他克莫司微生物合成的研究進展

萬濤，黃笛，聞建平

(天津大學(xué)化工學(xué)院，系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津300072)

他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K-506)是由筑波鏈霉菌(Streptomyces tsukubaensis)發(fā)酵產(chǎn)生的一種由二十三元環(huán)組成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。他克莫司廣泛應(yīng)用于特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、銀屑病、紅斑狼瘡、扁平苔癬、白癜風(fēng)、Nethenton綜合癥和抑制宿主病等自身免疫疾病的治療［1］。他克莫司商品名為Protopic，于1994年被美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，是治療特異性皮炎早期緩解和長期控制的非甾體類藥物［2］，目前臨床應(yīng)用于預(yù)防肝臟或腎臟移植術(shù)后的移植物排斥反應(yīng)，治療肝臟、胰腺、腎臟、心臟、肺等實體器官移植術(shù)后應(yīng)用其他免疫抑制藥物無法控制的移植物排斥反應(yīng)。由于在臨床效果免疫抑制作用比環(huán)孢素A強10～100倍，因而大大降低了臨床使用劑量，同時不良反應(yīng)也明顯降低。他克莫司市場大部分被歐美國家占領(lǐng)，開發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的他克莫司生產(chǎn)技術(shù)十分必要。

本論文主要對他克莫司的理化特征和免疫抑制活性、他克莫司微生物發(fā)酵、合成基因簇的研究成果和前體代謝工程的研究狀況進行了綜述，同時結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)對他克莫司的生產(chǎn)及其基因組尺度代謝工程改造進行了展望。

1 他克莫司的理化特征和免疫抑制活性

他克莫司是從鏈霉菌屬(Streptomyces)中分離出的發(fā)酵產(chǎn)物，包括 Streptomyces tsukubaensis，Streptomyces tacrolim icus，Streptomyces sp.ATCC 53770，Streptomyces sp.MA6949，Streptomyces kanamyceticus KCC-S0436，Streptomyces glaucescens，Streptomyces clavuligerus CKD1119。他克莫司是一種很有效的23元大環(huán)內(nèi)酯類新型免疫抑制劑，分子式是 C44H69NO12，相對分子質(zhì)量為804.02，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1，在常溫下為無色晶體，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿和丙酮等有機溶劑。熔點為127～129℃，在不同貯存條件下穩(wěn)定性都較高［2］。

圖1 他克莫司(FK 506)分子式Fig.1 Form u la of Tacrolim us(FK 506)

研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司可以有效抑制T淋巴細胞的誘導(dǎo)作用，能夠抑制淋巴因子 IL-2，IL-3，IFN-Y的產(chǎn)生和IL-2受體的表達，同時他克莫司抑制了ConA活性和相同抗原誘導(dǎo)的淋巴細胞活化，以及淋巴細胞的增殖反應(yīng)［3］。體內(nèi)實驗也證明他克莫司在免疫抑制方面有良好表現(xiàn)，它可以延長大鼠及狗的心臟、肝臟、腎臟和肢體等抑制器官的存活期，雖然抑制效果與與藥物濃度存在相關(guān)性，但藥物劑量過大會產(chǎn)生一定的副作用。小劑量的環(huán)孢霉素或強的松在與他克莫司共同使用時，可以降低他克莫司的用量，從而減弱其產(chǎn)生的毒性，進而增強其免疫抑制作用。臨床發(fā)現(xiàn)，他克莫司能夠明顯減少腎臟移植后出現(xiàn)的急慢性排斥反應(yīng)發(fā)病率，改善手術(shù)后腎臟的功能，并且降低高血脂和高血壓等病癥的發(fā)生率［3］。除此之外，他克莫司還被證實具有很好的抑制炎癥作用［4］，以及抑制人的肺肥大細胞或嗜堿性細胞的組胺或LTC4等炎癥介質(zhì)的釋放。多種炎癥性皮膚病的炎癥介質(zhì)為組胺和前列腺素D2，小劑量他克莫司可以抑制免疫球蛋白E激活人體皮膚肥大細胞釋放組胺和前列腺素D2。

