• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    LmbB2催化酪氨酸合成左旋多巴的工藝研究

    2014-02-05 02:38:06馬強(qiáng)強(qiáng)趙廣榮
    化學(xué)工業(yè)與工程 2014年4期
    關(guān)鍵詞:左旋多巴抗壞血酸酪氨酸

    馬強(qiáng)強(qiáng),趙廣榮

    (天津大學(xué) 化工學(xué)院制藥工程系 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300072)

    左旋多巴(L-DOPA)化學(xué)名為 β-3,4-二羥苯基-α-丙氨酸(3,4-2dihydroxylphenylalanine)(圖 1),又名3-羥基-L-酪氨酸。其作用機(jī)理為左旋多巴能通過血腦屏障,到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng),在脫羧酶的作用下,轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶?,進(jìn)而發(fā)揮治療帕金森綜合癥的作用[1]。目前左旋多巴的制備方法主要有化學(xué)合成,植物提取,生物酶催化以及微生物發(fā)酵。由于化學(xué)合成和植物提取方法具有一定的局限性。20世紀(jì)60年代末,國內(nèi)外一些學(xué)者開始探索生物酶法合成左旋多巴。左旋多巴的生物合成常用的酶有兩種,其一是酪氨酸酚解酶[2],以鄰苯二酚、丙酮酸和氨水為底物,催化形成;另外一種是一種羥化酶[3],在酪氨酸的臨位羥基上直接羥化,形成左旋多巴。

    圖1 左旋多巴Fig.1 L-DOPA

    林可鏈霉菌中l(wèi)mbB2基因編碼的蛋白(LmbB2)具有酪氨酸酶的功能[4],可催化L-酪氨酸生成左旋多巴。本研究是以林可鏈霉菌的lmbB2為目的基因,連入pCDFDuet-1載體中,構(gòu)建了表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),合成了左旋多巴。并通過添加底物以及L-抗壞血酸,以提高左旋多巴的產(chǎn)量。

    1 試驗(yàn)部分

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    Streptomyces lincolnensis,大腸桿菌 Escherichia coli DH5a,E.coli BL21(DE3),本實(shí)驗(yàn)室保存;表達(dá)載體pCDFDuet-1購于 Novagen公司;pEASY-T3載體購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;左旋多巴購于上海晶純實(shí)業(yè)有限公司;酪氨酸購于上海生工生物工程有限公司。

    1.2 載體構(gòu)建

    在MS固體培養(yǎng)基上活化林可鏈霉菌,轉(zhuǎn)接在YEME培養(yǎng)基中,36 h后收獲菌絲體。根據(jù)鏈霉菌遺傳操作手冊(cè)[5],采用Kriby-mix方法提取鏈霉菌基因組DNA。利用引物lmbB2-F:GCCGGAATTCGATGAGTTCACTCGAGGCACGC(下劃線為 Eco RI酶切位點(diǎn)),lmbB2-R:GCCCAAGCTTAGCACTGCCTGACCAGGCT(下劃線為Hin dⅢ酶切位點(diǎn)),擴(kuò)增目的基因。TA克隆,轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài),測序。

    從測序正確克隆菌中提取質(zhì)粒,用 Eco RI和Hin dⅢ雙酶切,回收片段連接到雙酶切的載體pCDFDuet-1中,獲得 pCDF-lmbB2表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)感受態(tài)。

    1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

    在M9培養(yǎng)基中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的甘油,37 ℃,220 r/min,培養(yǎng) BL21(DE3)/pCDF-lmbB2重組菌。菌體培養(yǎng)至OD600≈0.5,添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo),終濃度為1 mmol/L。每4 h測定 OD600,取樣1 m L。樣品10 000 r/min離心5 min,取上清用0.22μm濾膜過濾,用HPLC檢測左旋多巴含量。

    1.4 左旋多巴的測定

    使用Agilent 6310型HPLC,二極管陣列檢測器(DAD),流動(dòng)相為乙腈/0.08%甲酸為2.4/97.6,色譜柱 C18 柱(250 ×4.0,particle size,5 μm),柱溫30℃,檢測波長280 nm,流動(dòng)相流速1 mL/min,進(jìn)樣體積10μL。

