逍遙散對阿爾茨海默病大鼠海馬CA3區(qū)PP-2A、GSK-3β表達的影響①

趙唯賢 李高申 王保偉 李宜培 劉建濤 郭梅珍 劉俊玲(河南醫(yī)學高等?？茖W校，鄭州451191)

·中醫(yī)中藥與免疫·

逍遙散對阿爾茨海默病大鼠海馬CA3區(qū)PP-2A、GSK-3β表達的影響①

趙唯賢 李高申②王保偉 李宜培 劉建濤 郭梅珍②劉俊玲③(河南醫(yī)學高等?？茖W校，鄭州451191)

目的:探討逍遙散對阿爾茨海默病大鼠海馬CA3區(qū)PP-2A、GSK-3β表達的影響。方法:將清潔級大鼠隨機分為4組，其中模型組、西藥組、中藥組均采用D-gal腹腔注射和A-β 1～42 peptide雙側(cè)海馬注射聯(lián)合造模，生理組僅采用等體積滅菌生理鹽水腹腔及海馬注射造模。造模完成后，生理組、模型組均用生理鹽水灌胃，西藥組和中藥組分別用奧拉西坦溶液和逍遙散煎劑灌胃，四組灌胃體積均為5 ml/kg，每日1次，連續(xù)28 d。灌胃結束后即分離鼠腦，分組標記放入4℃ 4%戊二醛固定液玻璃容器密封，4℃保存。修塊，切取海馬區(qū)組織，石蠟包埋，切片。PP-2A稀釋度為1∶200，GSK-3β稀釋度為1∶150。圖像采用Image-pro Plus 5.0分析系統(tǒng)分析，數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析，4組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。結果:PP-2A陽性細胞數(shù)、平均光密度及陽性面積、積分光密度等指標的表達，在逍遙散灌胃干預后與模型組比較明顯增加(P＜0.01);GSK-3β以上各項指標在經(jīng)逍遙散灌胃后較模型組明顯減少(P＜0.01)。結論:逍遙散可以上調(diào)PP-2A表達和下調(diào)GSK-3β表達，可能對凝聚態(tài)A-β 1～42 peptide誘導的海馬Tau蛋白過度磷酸化有一定的抑制作用。

逍遙散;阿爾茨海默病;海馬CA3區(qū);蛋白磷酸酶-2A;糖原合成酶激酶-3β

阿爾茨海默病(Alzheimer′s diseas，AD)即老年性癡呆，是以進行性認知障礙及記憶能力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。海馬CA3區(qū)是學習記憶的關鍵腦區(qū)[1]，也是易受衰老影響的腦區(qū)之一。本課題以SD大鼠腹腔注射D-半乳糖(D-gal)和海馬注射A-β 1～42 peptide，建立AD大鼠模型，通過逍遙散干預治療，檢測蛋白磷酸酶-2A(PP-2A)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)在海馬 CA3區(qū)表達的變化，進一步探討中藥疏肝方劑對AD病的治療意義。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠，由河南省實驗動物中心提供，批號:SCXX(豫)2010-0002)，鼠齡4～5個月，體重(250±20)g。

1.2 藥品 逍遙散煎劑，組成:柴胡、當歸、白芍、茯苓、炙甘草、生姜、薄荷，按10∶10∶10∶10∶5∶1∶1 比例配比;方法:由本課題組嚴格按中藥煎劑制備流程制作，于每日用藥前2 h即時配備，最后經(jīng)水浴箱蒸發(fā)濃縮至含生藥2 g/ml的藥液濃度，晾至常溫備用。奧拉西坦溶液(奧拉西坦膠囊，石藥集團歐意藥業(yè)有限公司提供，400 mg/粒，批號:05110703)，于每日用藥前30 min，用常溫蒸餾水將奧拉西坦藥粉稀釋成150 mg/ml的濃度，備用。

1.3 試劑 A-β 1～42 peptide(北京博奧森生物技術有限公司提供，批號:990901);D-半乳糖(D-gal，Genview公司，北京鼎國昌盛生物技術有限公司分裝，批號:22L10133);PP2A-antibody(abgent，編號AJ1644a);GSK-3βantibody(CST，編號 9315s);冷凍包埋劑McCormick(USA)。

1.4 儀器 Morris水迷宮系統(tǒng)(DMS2，中國醫(yī)學科學院藥物研究所);藍星B型腦立體定位儀(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司產(chǎn));潔凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);Image-pro Plus 5.0圖像分析系統(tǒng)。

