纈沙坦減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的研究

朱銀川，康丹丹，湯建民，王瓊

纈沙坦減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的研究

朱銀川，康丹丹，湯建民，王瓊

目的：探討纈沙坦對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)的可能機(jī)制。

方法：將30只大鼠分為假手術(shù)組，缺血再灌注組，纈沙坦預(yù)處理組，每組10只。纈沙坦預(yù)處理組給予纈沙坦（30 mg/kg），1次/天，灌胃治療4周，其余二組給予等體積的生理鹽水。建立心肌缺血再灌注損傷模型成功后，取血樣檢測(cè)血清超氧化物歧化物（SOD）活性和丙二醛含量；取相應(yīng)的左心室區(qū)域，應(yīng)用蛋白印跡法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法測(cè)定各組心肌組織中一氧化氮合酶（iNOS）、解偶聯(lián)蛋白2信使核糖核酸（UCP2 mRNA）和蛋白的表達(dá)。

結(jié)果：SOD活性：缺血再灌注組、纈沙坦預(yù)處理組比假手術(shù)組均減少（P＜0.01），纈沙坦預(yù)處理組高于缺血再灌注組（P＜0.01）。丙二醛含量：缺血再灌注組、纈沙坦預(yù)處理組比假手術(shù)組均升高（P＜0.01），纈沙坦預(yù)處理組低于缺血再灌注組（P＜0.01）。iNOS和UCP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量：缺血再灌注組、纈沙坦預(yù)處理組比假手術(shù)組均升高（P＜0.01），纈沙坦預(yù)處理組高于缺血再灌注組（P＜0.01）。iNOS和UCP2蛋白的表達(dá)量：缺血再灌注組、纈沙坦預(yù)處理組比假手術(shù)組均升高（P＜0.01），纈沙坦預(yù)處理組高于缺血再灌注組（P＜0.01）。

結(jié)論：纈沙坦可通過(guò)提高iNOS、UCP2的表達(dá),減少和清除氧自由基起到保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的作用。關(guān)鍵詞 心肌缺血再灌注損傷；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；解偶聯(lián)蛋白2；纈沙坦

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:382.)

隨著心肌梗死的溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)等血運(yùn)重建治療術(shù)在臨床實(shí)踐中的不斷普及，所面臨心肌缺血-再灌注損傷的問(wèn)題也日益受到重視，若能防治心肌缺血再灌注損傷，缺血心肌將能從再灌注療法中獲得更佳療效。缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為引起再灌注損傷的主要機(jī)制與自由基損傷作用、細(xì)胞鈣超載、白細(xì)胞與微血管功能障礙等有關(guān)[1]，其中自由基與各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分如膜磷脂、蛋白質(zhì)、核酸等發(fā)生反應(yīng)是造成心肌缺血-再灌注損傷的主要原因。近年來(lái)國(guó)外研究提示誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）在自由基的代謝過(guò)程中起到重要作用，解偶聯(lián)蛋白是線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠在線粒體自由基增多時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，從而減少自由基的產(chǎn)生。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑氯沙坦能夠減少心肌梗死面積、室性心律失常，但具體機(jī)制仍不清楚[2]。本研究通過(guò)建立大鼠缺血再灌注損傷模型，檢測(cè)心肌解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）及誘導(dǎo)型iNOS的表達(dá)，探索纈沙坦預(yù)處理對(duì)心肌的保護(hù)機(jī)制，為藥物治療提供線索及依據(jù)。