    1.5 酪氨酸的添加對(duì)發(fā)酵的影響

    酪氨酸在水中的溶解度低,為了研究酪氨酸對(duì)發(fā)酵的影響,選定培養(yǎng)基中酪氨酸濃度分別為100、200、300、400 mg/L。 菌體培養(yǎng)至 OD600≈0.5,添加IPTG誘導(dǎo),終濃度為1 mmol/L。

    1.6 L-抗壞血酸對(duì)發(fā)酵的影響

    M9培養(yǎng)基,添加0.4%甘油,酪氨酸300 mg/L。添加抗壞血酸的終濃度分別成為 100、1 000、3 000 mg/L。菌體培養(yǎng)至OD600≈0.5,添加 IPTG誘導(dǎo),終濃度為1 mmol/L。

    2 結(jié)果

    2.1 lmbB2基因表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)

    林可鏈霉菌lmbB2基因的編碼區(qū)長度954 bp,編碼產(chǎn)物L(fēng)mbB2的理論大小為31 KD。由于該基因3’-端連續(xù)GC,不能有效擴(kuò)增。為此在終止密碼下游204 bp處設(shè)計(jì)了反向引物,PCR擴(kuò)增整個(gè)片段大小為1 177 bp。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳如圖2。連接到pEASY-T3載體上,經(jīng)過酶切、測序鑒定,獲得了lmbB2基因。進(jìn)一步與pCDFDuet-1酶切連接,構(gòu)建了pCDF-lmbB2表達(dá)載體(圖3),轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài),獲得了工程菌株。

    圖2 lmbB2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Gel electrophoresis of PCR p roduct of lm bB2

    圖3 pCDF-lm bB2表達(dá)載體的酶切電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of EcoRI/H ind II digestion of pCDF-lm bB2

    IPGT誘導(dǎo)工程菌株后,LmbB2的蛋白質(zhì)電泳如圖4。LmbB2蛋白集中在上清部分,表明 lmbB2是可溶性表達(dá)。

    圖4 重組菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGE of E.coli L21(DE3)/pCDF-lm bB2

    2.2 重組菌合成左旋多巴的能力

    用M9培養(yǎng)基,IPTG誘導(dǎo)后連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)36 h,生長曲線如圖5。重組菌和對(duì)照菌(無 lmbB2基因)的生長沒有明顯差異,表明外源基因 lmbB2對(duì)菌體生長無顯著影響。左旋多巴生成曲線如圖6。發(fā)酵4 h就檢測到左旋多巴的合成,到16 h時(shí)左旋多巴的產(chǎn)量達(dá)到最大,為 37 mg/L,隨后產(chǎn)量下降。

    圖5 重組菌的生長曲線Fig.5 G row th curve of the recom bination strains

    圖6 發(fā)酵過程中左旋多巴的含量Fig.6 Concentration of L-DOPA in ferm entation p rocess

    2.3 底物酪氨酸對(duì)左旋多巴產(chǎn)量的影響

    酪氨酸是LmbB2催化的底物,直接影響左旋多巴產(chǎn)量。添加酪氨酸后,重組菌的生長速度明顯變慢(如圖7),左旋多巴的產(chǎn)量大大增加(圖8)。當(dāng)添加酪氨酸300 mg/L時(shí),發(fā)酵32 h,發(fā)酵液中左旋多巴產(chǎn)量最高,為122 mg/L,與未添加組(15 mg/L)相比,提高了8倍,酪氨酸的轉(zhuǎn)化率為40.67%。

    圖7 添加不同濃度L-酪氨酸對(duì)重組菌細(xì)胞生長的影響Fig.7 Effects of concentration of L-tyrosine on cell grow th

    圖8 添加不同濃度酪氨酸對(duì)左旋多巴的產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of concentration of L-tyrosine on yield of L-DOPA

