正交設(shè)計(jì)優(yōu)化尼美舒利NLC處方組成與制備工藝

杜廣盛，李德馨，魏振平

(1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072;2.天津天士力集團(tuán)化學(xué)藥物研究所，天津300410)

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid nanoparticles，NLC)是在固體脂質(zhì)納米粒 (solid lipid nanoparticles，SLN)基礎(chǔ)上逐漸發(fā)展起來(lái)的第二代脂質(zhì)納米粒給藥系統(tǒng)，它是以一定比例的液態(tài)油或混合脂質(zhì)代替SLN中的固體脂質(zhì)而制備出的新型固體脂質(zhì)納米粒［1-3］。

液態(tài)油脂能夠明顯的提高難溶藥物在脂質(zhì)中的溶解度，因此NLC可以有效的克服SLN中存在的固體脂質(zhì)材料結(jié)晶度高、載藥量低、貯存期間藥物容易泄漏、水分散體系含水量過(guò)大等缺點(diǎn)［4］。NLC制備方法主要包括高壓均質(zhì)法、溶劑擴(kuò)散法和微乳法等，其中高壓均質(zhì)法可以有效的避免使用有機(jī)溶劑，可處理脂質(zhì)濃度較高，并且易于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模［5］。

尼美舒利作為傳統(tǒng)的消炎鎮(zhèn)痛藥，親脂性強(qiáng)，適合作為制備脂質(zhì)納米粒的模型藥物。本研究采用高壓均質(zhì)法，以粒徑和包封率為指標(biāo)，采用單因素設(shè)計(jì)考察了處方組成和工藝條件對(duì)納米粒質(zhì)量的影響。以包封率為指標(biāo)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表優(yōu)化處方組成與制備工藝，確定了最適宜制備方案，并對(duì)所制備尼美舒利NLC制劑學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了考察。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

AB204-N萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán));XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);EMS-30超級(jí)恒溫水浴攪拌器(天津市歐諾儀器儀表有限公司);D-3L高壓均質(zhì)機(jī)(美國(guó)PhD科技有限公司);Anke TGL-20B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);KQ3200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Agilent 1260液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);S-4800 SEM掃描電鏡(日本日立公司)。

尼美舒利(天津藥物研究院);單硬脂酸甘油酯(glycerin monostearate，GMS，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);油酸(湖南爾康制藥有限公司);TPGS(陜西瑞源制藥有限公司);透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量12 000～16 000，天津市聯(lián)星生物技術(shù)有限公司);甲醇(分析純，利安隆博華天津醫(yī)藥化學(xué)有限公司);乙腈(色譜純，德國(guó)默克公司);磷酸(分析純，天津市化學(xué)試劑三廠);氨水(分析純，天津市化學(xué)試劑三廠)。

1.2 NLC制備

稱量處方量 TPGS，置于錐形瓶中，加蒸餾水40 m L攪拌使其完全溶解，置于75℃恒溫水浴磁力攪拌器中。在300 r/m in下磁力攪拌得到水相。

稱取處方量尼美舒利、油酸和單硬脂酸甘油酯(GMS)置于錐形瓶中，置于75℃恒溫水浴磁力攪拌器中，300 r/m in磁力攪拌得到油相。

在恒溫水浴75℃，300 r/m in磁力攪拌下，將水相緩慢滴加到油相中。待水相完全加入后，保持恒溫恒速攪拌15 min，得初乳。

將所得初乳在80 MPa壓力下，通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)循環(huán)4次，得到納米液。冷至室溫，即得尼美舒利NLC水分散液。

1.3 單因素考察

1.3.1 油酸與GM S投料比的考察

固定脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%(輔料與水的質(zhì)量比，下同)，TPGS 1.2 g，藥脂比1∶40，水40 m L。 按照1.2項(xiàng)下制備工藝，分別考察油酸與 GMS投料比為1∶10、2∶10、3∶10、4∶10 時(shí) NLC的粒徑和包封率。

1.3.2 脂質(zhì)用量的考察

將油酸與 GMS投料比定為3∶10，其它處方條件同1.3.1項(xiàng)下。分別考察脂質(zhì)用量為1%、2%、3%、6%、8%和10%時(shí)NLC的粒徑及包封率。

1.3.3 乳化劑用量的考察

固定脂質(zhì)用量為3%，其它條件同1.3.2項(xiàng)下，分別考察 TPGS用量為 0.4、0.8、1.2和 1.6 g時(shí)NLC粒徑及藥物包封率。

1.3.4 藥脂比的考察

固定TPGS用量為1.2 g，其它處方與工藝條件同 1.3.3 項(xiàng)下，分別考察藥脂比為 1∶120、1∶80、1∶40和1∶30時(shí)NLC粒徑和包封率。