1 材料與方法

2013-03由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供健康成年雄性SD大鼠30只，體重200～250 g，采用隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組，缺血再灌注組，纈沙坦預(yù)處理組，每組10只。纈沙坦預(yù)處理組給予纈沙坦30 mg/（kg·d） 灌胃（纈沙坦片 80 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字J20070026，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)BH20060395），1次/天，灌胃治療4周，其余二組給予等體積的生理鹽水灌胃。灌胃4周后制作大鼠缺血再灌注模型，用3%戊巴比妥鈉 50 mg/kg腹腔注射。麻醉成功后，將大鼠置于手術(shù)臺(tái)上，頭部及四肢固定于木板上，心電圖連接于四肢皮下，記錄心電圖變化。氣管切開(kāi)插管，呼吸機(jī)輔助呼吸（Hx-100E小動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自成都）。分離大鼠胸骨左緣3～5肋間。擴(kuò)胸器擴(kuò)胸，暴露心臟，提取并剪開(kāi)心包，輕輕擠出心臟上翻，于左心耳根部冠脈動(dòng)脈起始處，用6/0絲線穿過(guò)該動(dòng)脈。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，余兩組用一帶有凹槽的細(xì)乳膠管，墊于血管與結(jié)扎線之間，結(jié)扎30 min，結(jié)扎線遠(yuǎn)端的缺血心肌變白，顏色變暗，心電圖顯示ST呈弓背向上抬高提示結(jié)扎成功。剪開(kāi)結(jié)扎線，取出細(xì)乳膠管，再灌注后缺血部位心肌顏色恢復(fù)，ST段回落，證實(shí)結(jié)扎血管再灌注成功。關(guān)胸后再灌注120 min。經(jīng)頸動(dòng)脈取血樣2 ml，檢測(cè)超氧化物歧化物（SOD）的活性，及丙二醛含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取心臟，獲取左心室缺血區(qū)心肌組織，分為兩份，用預(yù)冷的磷酸鹽水洗凈殘血，一份在液氮中迅速冷凍，另外一份存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

各組血清丙二醛含量和SOD活性的測(cè)定：于關(guān)胸后再灌注120 min時(shí)，經(jīng)頸動(dòng)脈取血樣2 ml，4000 r/min離心15 min，取上清，按試劑盒說(shuō)明采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD的活性，硫代巴比妥酸法測(cè)丙二醛含量。試劑盒購(gòu)自北京博大泰克公司。

心肌組織iNOS和UCP2 信使核糖核酸（mRNA）表達(dá)的檢測(cè)：所取的心肌組織，加入一種總RNA抽提試劑Trizol液1m l中研磨吹打成勻漿后提取心肌細(xì)胞核糖核酸（RNA），逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)RNA（cRNA）（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Transgene公司產(chǎn)品）。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法進(jìn)行擴(kuò)增。甘油醛-3-磷酸脫氫酶上游引物序列為為5'CCACGGCAAGTTCAACGGCACA 3'，下游引物序列為 5' GCGGCATGTCAGATCCACAACG 3'。UCP2上游引物：5' TCCTGGCAGGTAGCACCA 3'，下游引物：5' CCCGAAGGCAGAAGTGAAG 3'。iNOS上游引物序列為5' GCTGTCTGACCCTCATTTT 3'，下游引物序列為5' GCTGTCTGACCCTCATTTT 3'。擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性2 m in，1個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃總延伸6 min。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物與緩沖液混合后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠，溴化乙錠染色，在紫外線投射下觀察電泳電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，目的基因UCP2、iNOS mRNA 的表達(dá)量以 UCP2、iNOS的脫氧核糖核酸(DNA)條帶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的DNA條帶灰度值比值計(jì)算。小鼠抗大鼠UCP2抗體、羊抗大鼠iNOS抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體均由美國(guó)Santa cruz公司提供，二抗由美國(guó)Zymed公司提供，iNOS、UCP2和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（內(nèi)參）引物均購(gòu)自北京博大泰克公司。

心肌組織iNOS和UCP2蛋白表達(dá)的蛋白印跡法檢測(cè)：提取好的組織用組織細(xì)胞裂解液對(duì)組織進(jìn)行裂解。裂解液按等蛋白量上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，經(jīng)封閉、洗膜后，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，再加入二抗37℃孵育45 min，漂洗后室溫超敏發(fā)光化學(xué)試劑顯色，蒸餾水洗滌。觀察并照相，進(jìn)行圖像分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。三組間丙二醛的含量,SOD活性，iNOS、UCP2蛋白和mRNA表達(dá)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。各檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