    2.4 L-抗壞血酸對(duì)左旋多巴合成的影響

    在發(fā)酵過程中,發(fā)現(xiàn)左旋多巴的減少,伴隨著培養(yǎng)液顏色變黑,可能左旋多巴被進(jìn)一步氧化或聚合[6]。為此,添加還原劑抗壞血酸,左旋多巴的產(chǎn)量顯著增強(qiáng)(圖9),而對(duì)大腸桿菌的生長影響不明顯(圖10)。添加3 g/L抗壞血酸,發(fā)酵32 h時(shí),左旋多巴的產(chǎn)量最大,達(dá)285 mg/L,酪氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)95%。

    3 討論

    圖9 添加不同濃度抗壞血酸對(duì)左旋多巴產(chǎn)量的影響Fig.9 Effects of concentration of L-ascorbic acid on yield of L-DOPA

    圖10 添加不同濃度L-抗壞血酸時(shí)重組菌的生物量Fig.10 Effects of concentration of L-ascorbic acid on cell grow th

    酪氨酸酶通常同時(shí)具有單酚氧化酶和二酚氧化酶活性,其中單酚氧化酶催化單酚羥基化,二酚氧化酶可將二酚類化合物氧化為醌類化合物。左旋多巴不穩(wěn)定,在有氧條件下可自發(fā)氧化為多巴醌[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LmbB2可催化 L-酪氨酸轉(zhuǎn)為左旋多巴,同時(shí)繼續(xù)氧化多巴生成多巴醌,使培養(yǎng)液呈現(xiàn)黑色。為防止左旋多巴的氧化,可以加入還原劑。李華鐘等[8]報(bào)道,以磷酸吡哆醛為輔酶,酪氨酸酚解酶催化鄰苯二酚、丙酮酸和氨生成左旋多巴中,添加 Na2S2O3以及 EDTA,可以提高產(chǎn)率。本實(shí)驗(yàn)中添加Na2S2O3對(duì)LmbB2合成左旋多巴沒有效果。Seetharam等[9]在生物合成左旋多巴中使用了NADH或者羥胺。

    無論是在固定化酪氨酸酶中[10-11],還是在用菌體催化L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為左旋多巴,使用抗壞血酸效果最好。Mariam等[12]在米曲霉轉(zhuǎn)化左旋多巴的反應(yīng)體系中添加抗壞血酸,可以使酶從預(yù)先生長的菌絲體中游離出來,在體外直接參與催化活動(dòng),減少底物吸收進(jìn)入細(xì)胞的過程。Ho等[13]研究表明,添加抗壞血酸可以使反應(yīng)體系中生成的多巴醌重新還原為左旋多巴。在本實(shí)驗(yàn)中,抗壞血酸的添加效果顯著,左旋多巴大量積累。但當(dāng)抗壞血酸消耗完全之后,這種效應(yīng)消失,如圖8所示,在發(fā)酵36 h后,左旋多巴積累減少,發(fā)酵液開始變?yōu)樽睾谏?/p>

    在L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為左旋多巴的生物合成中,由于產(chǎn)物已被酶促和非酶促氧化,而不穩(wěn)定。添加抗壞血酸具有很好的穩(wěn)定作用,其效應(yīng)與轉(zhuǎn)化酶或微生物、培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件等有密切關(guān)系。本論文以300 mg/L L-酪氨酸,表達(dá) LmbB2的工程大腸桿菌,添加3.0 g/L L-抗壞血酸,37℃下發(fā)酵培養(yǎng)36 h,獲得左旋多巴的產(chǎn)量最高,是適宜的工藝條件。然而,添加抗壞血酸,增加了成本和工藝控制的復(fù)雜程度。在今后研究中,應(yīng)該從代謝工程角度,平衡細(xì)胞內(nèi)的氧化還原,開發(fā)左旋多巴的新轉(zhuǎn)化工藝。

    [1]Poewe W,Antonini A,Zijlmans J,et al.Levodopa in the treatment of Parkinson’s disease:An old drug still going strong[J].Clinical Interventions in Ageing,2010,5:229-238

    [2]Huang S,Shen Y,Chan H.Development of a bioreactor operation strategy for L-DOPA production using Stizolobium hassjoo suspension culture[J].Enzyme and M icrobial Technology,2002,30(6):779-791