1.3.5 高壓均質(zhì)壓力的選擇

固定脂質(zhì)用量3%，油酸與 GMS投料比為3∶10，藥脂比為 1∶40，TPGS 用量為 1.2 g，高壓均質(zhì)機(jī)循環(huán)4次，分別考察均質(zhì)壓力為 40、60、80、100 MPa時(shí)NLC的粒徑和包封率。

1.3.6 循環(huán)次數(shù)的考察

循環(huán)次數(shù)的考察:均質(zhì)壓力設(shè)為80 MPa，其它處方與工藝條件同1.3.5項(xiàng)下，分別考察循環(huán)次數(shù)為1、2、4和6時(shí)NLC的粒徑和包封率。

1.4 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化處方與制備工藝

在單因素考察基礎(chǔ)上，選擇油酸與GMS投料比(A)、藥脂比(B)、乳化劑用量(C)、高壓均質(zhì)壓力(D)4個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3水平，按L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)9組實(shí)驗(yàn)，以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最適宜處方組成和制備工藝。

1.5 NLC理化性質(zhì)考察

1.5.1 粒徑與Zeta電位測(cè)定

采用馬爾文納米粒度儀測(cè)定納米粒粒徑與Zeta電位，測(cè)定溫度設(shè)為25℃，檢測(cè)角度設(shè)為90°。樣品測(cè)前用蒸餾水適當(dāng)稀釋避免黏結(jié)，放入樣品池中檢測(cè)。每個(gè)樣品測(cè)定3次取平均值。

1.5.2 NLC形態(tài)觀察

采用掃描電鏡觀察尼美舒利NLC形態(tài)。測(cè)定前，用pH值為7.0 PBS適當(dāng)稀釋后放在銅片上自然晾干，對(duì)樣品進(jìn)行1 m in噴金處理，用掃描電鏡進(jìn)行觀察。

1.5.3 包封率測(cè)定

采用離心法測(cè)定藥物包封率。將制得的新鮮NLC在7 000 r/m in下離心15 m in后從上清液精密移取1 m L至10 m L容量瓶中，甲醇定容后超聲10 min破乳。所得乳液在3 000 r/min下離心10 min。取上清液過(guò)濾后進(jìn)樣HPLC測(cè)定尼美舒利濃度。包封率(EE)計(jì)算公式為:

其中，Wt為上清液中藥物量，W為藥物投入量。

1.5.4 尼美舒利NLC體外釋放

按照1.4項(xiàng)下確定的最適宜方案制備尼美舒利NLC，采用動(dòng)態(tài)膜透析法測(cè)定 NLC的體外釋放特性。精密移取1 m L尼美舒利NLC混懸液，置于透析袋中，將透析袋置于50 m L釋放介質(zhì)中(10%乙醇的pH 7.4 PBS)中。溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，分別于 1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 和 72 h 取出2 m L透析介質(zhì)，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)液相檢測(cè)濃度。同時(shí)補(bǔ)加同等體積的同溫釋放介質(zhì)。另精密稱取18.5 mg尼美舒利原料藥，置于25 m L容量瓶中，用甲醇定容。采用同等方法測(cè)定體外釋放情況作為對(duì)照。第n個(gè)點(diǎn)的累積釋放率為:

其中m為所加樣品中藥物質(zhì)量，Cn為第n個(gè)點(diǎn)的藥物濃度。

1.6 HPLC檢測(cè)尼美舒利含量

尼美舒利含量采用反相液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。采用的色譜柱為Capcell PAK C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫設(shè)為25℃;進(jìn)樣量為 20μL;流動(dòng)相為0.1%H3PO4(氨水調(diào)節(jié)pH值為7.0)∶乙腈=60∶40，流速為 1.0 m L/min，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為230 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察

2.1.1 油酸與GM S投料比的選擇

固液態(tài)脂質(zhì)投料比對(duì)納米粒質(zhì)量的影響見(jiàn)表1。

表1 油酸與GM S投料比的考察(n=3)Table 1 Study of feed ratio of oleic acid to GM S(n=3)

隨著油酸用量的增加，尼美舒利NLC粒徑?jīng)]有明顯的變化。這是因?yàn)樵谔幏酱_定的情況下，NLC的粒徑主要受熔融脂質(zhì)的黏度影響。而油酸用量的變化對(duì)熔融脂質(zhì)黏度影響不大，因此粒徑變化較?。?］。