SOD活性：缺血再灌注組、纈沙坦預(yù)處理組比假手術(shù)組均減少（P＜0.01），纈沙坦預(yù)處理組高于缺血再灌注組（P＜0.01）。丙二醛含量：缺血再灌注組、纈沙坦預(yù)處理組比假手術(shù)組均升高（P＜0.01），纈沙坦預(yù)處理組低于缺血再灌注組（P＜0.01）。iNOS和UCP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量：缺血再灌注組、纈沙坦預(yù)處理組比假手術(shù)組均升高（P＜0.01），纈沙坦預(yù)處理組高于缺血再灌注組（P＜0.01）。iNOS和UCP2蛋白的表達(dá)量：缺血再灌注組、纈沙坦預(yù)處理組比假手術(shù)組均升高（P＜0.01），纈沙坦預(yù)處理組高于缺血再灌注組（P＜0.01）。表 1，圖 1、2、3

表1 3組各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果比較（ ±s）

表1 3組各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果比較（ ±s）

注：與假手術(shù)組相比*P＜0.01；與缺血再灌注組相比△P＜0.01。SOD：超氧化物歧化物 iNOS：一氧化氮合酶 UCP2：解偶聯(lián)蛋白2 m RNA：信使核糖核酸

假手術(shù)組 (n=10) 缺血再灌注組 (n=10) 纈沙坦預(yù)處理組 (n=10)SOD 活性 (U/m l) 176.175±9.068 119.188±10.830* 132.562±8.468*△丙二醛含量 (nm o l/m l) 1.483±0.159 2.676±0.280* 2.148±0.194*△逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)結(jié)果iNOS m RNA 相對(duì)表達(dá)量 0.327±0.030 0.529±0.060* 0.938±0.128*△UCP2 m RNA 相對(duì)表達(dá)量 0.177±0.034 0.470±0.051* 0.670±0.125*△蛋白印跡法結(jié)果iNOS 蛋白表達(dá)量 0.169±0.016 0.333±0.069* 0.578±0.062*△UCP2 蛋白表達(dá)量 0.115±0.023 0.277±0.028* 0.411±0.063*△

圖1 各組大鼠心肌組織解偶聯(lián)蛋白2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果

圖3 各組大鼠心肌組織解偶聯(lián)蛋白2和一氧化氮合酶的蛋白印跡法結(jié)果

圖2 各組大鼠心肌組織一氧化氮合酶逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果

3 討論

血清丙二醛是氧自由基（尤其是超氧陰離子）作用于膜不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，丙二醛不僅反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度，也可間接反映氧自由基的生成量，可以判斷心肌缺血再灌注損傷的程度[3]。SOD能有效地清除氧自由基，使機(jī)體免于自由基的損傷。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基過(guò)多或清除自由基的能力不足時(shí)，過(guò)多的氧自由基將引起細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的損害，因此，SOD活性的變化可影響到組織中的氧自由基濃度，可間接反映心肌抗氧化損傷的能力[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察到缺血再灌注組的丙二醛含量增加和SOD活性下降，表明缺血再灌注后氧自由基產(chǎn)生有顯著的增加，而給予纈沙坦干預(yù)后，丙二醛的含量降低，SOD活性增加，表明纈沙坦可以使大鼠心肌抗氧化酶的活性增加，清除氧自由基，起到保護(hù)缺血-再灌注心肌的作用。

心肌在正常情況下不合成一氧化氮，只有在缺血、缺氧和某些細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子等的激活下可誘導(dǎo)心肌組織誘導(dǎo)型iNOS的表達(dá)，催化底物L(fēng)-精氨酸產(chǎn)生釋放大量一氧化氮[5]。一氧化氮可作用于血管平滑肌產(chǎn)生擴(kuò)血管作用，抑制炎癥反應(yīng)[6]，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、清除自由基，減輕鈣超載。iNOS/一氧化氮在心肌缺血再灌注損傷中有雙重作用。研究證實(shí)在缺血再灌注過(guò)程中下調(diào)iNOS的表達(dá)具有保護(hù)作用[7]。但也有研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理的保護(hù)作用與心肌組織中的iNOS表達(dá)上調(diào)有關(guān)，而且敲除iNOS基因可以消除這種保護(hù)作用[8]。iNOS/一氧化氮所起的雙重作用可能與iNOS所催化產(chǎn)生的一氧化氮的數(shù)量、一氧化氮所釋放的環(huán)境有關(guān)，同時(shí)也受到所研究模型的影響[9]。研究證明坎地沙坦可上調(diào)iNOS的表達(dá)，促進(jìn)一氧化氮的釋放達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮，改善血管重塑的作用[10]。楊麗云等[11]研究證明坎地沙坦能夠改善自發(fā)性高血壓大鼠的主動(dòng)脈舒縮功能及結(jié)構(gòu)，并上調(diào)iNOS的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和纈沙坦預(yù)處理組iNOS蛋白和mRNA表達(dá)量升高（P＜0.01）；纈沙坦預(yù)處理組iNOS蛋白和mRNA表達(dá)量高于缺血再灌注組（P＜0.01），表明纈沙坦預(yù)處理可能通過(guò)提高iNOS的表達(dá)，促進(jìn)一氧化氮的釋放，清除氧自由基而起到心肌保護(hù)的作用。