2 他克莫司的微生物發(fā)酵生產(chǎn)

由于他克莫司的重要醫(yī)用價值，很多人嘗試著用培養(yǎng)基優(yōu)化的方法提高他克莫司的產(chǎn)量。1984年，日本藤澤公司研究所從日本筑波山土壤中分離的筑波鏈霉菌的發(fā)酵液中提取得到他克莫司的發(fā)酵產(chǎn)率很低，優(yōu)化發(fā)酵條件之后，產(chǎn)率提高了10倍多。之后，進行了菌株的改良和發(fā)酵條件的進一步優(yōu)化，生產(chǎn)能力提高了幾十倍。1991年，Merck公司對菌株經(jīng)過優(yōu)化后，他克莫司7 d達到37.8 mg/L。Kumar等［5］從土壤中篩選出一株鏈霉菌，他克莫司產(chǎn)量較高而且副產(chǎn)物極少，誘變后發(fā)酵300 h他克莫司產(chǎn)量最高為5～10 mg/L，該研究組之后在高通氣量的糊精培養(yǎng)基中通過補料分批發(fā)酵192～279 h，產(chǎn)量達到 300 ～310 mg/L［6］。

Yoon等［7］研究了初始培養(yǎng)基中添加磷酸鹽、銨鹽和氨基酸等對菌種合成他克莫司的影響，發(fā)現(xiàn)銨離子的添加雖然可以刺激菌絲生長、提高葡萄糖和磷酸鹽吸收速率，但是對他克莫司合成具有阻遏作用，最終利用30 mmol/L的亮氨酸和24.5 mmol/L的乳酸為初始碳源，將他克莫司的產(chǎn)量由12.7 mg/L提高到了18.2 mg/L。Kim等［8］通過向初始培養(yǎng)基中添加3 g/L玉米油，發(fā)酵8 d將他克莫司的產(chǎn)量由145 mg/L提高到了235 mg/L。該研究還考察了他克莫司發(fā)酵過程中脂肪酶的酶活性變化，指出該酶在玉米油的誘導(dǎo)下合成，并且在添加葡萄糖后明顯被抑制，證實脂肪酶與他克莫司發(fā)酵單位成正相關(guān)，暗示高的脂肪酶活性成為他克莫司合成過程中的重要因子，同時也證明了油脂作為前體的重要性。他們通過在200 L發(fā)酵罐放大后最高產(chǎn)量達到495 mg/L，比生產(chǎn)單位也達到0.34 g/g菌體干重。Singh等［9］研究了外源添加花生油、大豆油、棉籽油和氨基酸對于菌種Streptomyces spp.MA6858 B3178合成他克莫司的影響，外源添加30 g/L大豆油和0.2 g/L的賴氨酸，發(fā)酵5 d時產(chǎn)量由85.8 mg/L提高到103.1 mg/L。同時，該研究還得出他克莫司在不同碳源發(fā)酵條件下呈現(xiàn)雙階段行為---在開始24 h單糖主要用來合成菌體，36 h后豆油和賴氨酸添加不僅維持菌體生長，還提高了產(chǎn)物生成，并且培養(yǎng)基pH值起到關(guān)鍵作用。Jung等［10］通過逐漸提高培養(yǎng)基中他克莫司的濃度(600～1 600 mg/L)來增加菌株對產(chǎn)物的耐受性，最終獲得的菌株產(chǎn)量達到972 mg/L。

