為學(xué)及細(xì)胞因子的影響,以探討其治療機(jī)制。方法:40只Hartley豚鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、消風(fēng)宣竅湯組、氯雷他定組,每組10只。采用10%二異氰酸甲苯酯(TDI)橄欖油溶液致敏豚鼠建立過敏性鼻炎動(dòng)物模型,灌胃治療1周,觀察豚鼠行為學(xué)變化,用ELISA法測定血清中細(xì)胞因子IL-5、IL-12含量。結(jié)果:消風(fēng)宣竅湯能明顯減輕豚鼠過敏性鼻炎鼻部過敏癥狀以及鼻黏膜上皮炎細(xì)胞的浸潤,對(duì)過敏性鼻炎豚鼠血清IL-5有顯著的降低作用(P<0.01),對(duì)IL-12有顯著的升高作用(P<0.01),兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,并且效果優(yōu)于開瑞坦組(P<0.05)。結(jié)論:消風(fēng)宣竅湯治療AR的機(jī)制可能是通過降低IL-5和升高IL-12水平實(shí)現(xiàn)的,提示IL-5和IL-12在AR發(fā)病機(jī)制中有重要作用。

    消風(fēng)宣竅湯;過敏性鼻炎;細(xì)胞因子;行為學(xué)

    過敏性鼻炎(Allergic Rhinitis,AR)是兒科常見的呼吸道疾病,近年來發(fā)病率逐年增多,影響兒童的學(xué)習(xí)和生活質(zhì)量。免疫學(xué)研究表明,體T細(xì)胞系列中的Th細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子失衡在變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病中起重要作用[1]。近年來相關(guān)的臨床研究表明中醫(yī)藥治療本病具有一定的優(yōu)勢(shì)[2-3]。本研究從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)角度觀察消風(fēng)宣竅湯對(duì)豚鼠AR模型的藥理作用機(jī)制,以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物 幼年Hartley豚鼠40只,雌雄各半,體重(200±25)g,清潔級(jí),由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(蘇)2007-0008。飼養(yǎng)條件:室溫(23±2)℃,相對(duì)濕度(60±5)%,自由攝取水和食物,單籠飼養(yǎng),每籠5只,保持室內(nèi)安靜。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始正式實(shí)驗(yàn)。

    1.2 藥品與試劑 消風(fēng)宣竅湯按原方劑量要求,由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬百草堂門診中藥房提供,分別加適量水,水煎2次,合并兩次濾液并分別減壓濃縮至生藥濃度2.1 g·mL-1冷藏備用。開瑞坦(氯雷他定片)由上海先靈葆雅制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格:10 mg×6片,國藥準(zhǔn)字:H10970410,批號(hào):10KRXF1047,用蒸餾水溶解并稀釋為0.1 g·m L-1。

    二異氰酸甲苯酯(TDI)由大中原聯(lián)合化學(xué)(鄭州)有限公司生產(chǎn),批號(hào):20120901。橄欖油由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司生產(chǎn),批號(hào):20120730。豚鼠IL-5、IL-12酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒由美國RD公司生產(chǎn),上海韻涵生物科技公司分裝,批號(hào):201304。

    1.3 動(dòng)物分組及造模方法 將40只豚鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組,模型組,消風(fēng)宣竅湯組,開瑞坦組,每組10只,雌雄各半。造模方法參考文獻(xiàn)方法[4],并作相應(yīng)改進(jìn)。致敏組均首先選用10%TDI橄欖油溶液用加樣器滴入豚鼠雙側(cè)鼻孔(每側(cè)5/μL),1次/d,連續(xù)7次,為基礎(chǔ)致敏階段;第8日起改為隔日激發(fā)給藥1次,直至藥物觀察結(jié)束。正常對(duì)照組則以橄欖油代替。

    1.4 模型判定 以鼻部癥狀和體征為主要觀察內(nèi)容。自給致敏藥開始,依據(jù)鼻癢、噴嚏、流涕輕重程度、次數(shù)多少、出現(xiàn)的時(shí)間長短等為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)并評(píng)分記錄,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)詳見表1。

