氧化型低密度脂蛋白對(duì)正常人外周血單核細(xì)胞凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1及尿激酶型纖溶酶原激活劑受體蛋白表達(dá)的影響

焦珍珍，方全 ，黃建鳳

氧化型低密度脂蛋白對(duì)正常人外周血單核細(xì)胞凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1及尿激酶型纖溶酶原激活劑受體蛋白表達(dá)的影響

焦珍珍，方全 ，黃建鳳

目的： 探討不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度氧化型低密度脂蛋白（ oxLDL）對(duì)正常人外周血單核細(xì)胞凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）、尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（uPAR）蛋白的表達(dá)情況的影響。

方法： 選取正常人外周血經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用含20%自體血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，收取其帖壁的單核細(xì)胞，以免疫印跡雜交法（Western Blot）方法檢測(cè)不同濃度oxLDL對(duì)正常人單核細(xì)胞干預(yù)24h，72h的uPAR、LOX-1的蛋白表達(dá)。

結(jié)果： oxLDL干預(yù)正常人單核細(xì)胞24小時(shí)后，隨著其濃度的增加uPAR及LOX-1蛋白表達(dá)上調(diào)，在50 μg/ml時(shí)達(dá)峰，而高濃度組（100 μg/ml）對(duì)兩者的蛋白表達(dá)起著抑制作用。oxLDL刺激正常人單核細(xì)胞72小時(shí)后，低濃度（10 μg/ml）不能有效地增加uPAR的表達(dá)，較高濃度（50 μg/ml、100 μg/ml）能夠較有效地增加uPAR的表達(dá)。oxLDL刺激正常人單核細(xì)胞72小時(shí)后，LOX-1的表達(dá)隨著濃度的增加而上調(diào)，但濃度≥50 μg/m l時(shí)，其表達(dá)有所下降。

結(jié)論： 本研究中oxLDL不同作用時(shí)間對(duì)uPAR及LOX-1的影響不同，提示了oxLDL致炎癥過(guò)程的復(fù)雜性。

氧化低密度脂蛋白；尿激酶型纖溶酶原激活劑；凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:288.)

氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，它參與動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展是較為明確的[1]，主要通過(guò)兩種機(jī)制促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展：一是單核巨噬細(xì)胞通過(guò)清道夫受體攝入oxLDL，引起血管壁泡沫細(xì)胞的堆積和脂紋的形成；二是oxLDL改變了內(nèi)皮細(xì)胞的多種功能，如誘導(dǎo)內(nèi)皮表達(dá)黏附分子、血管平滑肌生長(zhǎng)因子、集落刺激因子以及單核細(xì)胞化學(xué)趨化蛋白-1等，同時(shí)還通過(guò)降低一氧化氮（NO）的產(chǎn)生而減弱內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)。尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（uPAR）最早被Vassalli和Stoppelli等在人類外周血的單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。它廣泛存在于多種細(xì)胞表面，如外周血白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及骨髓細(xì)胞等，此外還可表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面。凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）是一種在內(nèi)皮細(xì)胞豐富表達(dá)的Ⅱ型單鏈跨膜蛋白，屬C型選擇素家族，在單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，血小板，平滑肌細(xì)胞也有表達(dá)。oxLDL可通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞表面的LOX-1結(jié)合激活內(nèi)皮，影響內(nèi)皮功能，損傷血管，參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。LOX-1具有對(duì)oxLDL的特異性結(jié)合、內(nèi)吞以及降解作用，但是對(duì)天然的及乙?；牡兔芏戎鞍祝↙DL）無(wú)此作用。LOX-1與oxLDL之間的特異性結(jié)合可以被多聚肌苷酸和角叉菜膠抑制[2]?；罨膯魏思?xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的病理機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[3]。單核細(xì)胞需粘附到血管壁、遷移至炎癥灶的局部，才能發(fā)揮致炎癥的潛力。在這一復(fù)雜過(guò)程中，需要粘附分子的受體及其復(fù)合受體參與，如uPAR和LOX-1[4]。在oxLDL活化單核細(xì)胞的過(guò)程中，uPAR與LOX-1表達(dá)均會(huì)有改變。本研究旨在探討oxLDL對(duì)正常人外周血單核細(xì)胞中uPAR及LOX-1的蛋白水平的影響。