目前，國內(nèi)研究他克莫司主要圍繞自然篩選，原始菌株誘變篩選，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵操作條件等。李玲等［11］采用抑菌圈法初篩得到71株能抑制白色假絲酵母生長的菌株，高效液相色譜法檢測代謝產(chǎn)物復(fù)篩，獲得一株他克莫司產(chǎn)生菌株。王秀琴等［12］采用通過復(fù)合誘變的方法對出發(fā)菌株筑波鏈霉菌08-6-9進行處理，得到一株高產(chǎn)菌株，其搖瓶發(fā)酵水平較出發(fā)菌株提高73.6%。鄭軍榮等［13］應(yīng)用化學(xué)和物理誘變劑對他克莫司產(chǎn)生菌進行菌種誘變，并利用特定的選擇劑(莽草酸和哌可酸及其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)類似物)作為選擇壓力篩選出高產(chǎn)突變株，相對發(fā)酵效價比出發(fā)菌株提高了約2倍。劉忠［14］通過正交試驗優(yōu)化了他克莫司產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，考察了不同的發(fā)酵條件對他克莫司合成的影響，研究發(fā)現(xiàn)，在5 m3發(fā)酵罐上發(fā)酵144 h他克莫司的的產(chǎn)量可以達到330 mg/L。

3 他克莫司合成基因簇及其代謝途徑

他克莫司結(jié)構(gòu)復(fù)雜，內(nèi)酯環(huán)由5個甲基丙二酰、2個丙二酰、2個甲氧基丙二酰和1個烯丙基丙二酰延伸單元組成，環(huán)外的環(huán)己烷來自分支酸，哌可酸來自賴氨酸，甲氧基來自甲硫氨酸。目前，他克莫司生物合成基因簇基因產(chǎn)物的功能已基本得到闡明［15-17］，他克莫司總的合成過程如圖 2所示，由聚酮合酶(PKS)開始聚合前體物，PKS包括 3個部分---FkbB負責(zé)分支酸衍生物4，5-二羥基-1-烯基環(huán)己烷羧酸(DHCHC)以及4個延伸單位(2個甲基丙二酰輔酶A，1個丙二酰輔酶A，1個烯丙基丙二酰輔酶A)的連接和縮化;FkbC有2個延伸單位(2個甲基丙二酰輔酶A);FkbA有2個延伸單位(2個甲氧基丙二酰輔酶 A，1個甲基丙二酰輔酶 A，1個丙二酰輔酶A)。每個延伸單元伴隨特別的β-酮基延伸步驟，聚酮鏈也對應(yīng)增長。FkbA、FkbB和FkbC組成了I型PKS系統(tǒng)，每個模塊單元包含了幾個酶結(jié)構(gòu)體:酮酰合酶(KS)，?；D(zhuǎn)移酶(AT)，?；d體蛋白(ACP)，他們用于鏈延伸，同時部分含有脫水酶(DH)，烯酰還原酶(ER)，酮基還原酶(KR)(圖2)。PKS合成的中間體與FkbP肽合酶催化的哌克酸縮合、成環(huán)。在PKS復(fù)合體釋放后，13元環(huán)進入后修飾過程，C9位被FkbD氧化成酮基官能團，C31位被 FkbM甲基化(圖2)。當(dāng) C21位 R官能團為甲基，即他克莫司插入的烯丙基丙二酰輔酶A被乙基丙二酰輔酶A替換時生成產(chǎn)物為子囊霉素(FK520)。當(dāng)C21位R官能團雙鍵被加氫，則產(chǎn)物為雙氫他克莫司(FK506D)。