    表1 過敏反應(yīng)行為學(xué)評(píng)分表

    各癥狀疊加積分,總分≥5分者為模型成功,觀察時(shí)間為每次致敏后3 min內(nèi)。

    1.5 給藥方法 AR模型建立后,將藥品按人鼠劑量換算后按20 mL·L-1灌胃,2次/d,共7 d。正常組、模型組予生理鹽水灌胃;消風(fēng)宣竅湯組分別以生藥濃度2.1 g·mL-1藥汁灌胃;開瑞坦組予開瑞坦0.1 g· mL-1濃度混懸液灌胃。給藥期間記錄鼻部癥狀,以觀察藥物治療后豚鼠鼻部情況。

    1.6 觀察項(xiàng)目

    1.6.1 鼻部癥狀觀察 采用癥狀疊加積分(見模型判定),比較組間差異。

    1.6.2 血清IL-5、IL-12含量的測定 豚鼠于末次激發(fā)后30 min,用25%烏拉坦腹腔注射麻醉(4 m L· kg-1),頸動(dòng)脈插管采取5 mL,離心(3 000r/min)10 min后分離出血清,于-70℃保存,避免反復(fù)凍融。取血清標(biāo)本,按照試劑盒所示方法(ELISA法)檢測血清IL-5、IL-12含量。

    2 結(jié)果

    2.1 鼻部癥狀的改善 第1次鼻腔激發(fā)后豚鼠即出現(xiàn)不同程度的搔鼻、流涕癥狀,隨著激發(fā)次數(shù)的增多,上述癥狀加重,并出現(xiàn)不同程度的噴嚏癥狀。給藥7 d后,模型組總積分(6.143±0.378)分(見表2)。用藥后致敏組豚鼠,模型對(duì)照組的癥狀與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);消風(fēng)宣竅湯組的癥狀與模型對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);開瑞坦組的癥狀與模型對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(見表3)

    實(shí)驗(yàn)過程中,除正常組外,其余3組均有豚鼠陸續(xù)死亡,其中2只為豚鼠造模過程中不明原因死亡,解剖尸體未發(fā)現(xiàn)明顯異常;6只為造模后鼻塞明顯,出現(xiàn)氣喘驚厥癥狀,窒息死亡。治療結(jié)束后各組豚鼠數(shù)量如下:正常組10只;模型組7只;消風(fēng)宣竅湯組8只;開瑞坦組7只。各組豚鼠死亡數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表2 鼻部激發(fā)癥狀評(píng)分結(jié)果

    表3 消風(fēng)宣竅湯治療期間各組癥狀得分對(duì)照

    2.2 鼻黏膜病理切片觀察 HE病理切片顯示:正常組見纖毛密集,排列整齊(圖1);模型組見纖毛大部分脫落、變稀,排列紊亂,杯狀細(xì)胞增生明顯,固有層血管擴(kuò)張,腺體增生,組織水腫,伴有大量炎性細(xì)胞浸潤等(圖2);消風(fēng)宣竅湯組見纖毛增生,排列較整齊(圖3);開瑞坦組見纖毛部分脫落、變稀,但較模型組稍好(圖4)。

    2.3 血清IL-5、IL-12的變化 與正常組相比,模型組的IL-5水平顯著上升(P<0.01);與模型組相比,消風(fēng)宣竅湯組與開瑞坦組IL-5水平較模型組顯著下降(P<0.01);與正常組比較,模型組的IL-12水平顯著下降(P<0.01),與模型組相比,消風(fēng)宣竅湯組IL-12水平較模型組顯著上升(P<0.01),開瑞坦組IL-12水平較模型組明顯上升(P<0.05)。(見表4)

    表4 用藥后各組癥狀累計(jì)總積分及血清IL-5、IL-12水平變化(±s)

    表4 用藥后各組癥狀累計(jì)總積分及血清IL-5、IL-12水平變化(±s)