UCP2是線粒體內(nèi)膜蛋白質(zhì)，可引起質(zhì)子漏，降低質(zhì)子跨膜梯度，使活性氧產(chǎn)生減少，減少自由基的生成。有研究發(fā)現(xiàn),UCP2過(guò)表達(dá)可降低大鼠心肌細(xì)胞活性氧水平及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[12]，而心肌缺血-再灌注后, UCP2表達(dá)增加, 伴隨受損心肌細(xì)胞的減少[13]，提示UCP2表達(dá)增加可起到保護(hù)細(xì)胞的作用。研究表明血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑可以調(diào)節(jié)UCP2在大鼠肝臟和腎臟中的表達(dá)[14，15]，促進(jìn)線粒體UCP2表達(dá)增高[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和纈沙坦預(yù)處理組UCP2蛋白和mRNA表達(dá)量升高（P＜0.01）；纈沙坦預(yù)處理組UCP2蛋白和mRNA表達(dá)量高于缺血再灌注組（P＜0.01），表明纈沙坦可能通過(guò)提高UCP2的表達(dá)，減少活性氧的生成，從而通過(guò)減少氧自由基的生成起到心肌保護(hù)的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明纈沙坦可清除氧自由基起到保護(hù)缺血再灌注心肌的作用，這可能與提高iNOS的表達(dá)增加一氧化氮的釋放，提高UCP2的表達(dá)，減少活性氧的釋放有關(guān)。至于UCP2和iNOS/一氧化氮系統(tǒng)間有怎樣的聯(lián)系，需進(jìn)一步研究探討。

[1] 趙亞玲, 敖虎山.心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展. 中國(guó)循環(huán)雜志,2011, 5： 396-398.

[2] Safari F, Haiizadeh S, Shekarforoush S, et al. Influence of ramiprilat and losartan on ischemia reperfusion injury in rat hearts. Renin Angiotensin Aldosterone Syst， 2012，13： 29-35.

[3] BirLS, Demir S, Rota S, et al.Increased serum malondial-dehyde levels in chronic stage of ischemic stroke.Tohoku J Exp med, 2006,208： 33 - 39.

[4] 王禹, 張永明, 劉秀華, 等. 依達(dá)拉奉藥物后處理與缺血后處理對(duì)急性缺血再灌注心肌保護(hù)作用的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究. 中國(guó)循環(huán)雜志,2008, 5： 388-391.

[5] Doods H, Wu D.Sabiporide reduces ischemia-induced arrhythmias and myocardial infarction and attenuates ERK phosphorylation and iNOS induction in rats.Biomed Res Int，2013，504320.

[6] Luscher TF.Imbalance of endothelium-derived relaxing and contracting factors．A new concept in hypertension.Am J Hypertens，1990，3 ： 317-330．

[7] 崔世濤, 朱洪生. 心肌再灌注損傷中一氧化氮合酶及其基因異常表達(dá)的研究. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 1998, 78：327-330．

[8] Guo Y，Jones WK，Xuan YT，et a1．The late phase preconditioning is abrogated by targeted disruption of inducible NO synthase gene．Proc Nat l Acad Sci USA，1999，96：11507-11512．

[9] Xi L，Jarrett NC，Hess ML，et a1．Essential role of inducible nitric oxide synthase in monophosphory lipid A-induced late cardioprotection：evidence from pharmacological inhibition and gene knockout mice． Circulation, 1999，99：2157-2163．

[10] 邊樹(shù)懷, 于明月, 耿強(qiáng), 等. 高血壓大鼠血漿尾加壓素Ⅱ、NO、NOS變化及坎地沙坦干預(yù)的影響. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2009,25：194-195.

