乳腺癌HER-2檢測(cè)的概況與進(jìn)展*

耿 強(qiáng) 錢(qián)曉龍 付 麗

乳腺癌HER-2檢測(cè)的概況與進(jìn)展*

耿 強(qiáng) 錢(qián)曉龍 付 麗

人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER-2/neu）是乳腺癌重要的預(yù)后和HER-2靶向藥物治療的預(yù)測(cè)指標(biāo)，準(zhǔn)確檢測(cè)乳腺癌患者的HER-2狀態(tài)對(duì)臨床診療具有重要意義。目前美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）和美國(guó)病理醫(yī)師學(xué)會(huì)（CAP）推薦免疫組織化學(xué)（IHC）、熒光原位雜交（FISH）和亮視野原位雜交（BISH）3種HER-2檢測(cè)方法。雖存在各自的優(yōu)勢(shì)和不足，但在少數(shù)情況下仍無(wú)法檢測(cè)部分患者HER-2的狀態(tài)。銀增強(qiáng)原位雜交（SISH）、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Q-RT-PCR）和RNA原位雜交（RNA-ISH）等新的檢測(cè)方法也不斷應(yīng)用到HER-2檢測(cè)中，因其自身的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，滿足了部分患者的HER-2檢測(cè)需求，因而有很好的臨床應(yīng)用前景。本文將對(duì)這些技術(shù)的特點(diǎn)及其優(yōu)勢(shì)和存在的不足進(jìn)行綜述。

人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2 HER-2/neu檢測(cè) 乳腺癌

人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER-2/neu）基因是定位于染色體17q12～21上的原癌基因，在20%～30%被確診的乳腺癌患者中存在HER-2基因擴(kuò)增或蛋白過(guò)表達(dá)情況［1］。HER-2陽(yáng)性的乳腺癌患者往往表現(xiàn)為腫瘤惡性程度高、治療效果及預(yù)后較差，但其對(duì)使用特異的HER-2靶向藥物治療效果較好。因此，準(zhǔn)確地檢測(cè)乳腺癌患者的HER-2狀態(tài)對(duì)于臨床進(jìn)行個(gè)體化治療和評(píng)估預(yù)后至關(guān)重要［2］。近年，乳腺癌組織中HER-2狀態(tài)檢測(cè)的應(yīng)用技術(shù)越來(lái)越多。大致分為：1）HER-2蛋白水平的檢測(cè)，如免疫組織化學(xué)（IHC）；2）HER-2基因DNA水平的檢測(cè)，如熒光原位雜交（FISH）、亮視野原位雜交（BISH）、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）等；3）HER-2轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，如定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Q-RT-PCR）、RNA原位雜交（RNA-ISH）等。本文將對(duì)這些技術(shù)的特點(diǎn)進(jìn)行介紹，并對(duì)其優(yōu)勢(shì)和存在的不足進(jìn)行綜述。

1 乳腺癌HER-2檢測(cè)的現(xiàn)狀

目前國(guó)內(nèi)外乳腺癌HER-2檢測(cè)最常用的方法為IHC和FISH［3］。IHC是一項(xiàng)廣泛而實(shí)用的技術(shù)，具有檢測(cè)成本低、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)和染色后切片便于存檔等優(yōu)點(diǎn)，閱片時(shí)可同時(shí)進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)，已成為乳腺癌患者檢測(cè)HER-2擴(kuò)增初篩最常使用的方法［3］。FISH較IHC更特異、更準(zhǔn)確并且穩(wěn)定性更高，尤其是雙探針FISH在原來(lái)單一的HER-2探針的基礎(chǔ)上加入了17號(hào)染色體著絲粒探針（CEP17）作為內(nèi)對(duì)照，已成為目前HER-2檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”［4］。

IHC是一種半定量的方法，易受到受檢組織固定時(shí)間、固定液的選擇、抗體試劑盒的選擇和染色結(jié)果判讀的主觀性等諸多因素的影響［5］，因此準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性差于FISH。但FISH作為一門(mén)專業(yè)技術(shù)，其操作步驟和設(shè)備遠(yuǎn)比IHC更復(fù)雜，而且還有信號(hào)判讀時(shí)缺乏組織形態(tài)學(xué)參考及染色后的切片不宜長(zhǎng)時(shí)間保存等不足［6-7］。另外FISH的準(zhǔn)確性還受17號(hào)染色體異倍體及腫瘤異質(zhì)性等因素的影響［3，8］，亦存在少數(shù)病例因標(biāo)本較少或前期處理不當(dāng)而無(wú)法進(jìn)行FISH檢測(cè)或多次檢測(cè)結(jié)果均為臨界值，無(wú)助于臨床治療。對(duì)于FISH無(wú)法確定HER-2狀態(tài)的標(biāo)本應(yīng)積極選擇其他方法（如PCR、RNA-ISH等）進(jìn)行檢測(cè)。

