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    LmbB2催化酪氨酸合成左旋多巴的工藝研究

    2014-02-05 02:38:06馬強(qiáng)強(qiáng)趙廣榮
    化學(xué)工業(yè)與工程 2014年4期
    關(guān)鍵詞:左旋多巴抗壞血酸酪氨酸

    馬強(qiáng)強(qiáng),趙廣榮

    (天津大學(xué) 化工學(xué)院制藥工程系 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300072)

    左旋多巴(L-DOPA)化學(xué)名為 β-3,4-二羥苯基-α-丙氨酸(3,4-2dihydroxylphenylalanine)(圖 1),又名3-羥基-L-酪氨酸。其作用機(jī)理為左旋多巴能通過血腦屏障,到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng),在脫羧酶的作用下,轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶?,進(jìn)而發(fā)揮治療帕金森綜合癥的作用[1]。目前左旋多巴的制備方法主要有化學(xué)合成,植物提取,生物酶催化以及微生物發(fā)酵。由于化學(xué)合成和植物提取方法具有一定的局限性。20世紀(jì)60年代末,國內(nèi)外一些學(xué)者開始探索生物酶法合成左旋多巴。左旋多巴的生物合成常用的酶有兩種,其一是酪氨酸酚解酶[2],以鄰苯二酚、丙酮酸和氨水為底物,催化形成;另外一種是一種羥化酶[3],在酪氨酸的臨位羥基上直接羥化,形成左旋多巴。

    圖1 左旋多巴Fig.1 L-DOPA

    林可鏈霉菌中l(wèi)mbB2基因編碼的蛋白(LmbB2)具有酪氨酸酶的功能[4],可催化L-酪氨酸生成左旋多巴。本研究是以林可鏈霉菌的lmbB2為目的基因,連入pCDFDuet-1載體中,構(gòu)建了表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),合成了左旋多巴。并通過添加底物以及L-抗壞血酸,以提高左旋多巴的產(chǎn)量。

    1 試驗(yàn)部分

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    Streptomyces lincolnensis,大腸桿菌 Escherichia coli DH5a,E.coli BL21(DE3),本實(shí)驗(yàn)室保存;表達(dá)載體pCDFDuet-1購于 Novagen公司;pEASY-T3載體購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;左旋多巴購于上海晶純實(shí)業(yè)有限公司;酪氨酸購于上海生工生物工程有限公司。

    1.2 載體構(gòu)建

    在MS固體培養(yǎng)基上活化林可鏈霉菌,轉(zhuǎn)接在YEME培養(yǎng)基中,36 h后收獲菌絲體。根據(jù)鏈霉菌遺傳操作手冊(cè)[5],采用Kriby-mix方法提取鏈霉菌基因組DNA。利用引物lmbB2-F:GCCGGAATTCGATGAGTTCACTCGAGGCACGC(下劃線為 Eco RI酶切位點(diǎn)),lmbB2-R:GCCCAAGCTTAGCACTGCCTGACCAGGCT(下劃線為Hin dⅢ酶切位點(diǎn)),擴(kuò)增目的基因。TA克隆,轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài),測序。

    從測序正確克隆菌中提取質(zhì)粒,用 Eco RI和Hin dⅢ雙酶切,回收片段連接到雙酶切的載體pCDFDuet-1中,獲得 pCDF-lmbB2表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)感受態(tài)。

    1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

    在M9培養(yǎng)基中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的甘油,37 ℃,220 r/min,培養(yǎng) BL21(DE3)/pCDF-lmbB2重組菌。菌體培養(yǎng)至OD600≈0.5,添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo),終濃度為1 mmol/L。每4 h測定 OD600,取樣1 m L。樣品10 000 r/min離心5 min,取上清用0.22μm濾膜過濾,用HPLC檢測左旋多巴含量。