    注:與正常對(duì)照組比較,△△P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    組別例數(shù)癥狀總積分IL-5(ng/mL)IL-12(pg/m L)10 0.125±0.3536 33.333±3.252 17.029±1.003模型組7 6.429±0.976△△61.653±0.621△△8.100±1.538△△消風(fēng)宣竅湯組8 3.250±1.708**37.003±1.094**14.648±1.497**開瑞坦組7 4.857±1.069 43.973±11.590**10.584±0.582正常組*

    2.4 IL-5和IL-12相關(guān)性 采用Person秩相關(guān)檢驗(yàn),r=-0.867,P=0.000,說明此兩項(xiàng)指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

    3 討論

    AR屬于中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇,以鼻癢、陣發(fā)性噴嚏、大量清水樣鼻涕和鼻塞為主要臨床表現(xiàn)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為本病的發(fā)生與外界因素密切相關(guān),內(nèi)因以臟腑虛損為主,但與個(gè)人稟賦體質(zhì)有關(guān)[4]。汪受傳教授認(rèn)為,在小兒鼻鼽的發(fā)病中,風(fēng)邪是主要的致病邪氣,風(fēng)痰束竅為其主要病機(jī)[5]。臨證中善用風(fēng)藥治療本病,消風(fēng)宣竅湯是汪受傳教授治療小兒鼻鼽的有效驗(yàn)方,由炙麻黃、桂枝、防風(fēng)、辛夷、蒼耳子、五味子、烏梅、膽南星、廣地龍等組成,具有消風(fēng)化痰、宣肺利竅之功效。該方具有中醫(yī)理論及現(xiàn)代藥理基礎(chǔ)[6],臨床療效確切。本課題組前期研究表明消風(fēng)宣竅湯干預(yù)后能降低AR豚鼠血清IL-6、IL-17水平,從而減少炎性細(xì)胞的浸潤和活化,抑制IgE的合成與分泌[7]。

    本文參照文獻(xiàn)方法建立了豚鼠TDI變應(yīng)性鼻炎模型,動(dòng)物出現(xiàn)抓鼻撓面、噴嚏、鼻黏膜充血腫脹、炎性細(xì)胞浸潤等表現(xiàn),消風(fēng)宣竅湯干預(yù)后能明顯改善上述癥狀,并減輕鼻黏膜病理改變,結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8]。但本次TDI造模方法豚鼠死亡率較高,考慮與藥物劑量過大及豚鼠幼小不能耐受有關(guān)。本研究表明,消風(fēng)宣竅湯能明顯降低豚鼠TDIAR模型癥狀評(píng)分和減輕鼻黏膜病理程度,表明消風(fēng)宣竅湯對(duì)AR可能具有一定治療作用。

    現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,AR是機(jī)體在特異性變應(yīng)原的誘導(dǎo)下發(fā)生的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病。目前認(rèn)為T輔助細(xì)胞(Th)及相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)物在AR的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡可能是導(dǎo)致AR發(fā)病的重要免疫學(xué)基礎(chǔ),即Th2主導(dǎo)的炎癥性疾病[9],表現(xiàn)為Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ/TNF-β和IL-12等減少,對(duì)變態(tài)反應(yīng)的負(fù)向調(diào)節(jié)作用減弱;Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5和TGF-β等增加,對(duì)變態(tài)反應(yīng)起到正向調(diào)節(jié)作用,導(dǎo)致炎癥發(fā)生[10]。IL-12主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生,作為Th1細(xì)胞重要的細(xì)胞因子,IL-12具有多功能的免疫調(diào)節(jié)作用,與AR發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),能抑制特異性IgE的產(chǎn)生,在各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)AR發(fā)病都可能起到一定的調(diào)節(jié)作用[11],IL-12在Th細(xì)胞亞群的分化中起著關(guān)鍵作用[12],可有效抑制或逆轉(zhuǎn)Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞亞群的分化,是抗呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要因素[13],并可直接抑制多種Th2型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-10等生成,促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ及IL-2產(chǎn)生,增強(qiáng)Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答,被認(rèn)為是促使T輔助細(xì)胞向Th1分化的始動(dòng)因素[14]。IL-5是由T細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生,可協(xié)同IL-4刺激B細(xì)胞合成IgE,被認(rèn)為是嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)重要的活化因子。所以降低IL-5含量、升高IL-12含量是治療AR有效途徑之一[15]。本研究通過檢測各組豚鼠血清IL-5、IL-12含量的變化,發(fā)現(xiàn)消風(fēng)宣竅湯干預(yù)后,Th2細(xì)胞因子IL-5水平較模型組明顯下降,Th1細(xì)胞因子IL-12水平較模型組明顯升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示消風(fēng)宣竅湯可能誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化、成熟,促進(jìn)其細(xì)胞因子IL-12的表達(dá),抑制Th2細(xì)胞分化、成熟及其細(xì)胞因子IL-5的產(chǎn)生;促進(jìn)Th1/Th2細(xì)胞趨向平衡,對(duì)AR產(chǎn)生治療作用。