1.5 方法

1.5.1 動物分組 大鼠適應性喂養(yǎng)3 d[光照節(jié)律12L:12D(6:00～18:00)，室溫 22℃ ～24℃，濕度30% ～40%]，食用普通鼠用顆粒飼料(河南省實驗動物中心提供)，自由飲水。根據(jù)水迷宮實驗數(shù)據(jù)，留用成績最優(yōu)者作為正式實驗用鼠，隨機分為生理組、模型組、西藥組、中藥組。

1.5.2 造模方法 模型組、西藥組、中藥組均采用D-gal腹腔注射和A-β 1～42 peptide雙側(cè)海馬注射聯(lián)合造模[2]。方法:①D-gal:自造模第1天始，每天上午9∶00 ～10∶00，按10 ml/kg(濃度:10 mg/ml)劑量，大鼠左下腹腹腔注射，連續(xù)42 d;②A-β:在D-gal造模結束當日，大鼠用10%水合氯醛，4 ml/kg，腹腔注射麻醉，腦立體定位儀固定，將大鼠頭部毛發(fā)剪短，常規(guī)消毒，正中矢狀切開皮膚，暴露頭骨，以前囟為基準點后移4 mm，左右各移2 mm處確定左右側(cè)海馬位置，牙科鉆開顱，暴露硬腦膜，將孵育好的A-β生理鹽水溶液(濃度:5 μg/μl)，用微量注射器每側(cè)海馬緩慢注入2 μl，骨蠟封閉針孔，縫皮，消毒，腹腔注射20×104U青霉素以防感染。生理組如前方法僅采用等體積滅菌生理鹽水腹腔及海馬注射象征性處理。

1.5.3 給藥方法 以上造模結束后的第4天，每天上午9∶00對各組大鼠進行灌胃給藥，5 ml/kg，每日1次，連續(xù)28 d。其中生理組、模型組均用生理鹽水灌胃，西藥組和中藥組分別用奧拉西坦溶液和逍遙散煎劑灌胃。

1.5.4 取材 灌胃結束后第4天，大鼠經(jīng)10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉，斷頭處死，在滴有4℃的4%戊二醛固定液的蠟板上(蠟板放置于冰盒上)，迅速分離鼠腦，分組標記放入4℃ 4%戊二醛固定液玻璃容器密封，4℃保存。

1.5.5 免疫組織化學染色程序 鼠腦修塊，切取海馬區(qū)組織，石蠟包埋，進行切片，各組樣本海馬CA3區(qū)冠狀切片層面保持一致。切片4℃保存。切片室溫放置，在0.5%TritonX-100溶液中37℃孵育10 min，用0.05 mol/L TBS漂洗，3%的H2O2溶液室溫浸泡15 min，10%的正常羊血清原液封閉(用0.5% TritonX-100溶液稀釋)室溫輕搖1 h，吸掉封閉血清，加入用5%羊血清和0.5%TritonX-100混合液稀釋的一抗(PP2A稀釋度為1∶200，GSK-3β稀釋度為1∶150)，室溫孵育3 h。加入生物素標記的二抗(用5%羊血清和0.5%TritonX-100混合液稀釋，稀釋度為1∶500)，室溫孵育1 h;加入配好的ABC反應液(1∶100)，室溫孵育2 h。

1.5.6 圖像處理 選取每批每組冠狀切面相似的切片進行照相。圖像在Image-pro Plus 5.0分析系統(tǒng)分析。每個圖像選取200 μm×200 μm進行陽性細胞計數(shù)測試;同時測量各分區(qū)任意面積的積分光密度和陽性物面積(μm2)。用光密度表示各蛋白的相對含量。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，4組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

蛋白磷酸酶-2A(PP-2A)陽性細胞數(shù)、平均光密度及陽性面積、積分光密度等表達的各項指標在生理組中較多，在模型組中明顯減少，2組比較P＜0.01;而經(jīng)逍遙散灌胃干預后西藥組較模型組比較陽性細胞數(shù)、平均光密度及陽性面積、積分光密度明顯增加，分別為P＜0.01和P＜0.05;灌胃后的中藥組PP-2A陽性細胞數(shù)、平均光密度及陽性面積、積分光密度等各項指標與模型組比較也明顯增加(P ＜0.01)，見表1、圖1。

糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)以上各項指標在生理組中較少，在模型組中的表達呈增多趨勢，2組比較P＜0.01;經(jīng)逍遙散灌胃后西藥組和中藥組GSK-3β各項指標均出現(xiàn)了減少(P＜0.01)。見表2和圖2。

表1 PP-2A在海馬CA3區(qū)表達的變化(±s)Tab.1 Expression changes of PP-2A in hippocampal CA3( ± s)

表1 PP-2A在海馬CA3區(qū)表達的變化(±s)Tab.1 Expression changes of PP-2A in hippocampal CA3( ± s)

Note:Compared with physiological group，1)P ＜0.01;compared with model group，2)P ＜0.01，3)P ＜0.05.