1 對(duì)象和方法

研究對(duì)象的收集：正常人來(lái)自2010-11到2011-03招募的健康志愿者，條件符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②無(wú)2型糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化性疾病；③肝腎功能正常；④無(wú)腫瘤等惡性疾病史；⑤血脂代謝正常；⑥無(wú)感染性疾病風(fēng)濕免疫性疾病等。上述健康志愿者簽署知情同意書(shū)?？崭?2小時(shí)以上，嚴(yán)格無(wú)菌條件下抽取外周血200 m l，分別置于9 m l依地酸二鈉（EDTA）抗凝管中充分混勻，取血6小時(shí)內(nèi)在無(wú)菌條件下進(jìn)行以下操作。

人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：①全血靜置后以1500 r/min離心10 min，去血漿；②以3倍D-Hank’s稀釋血細(xì)胞形成混合液；③將混合液緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液之上（兩者體積比2：1）；④2000 r/min 離心30 min,可見(jiàn)4層，從上至下取第二層（白色云霧狀），純化、計(jì)數(shù)；⑤接種于6孔板以RPMI1640+20%自體血清+雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)；⑥6小時(shí)后以不同濃度oxLDL干預(yù)，分別于24h、72h收取貼壁的單核細(xì)胞提取蛋白質(zhì)。

免疫印跡雜交法（Western blot）：①RIPA裂解液制備細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（Biomed）測(cè)定蛋白含量；②聚丙烯酰氨凝膠制備，上樣與電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，結(jié)合一抗，洗滌，結(jié)合二抗，電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影，半定量分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩濃度之間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05則有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)oxLDL干預(yù)24小時(shí)（圖1、2），隨著oxLDL濃度的增加，uPAR及LOX-1的蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)；當(dāng)oxLDL為10 μg/m l、20 μg/m l、50 μg/m l刺激外周血單核細(xì)胞后uPAR及LOX-1蛋白表達(dá)水平較0 μg/m l顯著升高（P＜0.05），且3個(gè)濃度之間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；50 μg/m l的oxLDL對(duì)uPAR及對(duì)LOX-1表達(dá)刺激最為明顯，相對(duì)于其他濃度組亦有明顯的促進(jìn)作用（P＜0.05）；oxLDL 濃度為 100 μg/m l時(shí)，對(duì) uPAR和對(duì)LOX-1蛋白表達(dá)呈抑制趨勢(shì)，與0 μg/m l和50 μg/m l比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；多聚肌苷酸（polyi）對(duì)LOX-1蛋白表達(dá)有著較明顯的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），多聚肌苷酸對(duì)uPAR的表達(dá)則未見(jiàn)抑制作用。

經(jīng)oxLDL干預(yù)72小時(shí)（圖3、4），當(dāng)oxLDL為10 μg/m l 時(shí)不能有效增加 uPAR 的表達(dá)，50 μg/ml、100 μg/m l刺激外周血單核細(xì)胞后uPAR蛋白表達(dá)水平較oxLDL 0 μg/ml顯著升高 （P＜0.05），10 μg/ml、20 μg/m l、50 μg/m l、100 μg/ml濃度之間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；100 μg/m l的oxLDL對(duì)uPAR表達(dá)刺激最為明顯，相對(duì)于其他濃度組亦有明顯的促進(jìn)作用（P＜0.05）； oxLDL 濃度為 10 μg/m l、20 μg/m l時(shí)，對(duì)LOX-1蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；50 μg/m l 表達(dá)有所下降，但與oxLDL 0 μg/m l 比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。polyi對(duì)uPAR和LOX-1蛋白表達(dá)均有著較明顯的抑制作用（P＜0.05）。

圖1 24小時(shí)uPAR蛋白表達(dá)情況

圖2 24小時(shí)LOX-1受體表達(dá)