    1.4 左旋多巴的測定

    使用Agilent 6310型HPLC,二極管陣列檢測器(DAD),流動(dòng)相為乙腈/0.08%甲酸為2.4/97.6,色譜柱 C18 柱(250 ×4.0,particle size,5 μm),柱溫30℃,檢測波長280 nm,流動(dòng)相流速1 mL/min,進(jìn)樣體積10μL。

    1.5 酪氨酸的添加對(duì)發(fā)酵的影響

    酪氨酸在水中的溶解度低,為了研究酪氨酸對(duì)發(fā)酵的影響,選定培養(yǎng)基中酪氨酸濃度分別為100、200、300、400 mg/L。 菌體培養(yǎng)至 OD600≈0.5,添加IPTG誘導(dǎo),終濃度為1 mmol/L。

    1.6 L-抗壞血酸對(duì)發(fā)酵的影響

    M9培養(yǎng)基,添加0.4%甘油,酪氨酸300 mg/L。添加抗壞血酸的終濃度分別成為 100、1 000、3 000 mg/L。菌體培養(yǎng)至OD600≈0.5,添加 IPTG誘導(dǎo),終濃度為1 mmol/L。

    2 結(jié)果

    2.1 lmbB2基因表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)

    林可鏈霉菌lmbB2基因的編碼區(qū)長度954 bp,編碼產(chǎn)物L(fēng)mbB2的理論大小為31 KD。由于該基因3’-端連續(xù)GC,不能有效擴(kuò)增。為此在終止密碼下游204 bp處設(shè)計(jì)了反向引物,PCR擴(kuò)增整個(gè)片段大小為1 177 bp。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳如圖2。連接到pEASY-T3載體上,經(jīng)過酶切、測序鑒定,獲得了lmbB2基因。進(jìn)一步與pCDFDuet-1酶切連接,構(gòu)建了pCDF-lmbB2表達(dá)載體(圖3),轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài),獲得了工程菌株。

    圖2 lmbB2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Gel electrophoresis of PCR p roduct of lm bB2

    圖3 pCDF-lm bB2表達(dá)載體的酶切電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of EcoRI/H ind II digestion of pCDF-lm bB2

    IPGT誘導(dǎo)工程菌株后,LmbB2的蛋白質(zhì)電泳如圖4。LmbB2蛋白集中在上清部分,表明 lmbB2是可溶性表達(dá)。

    圖4 重組菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGE of E.coli L21(DE3)/pCDF-lm bB2

    2.2 重組菌合成左旋多巴的能力

    用M9培養(yǎng)基,IPTG誘導(dǎo)后連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)36 h,生長曲線如圖5。重組菌和對(duì)照菌(無 lmbB2基因)的生長沒有明顯差異,表明外源基因 lmbB2對(duì)菌體生長無顯著影響。左旋多巴生成曲線如圖6。發(fā)酵4 h就檢測到左旋多巴的合成,到16 h時(shí)左旋多巴的產(chǎn)量達(dá)到最大,為 37 mg/L,隨后產(chǎn)量下降。

    圖5 重組菌的生長曲線Fig.5 G row th curve of the recom bination strains

    圖6 發(fā)酵過程中左旋多巴的含量Fig.6 Concentration of L-DOPA in ferm entation p rocess

    2.3 底物酪氨酸對(duì)左旋多巴產(chǎn)量的影響

    酪氨酸是LmbB2催化的底物,直接影響左旋多巴產(chǎn)量。添加酪氨酸后,重組菌的生長速度明顯變慢(如圖7),左旋多巴的產(chǎn)量大大增加(圖8)。當(dāng)添加酪氨酸300 mg/L時(shí),發(fā)酵32 h,發(fā)酵液中左旋多巴產(chǎn)量最高,為122 mg/L,與未添加組(15 mg/L)相比,提高了8倍,酪氨酸的轉(zhuǎn)化率為40.67%。

    圖7 添加不同濃度L-酪氨酸對(duì)重組菌細(xì)胞生長的影響Fig.7 Effects of concentration of L-tyrosine on cell grow th