包封率隨著油酸用量增大先升高后降低。這是因?yàn)橛退嵊昧吭龃髸r(shí)提高了藥物在混合脂質(zhì)中的溶解度，使包封率提高。當(dāng)油酸用量過(guò)大時(shí)，可能導(dǎo)致油酸較多的分散在納米粒表層，使藥物分散到水相的速度加快，導(dǎo)致包封率降低［7］。

2.1.2 脂質(zhì)用量的考察

脂質(zhì)用量對(duì)納米粒質(zhì)量的影響見(jiàn)表2。

表2 脂質(zhì)用量的考察(n=3)Table 2 Study of am ount of lipid(n=3)

隨著脂質(zhì)用量的增加，粒徑有增加的趨勢(shì)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［8］。隨著脂質(zhì)用量增加，脂質(zhì)對(duì)藥物的溶解能力增強(qiáng)，使包封率升高。當(dāng)脂質(zhì)用量過(guò)大時(shí)，樣品黏度增大，高壓均質(zhì)機(jī)處理效果下降。從而使得藥物無(wú)法充分包裹進(jìn)入脂質(zhì)中，使包封率降低。

2.1.3 乳化劑用量的考察

TPGS用量對(duì)NLC粒徑和包封率的影響見(jiàn)表3。

表3 TPGS用量對(duì)納米粒粒徑和包封率的影響(n=3)Table 3 In fluence of am ount of TPGS on par ticle size and entrapm en t efficiency of nanoparticles(n=3)

隨著TPGS用量的增加，尼美舒利NLC粒徑由152.5±2.5 nm降到 132.5±1.7 nm，包封率由42.35±1.28%升高到77.66±0.85%。TPGS覆蓋到新產(chǎn)生的納米粒子表面，可以降低表面張力，利于粒子的分離。因此TPGS用量增大時(shí)可以降低納米粒粒徑。但是用量過(guò)大時(shí)可能會(huì)在水相中形成膠束，增加尼美舒利的溶解度，導(dǎo)致包封率降低［9］。

2.1.4 藥脂比的考察

藥脂比對(duì)NLC粒徑和包封率的影響見(jiàn)表4。

表4 藥脂比考察(n=3)Table 4 Study of ratio of drug to lip id(n=3)

由表4可知，藥物用量變化并沒(méi)有對(duì)NLC粒徑造成明顯的影響。包封率隨著藥物用量的增加先升高后降低。這是因?yàn)樗幬镉昧枯^低時(shí)，溶解在水相中的藥物所占比例較大，導(dǎo)致藥物包封率較低。而當(dāng)藥物用量較高時(shí)，藥物量超過(guò)了混合脂質(zhì)的容納能力，導(dǎo)致包封率較低。

載藥量是評(píng)價(jià)一種劑型的重要指標(biāo)。傳統(tǒng)SLN受限于藥物在固態(tài)脂質(zhì)的溶解度較低而導(dǎo)致載藥量較低。本研究中制備的新型NLC由于油酸對(duì)藥物溶解度較高，能比較好的改善納米粒的載藥量。

2.1.5 高壓均質(zhì)壓力的考察

均質(zhì)壓力對(duì)NLC粒徑及包封率的影響見(jiàn)表5。

表5 均質(zhì)壓力對(duì)NLC粒徑及包封率的影響(n=3)Table 5 In fluence of hom ogenization p ressure on particle size and en trapm ent efficiency of NLC(n=3)

隨著壓力的增大，粒徑顯著的降低，而包封率顯著的升高。但是過(guò)高的均質(zhì)壓力并不能繼續(xù)改善粒徑與包封率。這可能是因?yàn)閴毫^(guò)高時(shí)，粒子動(dòng)能過(guò)大，容易發(fā)生聚集而使粒徑增大包封率降低［10］。另外，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，均質(zhì)壓力超過(guò) 120 MPa時(shí)，會(huì)超出高壓均質(zhì)機(jī)的安全工作范圍，產(chǎn)生漏液。因此，高壓均質(zhì)機(jī)的壓力選擇是綜合考慮制備效果、安全性和經(jīng)濟(jì)性的綜合結(jié)果。

2.1.6 循環(huán)次數(shù)的考察

均質(zhì)循環(huán)次數(shù)對(duì)納米粒粒徑和包封率的影響見(jiàn)表6。

表6 高壓均質(zhì)次數(shù)對(duì)NLC粒徑以及包封率的影響(n=3)Table 6 In fluence of cycle tim es on par ticle size and entrapm ent efficiency of NLC(n=3)