圖3 72小時(shí)uPAR蛋白表達(dá)情況

圖4 72小時(shí)LOX-1受體表達(dá)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是發(fā)達(dá)國(guó)家人口的主要死亡原因[5]，也是心血管疾病共同的病理基礎(chǔ)。1999年初，Ross等[6]提出動(dòng)脈粥樣硬化是發(fā)生在大血管及中血管的一種慢性炎癥。炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)病理變化，目前已有許多的炎性因子被研究證實(shí)參與了冠心病的發(fā)生和發(fā)展，uPAR和LOX-1亦是其中之一[7-9]。本研究應(yīng)用正常人外周血單核細(xì)胞作為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度的oxLDL干預(yù)以后，uPAR及LOX-1的蛋白表達(dá)有所區(qū)別。由圖1可看出：不同濃度的oxLDL干預(yù)正常人外周血單核細(xì)胞24小時(shí)后，uPAR的表達(dá)隨著濃度的升高表達(dá)上調(diào)，在50 μg/m l時(shí)達(dá)到峰值，100 μg/ml較前一組表達(dá)反而下降，polyi與 50 μg/m l相比，uPAR表達(dá)上調(diào)。由圖2可看出：不同濃度的oxLDL干預(yù)正常人外周血單核細(xì)胞24小時(shí)后，LOX-1的表達(dá)隨著濃度的升高而上調(diào)，在50 μg/m l時(shí)達(dá)到峰值，100 μg/m l較前一組表達(dá)反而下降，polyi與50 μg/ml相比，LOX-1表達(dá)下調(diào)。由圖3可看出：不同濃度的oxLDL干預(yù)正常人外周血單核細(xì)胞72小時(shí)后，10 μg/m l濃度組較 0 μg/m l表達(dá)下調(diào)，20 μg/ml與0 μg/m l表達(dá)基本一致，之后表達(dá)開(kāi)始上調(diào)，在100 μg/m l達(dá)峰。Polyi較 50 μg/m l表達(dá)下調(diào)。由圖 4可看出：不同濃度的oxLDL干預(yù)正常人外周血單核細(xì)胞 72 小時(shí)后，10 μg/m l、20 μg/ml較 0 μg/m l表達(dá)上調(diào)，20 μg/ml時(shí)達(dá)峰，50 μg/m l時(shí)較 20 μg/ml下調(diào)，在 100 μg/m l時(shí)與 0 μg/m l基本相似。Polyi組較 50 μg/m l表達(dá)下調(diào)。

采用Western blot方法的研究結(jié)果顯示50 μg/ml的oxLDL對(duì)uPAR及LOX-1的蛋白表達(dá)刺激最為明顯，相對(duì)于其他濃度組亦有明顯的促進(jìn)作用（P＜0.05），提示oxLDL可能影響uPAR及LOX-1的表達(dá)參與炎癥反應(yīng)、進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)[10]：不同濃度的oxLDL干預(yù)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中，LOX-1的表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴性，在40 μg/m l表達(dá)最高，100 μg/m l呈現(xiàn)抑制。國(guó)內(nèi)[11,12]也有研究顯示，在巨噬細(xì)胞中，oxLDL干預(yù)下LOX-1表達(dá)的達(dá)峰濃度為75 μg/m l，隨后表達(dá)下降。本研究中，LOX-1表達(dá)的峰值濃度為50 μg/m l，與國(guó)內(nèi)外既往的研究結(jié)果相近。oxLDL以濃度依賴性的方式刺激LOX-1的表達(dá)上調(diào)，而且oxLDL與LOX-1結(jié)合后可使巨噬細(xì)胞吞噬oxLDL的能力進(jìn)一步加強(qiáng)，說(shuō)明在oxLDL介導(dǎo)的機(jī)體損傷中，uPAR和LOX-1一樣，在早期即顯示出生物學(xué)作用，但具體表現(xiàn)為防御性保護(hù)作用還是損傷作用，尚無(wú)法定論。oxLDL濃度為100 μg/m l時(shí)，對(duì)uPAR和LOX-1蛋白表達(dá)呈抑制趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），oxLDL高濃度時(shí)對(duì)uPAR及LOX-1的抑制作用，其生物機(jī)制有待后續(xù)研究；Polyi作為L(zhǎng)OX-1的抑制劑，特異性地抑制LOX-1 表達(dá)[13]。