    圖8 添加不同濃度酪氨酸對(duì)左旋多巴的產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of concentration of L-tyrosine on yield of L-DOPA

    2.4 L-抗壞血酸對(duì)左旋多巴合成的影響

    在發(fā)酵過程中,發(fā)現(xiàn)左旋多巴的減少,伴隨著培養(yǎng)液顏色變黑,可能左旋多巴被進(jìn)一步氧化或聚合[6]。為此,添加還原劑抗壞血酸,左旋多巴的產(chǎn)量顯著增強(qiáng)(圖9),而對(duì)大腸桿菌的生長影響不明顯(圖10)。添加3 g/L抗壞血酸,發(fā)酵32 h時(shí),左旋多巴的產(chǎn)量最大,達(dá)285 mg/L,酪氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)95%。

    3 討論

    圖9 添加不同濃度抗壞血酸對(duì)左旋多巴產(chǎn)量的影響Fig.9 Effects of concentration of L-ascorbic acid on yield of L-DOPA

    圖10 添加不同濃度L-抗壞血酸時(shí)重組菌的生物量Fig.10 Effects of concentration of L-ascorbic acid on cell grow th

    酪氨酸酶通常同時(shí)具有單酚氧化酶和二酚氧化酶活性,其中單酚氧化酶催化單酚羥基化,二酚氧化酶可將二酚類化合物氧化為醌類化合物。左旋多巴不穩(wěn)定,在有氧條件下可自發(fā)氧化為多巴醌[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LmbB2可催化 L-酪氨酸轉(zhuǎn)為左旋多巴,同時(shí)繼續(xù)氧化多巴生成多巴醌,使培養(yǎng)液呈現(xiàn)黑色。為防止左旋多巴的氧化,可以加入還原劑。李華鐘等[8]報(bào)道,以磷酸吡哆醛為輔酶,酪氨酸酚解酶催化鄰苯二酚、丙酮酸和氨生成左旋多巴中,添加 Na2S2O3以及 EDTA,可以提高產(chǎn)率。本實(shí)驗(yàn)中添加Na2S2O3對(duì)LmbB2合成左旋多巴沒有效果。Seetharam等[9]在生物合成左旋多巴中使用了NADH或者羥胺。

    無論是在固定化酪氨酸酶中[10-11],還是在用菌體催化L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為左旋多巴,使用抗壞血酸效果最好。Mariam等[12]在米曲霉轉(zhuǎn)化左旋多巴的反應(yīng)體系中添加抗壞血酸,可以使酶從預(yù)先生長的菌絲體中游離出來,在體外直接參與催化活動(dòng),減少底物吸收進(jìn)入細(xì)胞的過程。Ho等[13]研究表明,添加抗壞血酸可以使反應(yīng)體系中生成的多巴醌重新還原為左旋多巴。在本實(shí)驗(yàn)中,抗壞血酸的添加效果顯著,左旋多巴大量積累。但當(dāng)抗壞血酸消耗完全之后,這種效應(yīng)消失,如圖8所示,在發(fā)酵36 h后,左旋多巴積累減少,發(fā)酵液開始變?yōu)樽睾谏?/p>

    在L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為左旋多巴的生物合成中,由于產(chǎn)物已被酶促和非酶促氧化,而不穩(wěn)定。添加抗壞血酸具有很好的穩(wěn)定作用,其效應(yīng)與轉(zhuǎn)化酶或微生物、培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件等有密切關(guān)系。本論文以300 mg/L L-酪氨酸,表達(dá) LmbB2的工程大腸桿菌,添加3.0 g/L L-抗壞血酸,37℃下發(fā)酵培養(yǎng)36 h,獲得左旋多巴的產(chǎn)量最高,是適宜的工藝條件。然而,添加抗壞血酸,增加了成本和工藝控制的復(fù)雜程度。在今后研究中,應(yīng)該從代謝工程角度,平衡細(xì)胞內(nèi)的氧化還原,開發(fā)左旋多巴的新轉(zhuǎn)化工藝。

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