他克莫司生物合成基因簇已經(jīng)被測序并從實驗證實了各個基因所具有的功能，其中，fkbA、fkbB和fkbC負責(zé)延伸單元的連接和縮化，形成內(nèi)酯環(huán);fkbL負責(zé)哌可酸的生物合成;fkbP負責(zé)哌可酸與內(nèi)酯環(huán)連接;tcsA、tcsB、tcsC和 tcsD負責(zé)烯丙基丙二酰輔酶A的生物合成;fkbD負責(zé)他克莫司C9的羥基化、氧化，產(chǎn)生 β-羰基酰胺，fkbM負責(zé) C31的羥基甲基化;fkbG、fkbH、fkb I、fkbJ和 fkbK負責(zé)甲氧基丙二酰輔酶A的合成;合成起始單元DHCHC是從由分支酸經(jīng)過fkbO轉(zhuǎn)化而來［18］(圖3)。他克莫司的生物合成過程是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程，要求一個高效的調(diào)控機制來保證初級代謝的前體供應(yīng)，以及在PKS上的結(jié)合與催化和PKS的后修飾過程。除參與合成的必需基因外，在基因簇的兩端還發(fā)現(xiàn)幾個ORF。通過基因序列相似性分析，發(fā)現(xiàn) tcs2、tcs7、fkbN編碼的蛋白分別與AsnC、LysR、LAL家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子序列高度一致，推測可能起調(diào)控作用。Mo等［19］通過基因過表達、敲除與回補實驗，發(fā)現(xiàn) tcs2對他克莫司的合成不起作用，敲除或者過表達后都沒有影響產(chǎn)量;tcs7起負調(diào)控作用，敲除后他克莫司和副產(chǎn)物子囊霉素產(chǎn)量提高了1.9和1.7倍;fkbN起正調(diào)控作用，調(diào)控因子對他克莫司的合成是必需的，敲除后菌株失去合成能力。

4 他克莫司菌株代謝工程

4.1 他克莫司前體代謝工程改造及競爭途徑敲除

圖2 他克莫司PKS和生物合成結(jié)構(gòu)類似物過程［16］Fig.2 Schem atic rep resen tation of the PKS and biosynthesis of tacrolim us and its derivatives［16］

圖3 他克莫司生物合成基因簇［16］Fig.3 O rganization of tacrolim us's biosynthetic gene clusters［16］

在前面的介紹中提到，他克莫司由10個輔酶A縮合而成，因此提高這些輔酶A前體的合成水平可以直接提高他克莫司的產(chǎn)量。其中，甲基丙二酰輔酶A合成途徑有4條:由甲基丙二酰輔酶A變位酶催化的琥珀酰輔酶A異構(gòu)化;通過丙酰輔酶A羧化酶對丙酰輔酶A的羧化反應(yīng)實現(xiàn);來自纈氨酸代謝產(chǎn)生的異丁酰輔酶A的多步氧化;丙二酰輔酶A/甲基丙二酰輔酶A連接酶途徑。為了提高前體甲基丙二酰輔酶A的胞內(nèi)水平，Mo等［20］研究發(fā)現(xiàn)，對原始菌株表達異源基因甲基丙二酰輔酶A連接酶和差向異構(gòu)酶，丙酰輔酶 A羧化酶和丙酰輔酶 A合酶，他克莫司水平并沒有提高，但是在過表達甲基丙二酰輔酶A變位酶后胞內(nèi)甲基丙二酰輔酶A和他克莫司濃度分別提高3.0和1.5倍。Chen等［15］對他克莫司合成的2個稀有前體烯丙基丙二酰輔酶A和甲氧基丙二酰輔酶A合成途徑分別過表達，發(fā)現(xiàn)他克莫司從46.9 mg/L分別提高到95.7和61.3 mg/L，分別提高了100%和30%。在同一株菌株過表達兩個途徑后產(chǎn)量提高到105.9 mg/L，提高了接近125%。

4.2 系統(tǒng)生物學(xué)指導(dǎo)下的他克莫司目標(biāo)基因改造

由于他克莫司前體較多，通過多條途徑合成，主要涉及到糖代謝、氨基酸代謝和脂肪代謝，受到細胞內(nèi)還原力、能量供應(yīng)的制約，而且涉及到胞內(nèi)調(diào)控基因的時序性表達，而單純的基因工程操作存在不確定性高、且通常只考慮單一的代謝途徑，包含整個細胞內(nèi)所有的基因-蛋白-反應(yīng)關(guān)系也只是從化學(xué)計量角度分析，不能體現(xiàn)細胞基因所有調(diào)控功能以及反映出的真實動態(tài)胞內(nèi)代謝特性和生物性狀，對于實現(xiàn)微生物生理代謝功能的理性全局性調(diào)控水平很有限，很難找到目標(biāo)基因以及更深層次的目標(biāo)酶/酶系研究，因此開展他克莫司產(chǎn)生菌基因組尺度動態(tài)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析進而改造目的基因、目標(biāo)酶/酶系顯得尤為重要。

