蜈蚣三七納米粉預(yù)防大鼠術(shù)后腸粘連的機(jī)制研究

黃 欣李一鳴徐福琴何明釬邴飛虹

（1深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院普外科，深圳，518172；2湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢，430065）

實(shí)驗(yàn)研究

蜈蚣三七納米粉預(yù)防大鼠術(shù)后腸粘連的機(jī)制研究

黃 欣1李一鳴2徐福琴1何明釬1邴飛虹2

（1深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院普外科，深圳，518172；2湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢，430065）

目的：探討蜈蚣三七納米粉預(yù)防大鼠術(shù)后腸粘連的作用機(jī)制。方法：Ellis法建立大鼠術(shù)后腸粘連模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性組（肌內(nèi)注射地塞米松10mg/kg）、蜈蚣三七高、中、低劑量組（分別灌胃450、225、112 mg/kg）。術(shù)前3 d開(kāi)始給藥，術(shù)后繼續(xù)給藥1周。末次給藥后，取血清，ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，并進(jìn)行粘連程度肉眼分級(jí)。結(jié)果：與模型組比較，蜈蚣三七納米粉各劑量均能明顯改善腸粘連程度（P＜0.05或P＜0.01），均可明顯降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：蜈蚣三七納米粉可抑制炎性反應(yīng)因子的過(guò)度表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，有效預(yù)防術(shù)后腸粘連的發(fā)生。

蜈蚣三七；腸粘連；TNF-α；IL-1β；IL-6

腸粘連是腹部及盆腔手術(shù)的主要并發(fā)癥之一，發(fā)生率可高達(dá)80%～90%[1]，粘連過(guò)度會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腸梗阻，而臨床上迄今未有理想的預(yù)防術(shù)后腸粘連的方法。蜈蚣三七（又名：地烏）系毛茛科銀蓮花屬植物林蔭銀蓮花（Anemone flaccida Fr.Schmidt）的藥用根莖，其性溫，味辛微苦，具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、消腫止痛之功效[2]。蜈蚣三七主要含皂苷類成分，藥理學(xué)研究證實(shí)蜈蚣三七總皂苷具有良好的抗炎抗過(guò)敏、調(diào)節(jié)免疫等作用[3]。前期研究表明蜈蚣三七納米粉能夠預(yù)防腹腔術(shù)后腸粘連的形成[4]，本文從炎性反應(yīng)細(xì)胞因子入手，探討蜈蚣三七納米粉預(yù)防術(shù)后腸粘連的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，雌雄各半，體重（200±20）g，由華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2010-0009。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品和試劑 蜈蚣三七納米粉，由納米沖擊磨粉碎后再加工制得，顆粒小于100 nm，總皂苷含量約7%，用蒸餾水配成所需濃度。陽(yáng)性藥地塞米松磷酸鈉注射液，由天津金耀氨基酸有限公司提供，批號(hào)0912111。大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、IL-6酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。

1.3 主要儀器 CJM-SY-B型高能納米沖擊磨（秦皇島市太極環(huán)納米制品有限公司），AC100-110型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

1.4 方法

1.4.1 Ellis法制備大鼠術(shù)后腸粘連模型[5]取SD大鼠，禁食不禁水12 h后，麻醉、固定，腹部消毒，取下腹部正中切口，提出盲腸，置于紗布上約5 min，使?jié){膜干燥，以解剖刀片輕刮整個(gè)盲腸漿膜10遍，造成輕度滲血，然后以無(wú)齒鑷夾住盲腸系膜動(dòng)脈約2 min，造成暫時(shí)局部缺血。盲腸回納入腹腔原位后以止血鉗夾傷相應(yīng)腹壁，常規(guī)關(guān)腹。

1.4.2 分組與給藥 取造模成功的動(dòng)物50只，隨機(jī)分為5組，每組10只：模型組（灌胃等體積蒸餾水）、陽(yáng)性組（肌肉注射地塞米松10 mg/kg）、蜈蚣三七高、中、低劑量組（分別灌胃450、225、112 mg/kg），每組10只。另取10只大鼠開(kāi)腹后立即縫合，作為假手術(shù)組（灌胃等體積蒸餾水）。造模前給藥3 d，造模后繼續(xù)給藥，1次/d，持續(xù)1周。