[11] 楊麗云, 孟國(guó)梁, 徐濟(jì)良.苯那普利與坎地沙坦改善自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及功能. 中華高血壓雜志, 2010, 18：539-544.

[12] Teshima Y, Akao M, Jones SP, et al.Uncoup ling protein-2 overexp ression inh ib its m itochond rial death pathway in cardiomyocytes.Circ Res, 2003, 93： 192 - 200.

[13] McLeod CJ , Aziz A, Hoyt RF Jr, et al.Uncoupling proteins 2 and 3 function in concert to augment tolerance to cardiac ischemia.Biol Chem, 2005, 280： 33470 -33476.

[14] Araki K, Masaki T, Katsuraqi I, et al.Telmisartan prevents obesity and increases the expression of uncoupling protein 1 in diet-induced obese mice.Hypertension， 2006，48： 51-57.

[15] Chen YH, Yuan L, Chen YY, et al.The effects of renin-angiotensin system blockade on the liver steatosis in rats on long-term high-fat diet. Zhonghua Nei Ke Za Zhi， 2008， 47： 197-201.

[16] 李萍, 尹康, 羅時(shí)柯, 等.解偶聯(lián)蛋白2在血管緊張素Ⅱ致線粒體活性氧生成中的作用.中華高血壓雜志，2010，18：940-945.

（編輯：王寶茹）

Valsartan Decreasing the Myocardial Ischem ia Reper fusion Injury in Exprimental Rats

ZHU Yin-chun, KANG Dan-dan, TANG Jian-m in, WANG Qiong.
Department of Cardiology, The Second A ffi liated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou (450014), Henan, China

TANG Jian-m in, E-mail: tjmgrx@yahoo.com

Objective: To explore the possible protective mechanism of valsartan on myocardial ischem ia reperfusion (I/R)injury in experimental rats.

Methods: The I/R model was established by 30 m in of left anterior descending artery (LAD) occlusion w ith the subsequent reperfusion for 120 min. A total of 30 male SD rats were divided into 3 groups, n=10 in each group. Sham operation(SH) group, IR group and Valsartan pre-treatment (Valsartan) group, in which the rats received valsartan 30 mg/(kg?day), and the other 2 groups received the same amount of normal saline. All animals were treated for 4 weeks. The serum levels of super oxide dismutase (SOD) and maleic dialdehyde (MDA) were examined. Real-time RT-PCR was conducted to quantitatively calculate the mRNA expressions of uncoupling protein-2 (UCP2) and induced nitric oxide synthase (iNOS), Western blot analysis was used to detect the protein expressions of UCP2 and (iNOS) in myocardial tissue.

Results: ① Compared w ith SH group, the serum SOD levels decreased in IR group and Valsartan group, while it was higher in Valsartan group; the MDA levels increased in IR group and Valsartan group, while it was lower in Valsartan group, all P＜0.01. ② The mRNA expressions of UCP2 and iNOS increased in IR group and Valsartan group and it was even higher in Valsartan group, all P＜0.01. ③ The protein expressions of UCP2 and iNOS elevated in IR group and Valsartan group and it was even higher in Valsartan group, all P＜0.01.

Conclusion: Valsartan could increase UCP2, iNOS expression, decrease the serum levels of SOD, MDA and therefore, protect myocardial I/R injury in experimental rats.

Myocardial ischem ia reperfusion injury; Induced nitric oxide synthase; Uncoupling protein-2; Valsartan

450014 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科（朱銀川、康丹丹、湯建民）,干部病房（王瓊）

朱銀川 碩士研究生 主要從事冠心病及相關(guān)疾病的研究 Email：512311627@qq.com 通訊作者：湯建民 Email：tjmgrx@yahoo.com

R542.2

A

1000-3614（2014）05-0382-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.05.016

2013-10-30）

病例報(bào)告