對(duì)于uPAR的表達(dá)，在72小時(shí)與24小時(shí)相比而言，10 μg/m l組表達(dá)較 0 μg/m l下調(diào)，并且oxLDL對(duì)于uPAR表達(dá)的刺激作用的濃度峰值后移，可能顯示了低濃度的oxLDL時(shí)可能機(jī)體呈現(xiàn)出短期防御性細(xì)胞免疫保護(hù)的過(guò)程，而大于20 μg/m l才是真正損傷的濃度范圍。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較而言，峰值后移說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)程（72小時(shí)）方可顯現(xiàn)真正的損傷的因素。

本研究仍存在一定的局限性。比如，所購(gòu)買的oxLDL為人工合成，與人體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物功能上還是有一定差異。在原代單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程中，雖然盡量模擬體內(nèi)生理狀態(tài)，予以刺激仍可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表型的部分改變及某些基因和蛋白的激活。本研究未顯示時(shí)間依賴性的刺激表達(dá)結(jié)果及相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要今后進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述，oxLDL干預(yù)正常人外周血單核細(xì)胞24小時(shí)后，隨著其濃度的增加uPAR及LOX-1蛋白表達(dá)上調(diào)，在50μg/m l時(shí)達(dá)峰，而高濃度組（100 μg/ml）對(duì)兩者的蛋白表達(dá)起著抑制作用。oxLDL刺激正常人單核細(xì)胞72小時(shí)后，低濃度（10 μg/ml、20 μg/m l）不能有效地增加uPAR的表達(dá)，較高濃度（50 μg/m l、100 μg/m l）能夠較有效地增加 uPAR 的表達(dá)；而LOX-1的表達(dá)隨著oxLDL濃度的增加先上調(diào)后又下降。該結(jié)果提示oxLDL不同作用時(shí)間對(duì)uPAR及LOX-1的影響不同，提示了oxLDL致炎癥過(guò)程的復(fù)雜性。oxLDL參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的生物機(jī)制還需今后近一步研究。

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（編輯：汪碧蓉）

Effect of Oxidative LDL on Protein Expressions of Lectin Like Oxidized LDL Receptor-1 and Urokinase Type Plasm inogen Activator Receptor in Normal Human Peripheral Blood M ononuclear Cells

JIAO Zhen-zhen, FANG Quan, HUANG Jian-feng.
Department of Functional Testing, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

HUANG Jian-feng, Email: jianfhuang@sina.com

Objective: To investigate the effect of oxidative LDL (oxLDL) on protein expressions of lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) and urokinase type plasm inogen activator receptor (uPAR) in normal human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).

Methods: The normal human PBMC was isolated by Ficoll-paque density gradient centrifugation and cultured w ith RPM I 1640 medium w ith 20% antologous serum. Western blot was conducted to detect the effect of oxLDL at different concentrations and time periods on protein expressions of LOX-1 and uPAR in normal human PBMC.

Results: For 24-hour oxLDL treatment, the protein expressions of uPAR and LOX-1 were increased w ith the elevated oxLDL concentrations, oxLDL 50 μg/m l was the peak, while the expressions were inhibited by oxLDL 100 μg/m l. With 72-hour oxLDL treatment, the low concentration of oxLDL 10 μg/m l could not increase uPAR protein expression, while oxLDL 50 μg/m l and 100 μg/m l could effectively increase uPAR protein expression; the LOX-1 expression was increased according to the elevated oxLDL concentrations, while the expression decreased at oxLDL ≥50 μg/m l.

Conclusion: Our work indicated that different concentrations and time periods of oxLDL treatment may affect the protein expressions of uPAR and LOX-1 at different degrees which suggested that oxLDL-induced inflammatory process was complicated.

Oxidative LDL; Lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1; Urokinase type plasm inogen activator receptor

100037 北京市，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 心血管病研究所 阜外心血管病醫(yī)院 功能檢測(cè)中心（焦珍珍、黃建鳳），中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 心內(nèi)科（方全）

焦珍珍 住院醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病的發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究 Email：jiaozz789@126.com 通訊作者：黃建鳳 Email：jianfhuang@sina.com

R54

A

1000-3614( 2014 ) 04-0288-04

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2014.04.013

2013-09-25）

病例報(bào)告