    [3]Krishnaveni R,Rathod V,Thakur M S,et al.Transformation of L-Tyrosine to L-DOPA by a novel fungus,Acremonium rutilum under submerged fermentation[J].Current M icrobiology,2009,58(2):122-128

    [4]Neusser D,Schm idt H,Spizek J,et al.The genes lmbB1 and lmbB2 of Streptomyces lincolnensis encode enzymes involved in the conversion of L-tyrosine to propylprolane during the biosynthesis of the antibiotic lincomycin A[J].Archieve of Microbiology,1998,164(4):322-333

    [5]Kiesr T,Bibb J,Chater K,et al.Practical streptomyces genetics [M].England:John Innnes Foundation,2002

    [6]Seo SY,Sharma V K,Sharm N.Mushroom tyrosinase:Recent prospects[J].Agricultural and Food Chem istry,2003,51(10):2 837-2 853

    [7]Korner A,Pawelek J.Mammalian tyrosinase catalyzes three reactions in the biosynthesis of melanin[J].Science,1982,217(4565):1 163-1 165

    [8]李華鐘,孫偉,王樹英,等.重組大腸桿菌合成左旋多巴條件的優(yōu)化[J].工業(yè)微生物,2002,32(2):5-9 Li Huazhong,Sun Wei,Wang Shuying,et al.Optim ization of L-DOPA synthesis by recombinant E.coli[J].Industrial Microbiology,2002,32(2):5-9(in Chinese)

    [9]Seetharam G,Saville B A.L-DOPA production from tyrosinase immobilized on zeolite[J].Enzyme and M icrobial Technology,2002,31(6)747-753

    [10]Tuncagil S,Kayahan SK,Bayramoglu G,et al.L-DOPA synthesis using tyrosinase immobilized on magnetic beads[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2009,58:187-193

    [11]Surwase SN,Jadhav JP.Bioconversion of L-tyrosine to L-DOPA by a novel bacterium Bacillus sp.JPJ[J].A-mino Acids,2011,41:495-506

    [12]Mariam I,Ali S,Rehman A,et al.L-Ascorbate,a strong inducer of L-dopa(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)production from pre-grown mycelia of Aspergillus oryzae NRRL-1560[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,2010,55(3):131-137

    [13]Ho P Y,Chiou M S,Chao A C.Production of L-DOPA by tyrosinase immobilized on modified polystyrene[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2003,111(3):139-152