Groups n Positive cell number Positive area(μm2) Average light density (MOD) Integrated optical density (IOD，×103) 054 4 0.343 2 ±0.041 7 45.03 ±7.95 Model group 10 66.61 ±3.081) 0.402 3 ±0.036 01) 0.253 8 ±0.024 71) 33.56 ±6.771) Western medicine group 10 75.25 ±4.062) 0.460 9 ±0.055 33) 0.315 3 ±0.031 52) 42.84 ±8.403) Chinese medicine group 10 78.04 ±3.132) 0.496 6 ±0.066 22) 0.324 6 ±0.030 12) 41.92 ±8.353) Physiological group 10 77.71 ±3.33 0.509 0 ±0.

圖1 大鼠CA3區(qū)PP2A各組的表達Fig.1 Expression of each PP2A group in rat CA3 region

表2 GSK-3β在海馬CA3表達的變化(±s)Tab.2 Expression changes of GSK-3β in hippocampal CA3( ± s)

表2 GSK-3β在海馬CA3表達的變化(±s)Tab.2 Expression changes of GSK-3β in hippocampal CA3( ± s)

Note:Compared with physiological group，1)P ＜0.01;compared with model group，2)P ＜0.01.

Groups n Positive cell number Positive area(μm2) Average light density(MOD) Integrated optical density (IOD，×103) 017 2 0.178 6 ±0.034 0 8.66 ±0.80 Model group 10 108.49 ±7.651) 0.399 6 ±0.048 21) 0.253 8 ±0.024 71) 10.94 ±0.861) Western medicine group 10 95.09 ±7.002) 0.325 9 ±0.034 12) 0.207 5 ±0.042 12) 9.94 ±0.812) Chinese medicine group 10 96.22 ±10.402) 0.297 4 ±0.035 92) 0.193 8 ±0.027 42) 9.38 ±0.762) Physiological group 10 88.46 ±6.96 0.254 6 ±0.

圖2 大鼠CA3區(qū)GSK-3β各組的表達Fig.2 Expression of each GSK-3β group in rat CA3 region

3 討論

海馬是學習與記憶的重要結構之一。學習記憶的結構基礎是大腦邊緣系統(tǒng)，特別是海馬CA3區(qū)，是形成空間辨別性學習記憶過程的重要結構，海馬CA3區(qū)神經(jīng)元是參與學習記憶功能的重要細胞[3]。

Tau蛋白過度磷酸化是AD的主要分子生化改變之一。參與調(diào)節(jié)Tau蛋白磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶有多種，但其中GSK-3β和PP-2A是較為關鍵的兩種蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶。經(jīng)凝聚態(tài)Aβ處理的大鼠GSK-3β的總量和其活性形式——磷酸化 GSK-3β[pTyr279，216]的表達增加[4]，顯示凝聚態(tài)A-β通過激活GSK-3來誘導Tau蛋白的過度磷酸化。Tau蛋白異常磷酸化，則神經(jīng)元凋亡和軸突轉(zhuǎn)運障礙。AD腦中Tau蛋白的異常過度磷酸化與蛋白激酶(如GSK-3β)和蛋白磷酸酯酶(如PP-2A)這兩種酶的調(diào)節(jié)失衡有關。蛋白激酶活性的增強或蛋白磷酸酯酶活性的減弱均可使Tau蛋白出現(xiàn)過度磷酸化。而使過度磷酸化的Tau蛋白去磷酸化成為逆轉(zhuǎn)AD分子生化改變的關鍵[4]。PP-2A是促使Tau蛋白去磷酸化的重要酯酶。磷酸酯酶活性降低，尤其是PP-2A活性降低，在Tau蛋白的異常過度磷酸化中起關鍵性作用[5]。

GSK-3β的活性受絲氨酸和酪氨酸磷酸化的調(diào)節(jié)，酪氨酸Tyr216位點是GSK-3β活化的關鍵位點，該位點磷酸化可使GSK-3β的活性增加;而絲氨酸Ser9位點的磷酸化則下調(diào)GSK-3β的活性[4]。

神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結是AD的重要病理學特征[6]，神經(jīng)原纖維纏結的主要成分是異常過度磷酸化的微管相關蛋白Tau，而老年斑的主要成分是β淀粉樣多肽(A-β)。GSK-3β可致使大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)可溶性Aβ前體蛋白沉積而形成老年斑[7]。