    本研究還顯示,隨著血清IL-5水平的下降,IL-12水平則呈逐漸升高趨勢(shì),無論是模型組還是給藥干預(yù)組,兩者之間存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系,但是中醫(yī)藥治療本病的機(jī)理是多靶點(diǎn)多效應(yīng)的,本次所檢測的指標(biāo)僅是其治療機(jī)制的一個(gè)方面,消風(fēng)宣竅湯對(duì)AR豚鼠免疫功能調(diào)節(jié)的具體機(jī)制尚有很多問題不清楚,有待于進(jìn)一步研究和探索。

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    (2013-12-23收稿 責(zé)任編輯:曹柏)

    E ffect of X iaofeng Xuanqiao Decoction on Expression of Serum IL-5 and IL-12 in A llergic Rhinitis M odels Induced by TDI

    LiMeng,Wei Xiaoyun,Wang Shouchuan
    (Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

    Objective:To study the influence of Xiaofeng Xuanqiao decoction on behavior and cytokines in allergic rhinitismodels,and exp lore the therapeutic mechanism.Methods:Forty guinea pigs were randomized into 4 groups,normal control group,allergic rhinitis(AR)group,Xiaofeng Xuanqiao decoction group,and loratadine group.Allergic rhinitis models of guinea pigs were made by 10% TDI.Xiaofeng Xuanqiao decoction and loratadinewere applied to inAR guinea pigs.The serum levels of IL-5 and IL-12 were determined by ELISA methods.Results:Xiaofeng Xuanqiao decoction could obviously relieve the hypersensitivity and infiltrate the inflammatory cells on the nasalmucosa.The serum level of IL-5 in Xiaofeng Xuanqiao decoction group significantly decreased compared with that of AR group(P<0.01),and the serum level of IL-12 in Xiaofeng Xuanqiao decoction group significantly increased(P<0.01).There is a positive correlation between them.The therapeutic effect of Xiaofeng Xuanqiao decoction group was better than that of loratadine group.Conclusion:The therapeutic mechanism of Xiaofeng Xuanqiao decoction on allergic rhinitis is decreasing the level of IL-5 and increasing the level of IL-12,which suggests that IL-5 and IL-12 are important factors in the pathogenesis of AR.

    Xiaofeng Xuanqiao decoction;Allergic rhinitis;Cytokine;Behavior

    R-332;R285.5;R276.1

    A

    10.3969/j.issn.1673-7202.2014.07.026

    江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目-南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)一級(jí)學(xué)科“汪受傳名師名醫(yī)工作室”項(xiàng)目(編號(hào):蘇政辦發(fā)〔2011〕6號(hào))

    李萌(1987—),女,山東濰坊人,碩士研究生,研究方向:小兒肺系疾病

    汪受傳(1946—),男,碩士學(xué)位,教授,博士生導(dǎo)師,主要研究方向:小兒肺脾系疾病研究、中醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)化研究,E-mail:wscnj@126.com

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