    猜你喜歡
    左旋多巴抗壞血酸酪氨酸
    帕金森病異動(dòng)癥與發(fā)病年齡、左旋多巴安全劑量分析
    枸骨葉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制與抗氧化作用
    薔薇花總黃酮對(duì)酪氨酸酶的抑制作用及其動(dòng)力學(xué)行為
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:19:57
    PVC用酪氨酸鑭的合成、復(fù)配及熱穩(wěn)定性能研究
    中國塑料(2016年7期)2016-04-16 05:25:52
    抗壞血酸的電化學(xué)研究
    高效液相色譜法同時(shí)測定水果蔬菜中L-抗壞血酸、D-異抗壞血酸、脫氫抗壞血酸及總維生素C的含量
    精氨酸、可樂定、精氨酸聯(lián)合左旋多巴不同激發(fā)試驗(yàn)對(duì)GH分泌的影響
    抗壞血酸-(熒光素+CTMAB+Cu2+)化學(xué)發(fā)光檢測尿液的尿酸
    左旋多巴聯(lián)合遮蓋方法治療兒童弱視102眼
    納米TiO2/抗壞血酸對(duì)真絲織物防紫外整理研究
    絲綢(2014年1期)2014-02-28 14:54:30
    午夜精品在线福利| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久久久久久久久黄片| 两个人免费观看高清视频| 亚洲精品在线观看二区| 午夜福利在线在线| 亚洲真实伦在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 又黄又粗又硬又大视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 精品免费久久久久久久清纯| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 成人手机av| 99热这里只有精品一区 | 久久久久久久久久黄片| 在线观看午夜福利视频| 精品久久久久久成人av| 老司机在亚洲福利影院| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 婷婷精品国产亚洲av| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美激情高清一区二区三区| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲专区字幕在线| www日本黄色视频网| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲人成电影免费在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美最黄视频在线播放免费| 嫩草影视91久久| 天堂√8在线中文| 成年人黄色毛片网站| 欧美大码av| 精品不卡国产一区二区三区| av在线播放免费不卡| 波多野结衣高清作品| 丁香欧美五月| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 黑丝袜美女国产一区| 精品国产亚洲在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 又紧又爽又黄一区二区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品久久久久久,| 免费电影在线观看免费观看| 日韩视频一区二区在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 人人澡人人妻人| 国产亚洲精品一区二区www| 国产黄片美女视频| 国产爱豆传媒在线观看 | 午夜影院日韩av| 变态另类丝袜制服| 99热只有精品国产| 午夜两性在线视频| 1024手机看黄色片| 搡老妇女老女人老熟妇| 长腿黑丝高跟| 亚洲九九香蕉| 又大又爽又粗| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产爱豆传媒在线观看 | 日韩精品青青久久久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲av第一区精品v没综合| www.www免费av| e午夜精品久久久久久久| 国产片内射在线| 9191精品国产免费久久| 日韩精品中文字幕看吧| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 自线自在国产av| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产私拍福利视频在线观看| 又大又爽又粗| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 十八禁网站免费在线| 欧美成狂野欧美在线观看| 免费在线观看日本一区| 午夜免费成人在线视频| 人成视频在线观看免费观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 999精品在线视频| 日韩三级视频一区二区三区| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品电影一区二区三区| 国产乱人伦免费视频| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成年女人毛片免费观看观看9| www.自偷自拍.com| 亚洲 国产 在线| 亚洲片人在线观看| 1024香蕉在线观看| 亚洲av美国av| 日韩视频一区二区在线观看| 久久久久国内视频| xxxwww97欧美| 国内精品久久久久精免费| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲全国av大片| 国产精品精品国产色婷婷| 成年女人毛片免费观看观看9| 美女国产高潮福利片在线看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲成av人片免费观看| 看片在线看免费视频| av中文乱码字幕在线| 一夜夜www| 欧美中文综合在线视频| 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲国产精品久久男人天堂| 在线永久观看黄色视频| 国产精品日韩av在线免费观看| av福利片在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| 黄色 视频免费看| 国产精品亚洲美女久久久| 一级毛片高清免费大全| 麻豆成人av在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 老熟妇仑乱视频hdxx| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久中文字幕一级| 一级作爱视频免费观看| 黄色丝袜av网址大全| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日本五十路高清| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久性视频一级片| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 91字幕亚洲| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品久久电影中文字幕| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 香蕉丝袜av| 国产精品 欧美亚洲| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 国产精品野战在线观看| 在线观看一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 看黄色毛片网站| 国产精品久久久av美女十八| 麻豆国产av国片精品| 色播在线永久视频| 国产91精品成人一区二区三区| 久9热在线精品视频| 9191精品国产免费久久| 久久亚洲精品不卡| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成年版毛片免费区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲黑人精品在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 午夜影院日韩av| 中国美女看黄片| 丁香六月欧美| 丰满的人妻完整版| 两人在一起打扑克的视频| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲 国产 在线| 99国产精品一区二区蜜桃av| 真人做人爱边吃奶动态| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲成人久久爱视频| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲av美国av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 男人舔奶头视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| netflix在线观看网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| aaaaa片日本免费| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品1区2区在线观看.