逍遙散出自宋《太平惠民和劑局方》，為疏肝解郁、健脾養(yǎng)血的重要方劑。作為調(diào)治情志的經(jīng)典方劑，在精神科應用所涉及到的疾病(癥)種類非常之多，有研究顯示包括了隱匿性抑郁癥、憂郁癥、恐畏、癔癥、神經(jīng)官能癥、精神分裂癥等精神系統(tǒng)疾病就有13種?，F(xiàn)代藥理研究認為逍遙散具有調(diào)節(jié)中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)整體內(nèi)激素水平、調(diào)節(jié)免疫、保肝、抗自由基和改善微循環(huán)等藥理作用[8]。就AD的臨床表現(xiàn)看，早期常出現(xiàn)典型的抑郁癥狀和對日常活動的興趣喪失、記憶力減退、智力下降、性格改變等，因此，中醫(yī)將AD歸屬于“呆病”、“郁證”等門類。當今老齡化社會中，由于老人喪偶獨身居住、子女不孝等因素普遍存在，使老齡孤獨寂寞，加重了情緒壓抑，促成了情志的失調(diào)、肝失疏泄。氣郁則血行不暢;肝血不足則腎精失充、髓海失養(yǎng)、神魂不藏。

研究顯示:逍遙散治療的大鼠海馬突觸的CA3區(qū)數(shù)密度與面密度較病理組均有明顯升高，說明逍遙散能抑制應激對大鼠海馬突觸體的損害;而與病理組比較，逍遙散治療后的大鼠海馬突觸連接帶的平均面積顯著減小，進一步說明逍遙散有抗大鼠海馬突觸體應激損傷的作用[9]。

本實驗研究結果顯示:經(jīng)逍遙散灌胃后PP-2A陽性細胞數(shù)、平均光密度及陽性面積、積分光密度等各項指標的表達與模型組比較均明顯增加(P＜0.01);GSK-3β以上各項指標在逍遙散灌胃后均出現(xiàn)了減少(P＜0.01)。進而可初步認為逍遙散能上調(diào)大鼠海馬CA3區(qū)PP-2A表達和下調(diào)GSK-3β表達，可能對凝聚態(tài)A-β1-42肽誘導的海馬Tau蛋白過度磷酸化有一定的抑制作用。

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[收稿2013-12-25 修回2014-01-02]

(編輯 許四平)

Effect of Xiaoyao Powder on Alzheimer's disease in hippocampal CA3 region of rats PP-2A，GSK-3β expression

ZHAO Wei-Xian，LI Gao-Shen，WANG Bao-Wei，LI Yi-Pei，LIU Jian-Tao，GUO Mei-Zhen，LIU Jun-Ling.Henan Medical College，Zhengzhou 451191，China

Objective:To study the effect of Xiaoyao Powder on Alzheimer′s disease in hippocampal CA3β region of rats PP-2A，GSK-3β expression.MethodsRats were randomly divided into four groups，including model group，western medicine group，Chinese medicine group were treated with intraperitoneal injection of D-gal and A-β 1-42 peptide bilateral hippocampal injection molding，physiological group only with equal volume of sterile saline intraperitoneal and hippocampal injection molding.The model was completed，normal group，model group were perfused with saline，western medicine group and Chinese medicine group were treated with oxiracetam solution and Xiaoyao decoction，four groups of intragastric volume was 0.5 ml/100 g，1 time a day，continuous 28 d.After intragastric administration of isolated rat brain immediately，packet marking in 4℃ 4%glutaraldehyde solution of glass container，stored at 4℃.Repair piece，cut from the hippocampus，embedded in paraffin，sliced.Dilution of PP-2A for 1∶200，GSK-3β dilution of 1∶150.Images were analyzed by using Image-pro Plus 5 image analysis system，data were conducted by SPSS11.5 statistical analysis software，the comparison between 4 groups by single factor analysis of variance，between the two two groups was compared by LSD-t test，the test level of α =0.05.ResultsThe expression of PP-2A positive cell number and the positive area，average optical density，integral optical density index，in Xiaoyao Powder orally intervention compared with the model group increased significantly (P ＜0.01);GSK-3β above indices were significantly decreased than that in model group after Xiaoyao Powder after intragastric administration(P ＜0.01).ConclusionXiaoyao Powder can up regulate the expression of PP-2A and down regulate expression of GSK-3β，may be condensed A-β 1-42 peptide induced hyperphosphorylation of Tau has certain inhibition.

Xiaoyao Powder;Alzheimer disease;Hippocampus CA3;Protein phosphatase-2A;Glycogen synthase kinase-3 beta

R285.5

A

1000-484X(2014)05-0623-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.011

①本文為河南省2012年度科技計劃項目(122102310410)和河南省教育廳青年骨干教師資助項目(2011GGJS-220)。②通訊作者，黃河科技學院，鄭州450006。

③鄭州市職業(yè)病防治所，鄭州450053。

趙唯賢(1963年-)，男，副教授，主要從事中醫(yī)教學及老年醫(yī)學研究工作。