過(guò)高或過(guò)低的均質(zhì)次數(shù)都會(huì)增加NLC的粒徑或者降低包封率。這是因?yàn)榫|(zhì)次數(shù)過(guò)少時(shí)，樣品沒(méi)有得到充分的處理，并且包含微米級(jí)顆粒，導(dǎo)致粒徑與包封率結(jié)果較差，粒徑分布較寬。當(dāng)增加均質(zhì)次數(shù)時(shí)，樣品被充分處理，粒徑分布較窄。這與以前的文獻(xiàn)報(bào)道相一致［11］。但是當(dāng)均質(zhì)次數(shù)過(guò)多時(shí)，與壓力過(guò)高類(lèi)似會(huì)導(dǎo)致納米粒子動(dòng)能較高，發(fā)生聚集，從而使粒徑增大且包封率降低。

2.2 正交設(shè)計(jì)考察結(jié)果

2.2.1 因素水平的確定

在以上單因素考察的基礎(chǔ)上，選定油酸和GSM投料比(A)、藥脂比(B)、TPGS用量(C)和均質(zhì)壓力(D)為正交設(shè)計(jì)考察的因素。因素水平表見(jiàn)表7。

表7 因素水平表Table 7 Factors and levels

2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表安排9組實(shí)驗(yàn)，以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察各因素對(duì)指標(biāo)的影響，確定最優(yōu)處方。其它處方與工藝條件為脂質(zhì)用量為3%，水用量為40 mL，制備初乳溫度為75℃，均質(zhì)次數(shù)為4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 Resu lts of or thogonal design

在表8中，R表示極差，R越大表明各因素的影響越大。由R的結(jié)果可知各因素對(duì)納米粒包封率的影響程度相對(duì)大小為B＞A＞C＞D。另外，最優(yōu)的因素水平組合為A2-B2-C3-D3，即油酸和 GSM投料比為 3∶10，藥脂比為 1∶40，TPGS 用量為 1.4 g，均質(zhì)壓力為90 MPa。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

因?yàn)樽钸m宜組合不在正交設(shè)計(jì)里的9組實(shí)驗(yàn)中，故需要做實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。即以A2-B2-C3-D3處方條件安排實(shí)驗(yàn)，測(cè)定NLC粒徑和包封率。所得結(jié)果為粒徑132.6±1.4 nm，包封率為82.35±1.23%。

2.3 Zeta電位測(cè)定

Zeta電位與納米粒體系的穩(wěn)定性密切相關(guān)。Zeta電位絕對(duì)值越大，表明體系穩(wěn)定性越好。按照最適宜制備方案制備3批尼美舒利NLC，測(cè)得Zeta電位為-14.5±1.2 mV，表明所制備粒子表面荷負(fù)電，體系比較穩(wěn)定。

2.4 形態(tài)學(xué)觀察

按照最適宜處方制備尼美舒利NLC，用掃描電鏡觀察納米粒形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖1。所制備納米粒類(lèi)球形，粒徑比較均勻。

圖1 掃描電鏡結(jié)果Fig.1 Result of SEM

2.5 體外釋放情況

釋放試驗(yàn)所得結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 體外釋放實(shí)驗(yàn)Fig.2 Results of in vitro release

藥物溶液在8 h內(nèi)即已接近完全釋放，而載藥NLC在前10 h累積釋放率為63.58%，隨后緩慢釋放，最終在72 h時(shí)釋放達(dá)93.14%。由此推測(cè)，有部分藥物分布在納米球的表面，很快釋放出來(lái)。而位于納米球骨架內(nèi)部的藥物則通過(guò)擴(kuò)散釋放或者隨著納米球骨架溶蝕釋放的方式緩慢的釋放出來(lái)。

采用Higuchi模型擬合前24 h體外釋放曲線，得擬合曲線Q=0.162 t1/2+0.049，r=0.991。表明體外釋放行為較符合Higuchi模型，這與有關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道較為一致［8］。

3 結(jié)論

本研究采用高壓均質(zhì)法制備了加載尼美舒利的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，采用單因素和正交設(shè)計(jì)考察處方與工藝因素對(duì)納米粒質(zhì)量的影響。結(jié)果表明對(duì)包封率影響程度的相對(duì)大小為:藥脂比＞油酸與GMS投料比＞TPGS用量＞均質(zhì)壓力。確定的最適宜處方為油酸與 GMS投料比為3∶10，藥脂比為1∶40，TPGS用量為 1.4 g，均質(zhì)壓力為90 MPa。 依據(jù)最適宜處方制備的納米粒粒徑為132.6±1.4 nm，包封率為82.35±1.23%。

所制備N(xiāo)LC呈類(lèi)球形，粒徑較為均勻。體外釋放實(shí)驗(yàn)顯示其具有先快速后緩慢釋放的釋藥特性，體外釋放曲線符合Higuchi模型。

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