隨著基因組測序為代表的大規(guī)模數(shù)據(jù)產(chǎn)出，傳統(tǒng)的生物學(xué)研究方式正在發(fā)生改變，在基因組測序和注釋海量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，基因組尺度穩(wěn)態(tài)代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)迅速發(fā)展起來［21］。基因組尺度穩(wěn)態(tài)代謝網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)成為研究微生物代謝系統(tǒng)不可缺少的工具［22-23］，在設(shè)計代謝工程經(jīng)典途徑、代謝物合成、代謝通量分析、不同物種代謝途徑之間的進化分析、挖掘組學(xué)數(shù)據(jù)信息以及選擇酶工程靶標(biāo)物方面都具有重要的應(yīng)用［24］。 本課題組［25］對目標(biāo)產(chǎn)物他克莫司采用了基于基因組尺度擬穩(wěn)態(tài)的代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并通過穩(wěn)態(tài)代謝通量分析，OptKnock敲除模擬準(zhǔn)確預(yù)測出能提高菌株他克莫司產(chǎn)量的目標(biāo)基因，確定對他克莫司生物合成重要的關(guān)鍵酶;通過分子改造實驗驗證了模型預(yù)測，構(gòu)建代謝工程菌株產(chǎn)量由150 mg/L提高到450 mg/L。

5 結(jié)語

目前，對他克莫司的生物合成研究正在朝著多尺度、系統(tǒng)化、合成生物學(xué)的方向發(fā)展。對模式微生物(如天藍色鏈霉菌)的代謝網(wǎng)絡(luò)、基因調(diào)控的深入研究，為研究筑波鏈霉菌提高他克莫司產(chǎn)量提供了借鑒意義;隨著合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，動態(tài)分析他克莫司的合成及調(diào)控途徑，使菌株合成基因能適時表達成為可能。

1)對他克莫司生產(chǎn)菌的研究應(yīng)采用系統(tǒng)生物學(xué)的技術(shù)手段，以整個細胞網(wǎng)絡(luò)作為優(yōu)化目標(biāo)，利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組以及代謝組分析，在基因組規(guī)模上做動態(tài)分析菌體合成能力將對遺傳調(diào)控信號和環(huán)境擾動的響應(yīng)，將有利于揭示菌體的遺傳機理，也將深入理解他克莫司生物合成的調(diào)控機制，如:轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯調(diào)控、反饋抑制和代謝流的分布，實現(xiàn)在菌體細胞內(nèi)調(diào)控元件之間的優(yōu)化磨合對接，極大地提升模型預(yù)測的能動性和精確度，篩選出關(guān)鍵限速節(jié)點，為已有的他克莫司產(chǎn)生菌進一步進行代謝工程改造提供指導(dǎo)。

2)對他克莫司關(guān)鍵基因的合成生物學(xué)研究為開發(fā)具有更優(yōu)性質(zhì)的合成基因指明了方向。合成生物學(xué)倡導(dǎo)將不同的代謝途徑組成“模塊”，各“模塊”之間按照統(tǒng)一的“接口”進行連接并表達相應(yīng)的新途徑。他克莫司合成機制的闡明及基因組序列的公布，為合成高效前體途徑關(guān)鍵酶提供了新的有效突破口，從而理性重構(gòu)合成途徑，使菌株最高效地合成目的產(chǎn)物。隨著合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，采用全新酶的模擬優(yōu)化對接進行全新設(shè)計、改造及優(yōu)化，在不久的將來，可以根據(jù)目的不同構(gòu)建全新高效的關(guān)鍵酶。

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