| 国产91精品成人一区二区三区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 白带黄色成豆腐渣| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美中文综合在线视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99国产精品一区二区蜜桃av| netflix在线观看网站| 国产精品久久久久久精品电影 | 成人三级黄色视频| 操出白浆在线播放| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 美女高潮到喷水免费观看| 成熟少妇高潮喷水视频| av中文乱码字幕在线| 这个男人来自地球电影免费观看| 精品高清国产在线一区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| www.精华液| 国产高清视频在线播放一区| 十八禁人妻一区二区| 99精品在免费线老司机午夜| 在线观看www视频免费| 亚洲熟妇熟女久久| 99久久综合精品五月天人人| 国产视频一区二区在线看| 日韩视频一区二区在线观看| 脱女人内裤的视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲三区欧美一区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久青草综合色| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲国产精品合色在线| 国产成年人精品一区二区| 久99久视频精品免费| 无限看片的www在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久久国产成人免费| 久久久久久久久免费视频了| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 人人澡人人妻人| 欧美亚洲日本最大视频资源| 叶爱在线成人免费视频播放| 色av中文字幕| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产亚洲欧美98| 成人欧美大片| 男人舔女人的私密视频| or卡值多少钱| 人人妻人人澡人人看| 黄色毛片三级朝国网站| 国产爱豆传媒在线观看 | 最新在线观看一区二区三区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜免费鲁丝| 久久精品91蜜桃| 国产精品久久久久久精品电影 | 白带黄色成豆腐渣| 他把我摸到了高潮在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产精品综合久久久久久久免费| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产国语露脸激情在线看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品人妻1区二区| 日韩欧美免费精品| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产私拍福利视频在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 在线观看舔阴道视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 满18在线观看网站| svipshipincom国产片| www国产在线视频色| 99久久国产精品久久久| 国产精品永久免费网站| 18美女黄网站色大片免费观看| tocl精华| 国产成人啪精品午夜网站| 又紧又爽又黄一区二区| 一二三四社区在线视频社区8| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产激情欧美一区二区| 亚洲 国产 在线| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩欧美在线二视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| videosex国产| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲av美国av| xxxwww97欧美| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲精品色激情综合| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲真实伦在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 国产亚洲精品久久久久5区| 男男h啪啪无遮挡| 深夜精品福利| 黄色a级毛片大全视频| 欧美黑人精品巨大| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 午夜激情av网站| 日韩欧美免费精品| 亚洲专区字幕在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 久99久视频精品免费| 韩国av一区二区三区四区| 91成人精品电影| 午夜福利免费观看在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 中文字幕高清在线视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产av在哪里看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲欧美精品综合久久99| 在线观看www视频免费| 99国产综合亚洲精品| √禁漫天堂资源中文www| 老汉色∧v一级毛片| 午夜亚洲福利在线播放| xxx96com| 午夜福利在线在线| 男女视频在线观看网站免费 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 日本一本二区三区精品| 一区二区三区高清视频在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 最新美女视频免费是黄的| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 精品久久蜜臀av无| 亚洲精品一区av在线观看| cao死你这个sao货| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国内精品久久久久精免费| 91成人精品电影| 三级毛片av免费| 亚洲 国产 在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 观看免费一级毛片| 久久精品影院6| 淫妇啪啪啪对白视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲第一电影网av| 精品乱码久久久久久99久播| 国产精品一区二区免费欧美| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品野战在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 热re99久久国产66热| 黄色视频不卡| 看黄色毛片网站| 欧美性猛交黑人性爽| 久久久久久久久中文| 亚洲无线在线观看| 久久精品国产综合久久久| 日韩视频一区二区在线观看| 国产免费男女视频| 大型av网站在线播放| 色老头精品视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 在线观看66精品国产| 国产精品久久视频播放| 亚洲电影在线观看av| 91国产中文字幕| 在线观看www视频免费| 香蕉国产在线看| 麻豆久久精品国产亚洲av| tocl精华| 97碰自拍视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲欧美日韩无卡精品| 特大巨黑吊av在线直播 | 日本一本二区三区精品| 在线天堂中文资源库| 99精品在免费线老司机午夜| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 黄色视频不卡| 国产亚洲精品av在线| 99国产综合亚洲精品| 欧美乱色亚洲激情| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲av五月六月丁香网| 高清毛片免费观看视频网站| 黄色 视频免费看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产激情欧美一区二区| 久久久精品欧美日韩精品| 美国免费a级毛片| 亚洲av第一区精品v没综合| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 男女那种视频在线观看| 久久狼人影院| 久久精品人妻少妇| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美成狂野欧美在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产成人啪精品午夜网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美zozozo另类| www.