1.4.3 檢測(cè)指標(biāo) 末次給藥后12 h，各組動(dòng)物進(jìn)行心臟采血，3 500 r/min離心5 min分離血清，采用雙抗體夾心ELISA法上酶標(biāo)儀檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采血后處死動(dòng)物，開(kāi)腹觀察腸粘連發(fā)生情況，并按Phillips五級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)，無(wú)粘連；I級(jí)，粘連面積小于20%，易分離；Ⅱ級(jí)，粘連面積小于40%，分離后局部漿膜稍有損傷；III級(jí)，粘連面積為40%～60%，分離后局部有損傷和滲血；Ⅳ級(jí)，粘連面積大于60%，組織粘連成團(tuán)，分離困難。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，粘連程度分級(jí)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的秩和檢驗(yàn)，炎性反應(yīng)因子組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蜈蚣三七納米粉對(duì)腸粘連程度分級(jí)的影響 假手術(shù)組有1只發(fā)生粘連，模型組動(dòng)物均發(fā)生粘連，各給藥組的部分動(dòng)物未見(jiàn)粘連或粘連程度較輕。與模型組比較，蜈蚣三七各劑量組的腸粘連程度明顯改善（P＜0.05或P＜0.01），但未呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 蜈蚣三七納米粉對(duì)血清細(xì)胞因子表達(dá)的影響模型組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高，與假手術(shù)組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。蜈蚣三七各劑量組均可明顯降低血清TNF-α、IL-1β和IL -6水平，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 各組術(shù)后腸粘連分級(jí)（例數(shù)＝10）

表2 蜈蚣三七納米粉對(duì)術(shù)后腸粘連大鼠血清炎性反應(yīng)因子表達(dá)的影響（±s，例數(shù)＝10，ng/L）

表2 蜈蚣三七納米粉對(duì)術(shù)后腸粘連大鼠血清炎性反應(yīng)因子表達(dá)的影響（±s，例數(shù)＝10，ng/L）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

IL-6組別劑量（mg/kg）TNF-αIL-1β假手術(shù)組-92.3±27.6 144.2±40.9 211.3±50.7模型組-174.0±59.8**265.5±78.6**334.2±90.5**蜈蚣三七低劑量組112 118.3±19.3△△202.8±51.7△250.5±49.9△△蜈蚣三七中劑量組225 116.4±21.5△△176.5±34.0△△238.4±50.2△△蜈蚣三七高劑量組450 130.6±50.0△180.3±45.6△△263.0±60.4△陽(yáng)性組10 110.5±31.2△△147.1±28.3△△209.1±61.0△△

3 討論

細(xì)胞因子在術(shù)后腸粘連形成中的作用正逐漸被認(rèn)識(shí)并受到重視。研究表明，由受損傷部位和腹腔液中的細(xì)胞所表達(dá)的多肽生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及其受體在調(diào)控組織愈合或粘連形成的過(guò)程中可能起關(guān)鍵的作用[7-8]。

TNF-α在損傷后的炎性反應(yīng)過(guò)程中起著較重要的作用，如刺激其他許多遞質(zhì)包括IL-1、IL-6和血小板激活因子的釋放；通過(guò)刺激黏附分子的產(chǎn)生，促進(jìn)中性粒細(xì)胞-上皮細(xì)胞間的粘連，同時(shí)增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬作用。Kaidi等研究發(fā)現(xiàn)局部和全身高水平的TNF-α在術(shù)后短時(shí)間內(nèi)與腸粘連形成的程度有顯著性聯(lián)系，可作為粘連形成的一種標(biāo)志物[9]。另?yè)?jù)報(bào)道，早期阻斷TNF-α活性有利于降低術(shù)后腸粘連的發(fā)生率[10]。IL-1是機(jī)體組織受到損傷和發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)做出急性反應(yīng)的關(guān)鍵遞質(zhì)。Saba等[11]研究表明，術(shù)后早期血清中較高水平的IL-1與術(shù)后腹膜粘連形成顯著相關(guān)，IL-l升高可作為術(shù)后發(fā)生腹膜粘連的可靠指標(biāo)。楊雁靈等[12]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用IL-1β抗體的小鼠術(shù)后腹腔粘連程度明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明抑制IL -1β的表達(dá)可預(yù)防腹膜粘連的發(fā)生。IL-6是機(jī)體對(duì)損傷做出反應(yīng)時(shí)分泌的多功能細(xì)胞因子，被認(rèn)為與許多免疫性的增殖和新生物的形成過(guò)程有關(guān)。Saba等[13]發(fā)現(xiàn)術(shù)前靜脈注射抗IL-6抗體能減少腸損傷模型大鼠粘連形成且不影響傷口愈合，認(rèn)為IL-6在刺激術(shù)后腸粘連的形成中起作用。近來(lái)的臨床研究證實(shí)，IL-6是腹腔液中的正常成分，但在許多發(fā)生術(shù)后腹腔粘連的患者中IL-6水平明顯升高[14]。

本研究觀察了蜈蚣三七納米粉對(duì)術(shù)后腸粘連大鼠血清中細(xì)胞因子表達(dá)的影響，結(jié)果表明蜈蚣三七納米粉各劑量對(duì)術(shù)后腸粘連有預(yù)防作用，能明顯改善腸粘連程度，能顯著降低血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，這與Dwivedi等[15]關(guān)于乳膠粉的研究結(jié)果一致。本室前期研究證實(shí)蜈蚣三七能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子失衡，具備良好的抗炎作用[16]，結(jié)合本文結(jié)果，提示蜈蚣三七納米粉預(yù)防術(shù)后腸粘連的機(jī)制可能與抑制炎性反應(yīng)因子的過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而減輕早期腹腔的急性炎性反應(yīng)有關(guān)。

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（2013-10-21收稿 責(zé)任編輯：王明）

Study on Mechanism of Nano-powder of Wugongsanqi in Preventing Postoperative Intestinal Adhesion in Rats

Huang Xin1，Li Yim ing2，Xu Fuqin1，He Mingqian1，Bing Feihong2
（1 Longgang People's Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518172，China；2 Key Laboratory of TCM Resource and Compound Prescription，Collegeof Pharmacy，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China）

Objective：To investigate the anti-inflammatorymechanism of nano-powder ofWugongsanqi（NW），the rhizome of Anemone flaccid，on postoperative intestinal adhesion in rats.Methods：Fifty SD rats were subjected to operation with Ellis＇method for establishing intestinal adhesion models，then random ly divided into 5 groups（n＝10），namely model，positive（Dexamethasone，i.m.10mg/kg），NW high，medium and low dose group（p.o.450，225 and 112mg/kg，respectively）.Another ten normal rats were selected as control group.Drugs were given 3 days before the operation until7 days after the operation.The intestinal adhesion was graded and the levels of TNF-α，IL-1βand IL-6 in serum were evaluated by ELISA.Results：NW evidently reduced the severity of postoperative adhesion（P＜0.05 or P＜0.01），and significantly inhibited the levels of TNF-α，IL-1βand IL-6 in serum（P＜0.05 or P＜0.01），compared with those of themodel group.Conclusion：NW could effectively prevent the formation of postoperative intestinal adhesion by inhibiting the expression of inflammatory cytokines and improving the inflammatory response.

Anemone flaccida；Intestinal adhesion；TNF-α；IL-1β；IL-6

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.023

湖北省教育廳科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：D20101802）；深圳市科技局項(xiàng)目（編號(hào)：201103249）

邴飛虹（1958—），女，博士，研究員，研究方向：中藥抗炎與免疫調(diào)節(jié)，E-mail：bingfeihong＠126.com