精华液| av天堂在线播放| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产精品98久久久久久宅男小说| 嫩草影院精品99| 91老司机精品| 婷婷六月久久综合丁香| 久久久国产成人精品二区| ponron亚洲| 给我免费播放毛片高清在线观看| 伦理电影免费视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲午夜理论影院| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 国产激情欧美一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美不卡视频在线免费观看 | 男女那种视频在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 国产伦一二天堂av在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| bbb黄色大片| 国产亚洲精品第一综合不卡| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲久久久国产精品| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 这个男人来自地球电影免费观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 桃色一区二区三区在线观看| 两个人免费观看高清视频| 人人澡人人妻人| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 俺也久久电影网| 欧美一区二区精品小视频在线| 两人在一起打扑克的视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久热在线av| 亚洲av电影在线进入| 亚洲国产精品合色在线| 欧美成狂野欧美在线观看| 韩国精品一区二区三区| 99热这里只有精品一区 | 老司机靠b影院| 国产视频内射| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 99国产综合亚洲精品| 亚洲色图av天堂| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 十分钟在线观看高清视频www| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 色综合亚洲欧美另类图片| 日韩大尺度精品在线看网址| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲一区中文字幕在线| 精品欧美国产一区二区三| 成年版毛片免费区| 最近在线观看免费完整版| 久久久久亚洲av毛片大全| 精品久久久久久成人av| 天堂动漫精品| 一本大道久久a久久精品| a级毛片在线看网站| 老司机靠b影院| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 看免费av毛片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 黄色a级毛片大全视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲第一av免费看| www国产在线视频色| 自线自在国产av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 色老头精品视频在线观看| av视频在线观看入口| 曰老女人黄片| 午夜亚洲福利在线播放| 又黄又粗又硬又大视频| 听说在线观看完整版免费高清| 色播在线永久视频| 亚洲中文av在线| 一级毛片女人18水好多| 亚洲精品色激情综合| 国产精品一区二区免费欧美| av天堂在线播放| 俺也久久电影网| 成人特级黄色片久久久久久久| 成人午夜高清在线视频 | 男女午夜视频在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 韩国精品一区二区三区| 热99re8久久精品国产| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产真实乱freesex| 国产精品综合久久久久久久免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日韩欧美 国产精品| 午夜激情福利司机影院| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产视频内射| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 色av中文字幕| 欧美激情极品国产一区二区三区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久香蕉激情| av在线播放免费不卡| 国产精品电影一区二区三区| 色播亚洲综合网| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲国产精品久久男人天堂| 午夜福利免费观看在线| 欧美成人午夜精品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 国产熟女xx| 国产成人影院久久av| 午夜免费成人在线视频| 久久热在线av| 18禁美女被吸乳视频| 不卡一级毛片| 精品欧美一区二区三区在线| 日韩三级视频一区二区三区| 曰老女人黄片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品国产美女av久久久久小说| 精品卡一卡二卡四卡免费| 日韩大码丰满熟妇| 国产三级在线视频| 日本一本二区三区精品| а√天堂www在线а√下载| 悠悠久久av| 午夜久久久在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 夜夜夜夜夜久久久久| 99精品欧美一区二区三区四区| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久九九热精品免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产99久久九九免费精品| 夜夜爽天天搞| 日本五十路高清| 两个人看的免费小视频| 国产黄色小视频在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品永久免费网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产成人欧美| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 淫秽高清视频在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产97色在线日韩免费| 波多野结衣高清作品| 成年版毛片免费区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产成年人精品一区二区| 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜激情福利司机影院| 亚洲男人天堂网一区| 岛国在线观看网站| 无人区码免费观看不卡| 宅男免费午夜| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一进一出抽搐动态| 午夜免费观看网址| 又黄又粗又硬又大视频| 免费在线观看黄色视频的| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 精品欧美国产一区二区三| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久精品国产亚洲av高清一级| 曰老女人黄片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲国产精品sss在线观看| 高清在线国产一区| 国产精品九九99| 亚洲最大成人中文| 成人手机av| 免费看a级黄色片| 久久伊人香网站| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美性长视频在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 |