2 乳腺癌HER-2檢測(cè)的新進(jìn)展

2.1 BISH

BISH是近十幾年來(lái)出現(xiàn)的HER-2基因檢測(cè)的新技術(shù)，主要包括顯色原位雜交技術(shù)（CISH）、銀增強(qiáng)原位雜交（SISH）等方法。2013年10月ASCO/CAP發(fā)布了乳腺癌HER-2檢測(cè)指南，將BISH列為乳腺癌HER-2檢測(cè)的新技術(shù)［1］。

2.1.1 CISH CISH由Tanner等［9］用來(lái)首先報(bào)道檢測(cè)HER-2基因擴(kuò)增，主要原理是使用地高辛或生物素標(biāo)記的探針在癌組織切片上進(jìn)行雜交反應(yīng)，顯色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察HER-2信號(hào)的方法。

CISH是一種定量的HER-2檢測(cè)方法，與IHC相比CISH特異性更強(qiáng)、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性更高［7］。CISH與FISH相比，CISH獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在于可以在普通光學(xué)顯微鏡下觀察HER-2基因信號(hào)，并能同時(shí)進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)，另外CISH操作步驟和設(shè)備較簡(jiǎn)單，染色后的切片信號(hào)穩(wěn)定，便于長(zhǎng)期存檔［6］。CISH分為單、雙探針CISH。單探針CISH僅含有HER-2基因探針，信號(hào)單一且空間分辨率較低，可能會(huì)造成HER-2基因低度擴(kuò)增病例被漏診，當(dāng)HER-2基因低度擴(kuò)增的信號(hào)數(shù)與無(wú)擴(kuò)增的信號(hào)數(shù)相接近時(shí)，亦容易造成誤判。另外，單探針CISH缺乏CEP17作為內(nèi)對(duì)照，無(wú)法排除單色探針可能造成的假陰性（17號(hào)染色體單體）或假陽(yáng)性（17號(hào)染色體多體）。雙探針CISH在HER-2探針（綠色信號(hào)）的基礎(chǔ)上加入CEP17號(hào)探針（紅色信號(hào)）作為內(nèi)對(duì)照，通過(guò)計(jì)算綠/紅色信號(hào)的比值來(lái)表示HER-2基因狀態(tài)，從而很好的解決了上述的問(wèn)題［10］。單、雙探針CISH的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)均可參照ASCO/CAP指南中原位雜交（ISH）的標(biāo)準(zhǔn)，Jacquemier等［11］通過(guò)分析多中心的乳腺癌HER-2檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CISH和FISH總一致性為98%。因此CISH適合在無(wú)FISH檢測(cè)條件的實(shí)驗(yàn)室使用［12］。

2.1.2 SISH SISH用于HER-2基因擴(kuò)增檢測(cè)，主要是利用酶促反應(yīng)原理促進(jìn)銀離子沉積并凝固到HER-2基因的靶位點(diǎn)而產(chǎn)生精確的顯色信號(hào)，對(duì)顯色信號(hào)分析后獲得HER-2基因狀態(tài)的方法［10］。雖與CISH有一些共同優(yōu)點(diǎn)，如SISH可在普通光學(xué)顯微鏡下判讀HER-2基因信號(hào)、同時(shí)可進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)、染色后的切片信號(hào)穩(wěn)定亦便于長(zhǎng)期保存等，但較CISH準(zhǔn)確度更高、耗時(shí)更少［7，13］。SISH與FISH相比較，操作步驟簡(jiǎn)單易掌握，可實(shí)現(xiàn)全程自動(dòng)化檢測(cè)，6 h內(nèi)可獲得檢測(cè)結(jié)果［6］，符合臨床快速診斷的要求。并且評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)完全可以參照ASCO/CAP的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［14］。SISH分為單、雙探針SISH。單探針SISH的缺點(diǎn)類似于單探針CISH，雙探針SISH引入CEP17探針作內(nèi)對(duì)照，已被FDA批準(zhǔn)用于HER-2檢測(cè)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，SISH檢測(cè)HER-2基因狀態(tài)與FISH的符合率達(dá)87%～97%［14-15］。因此SISH可能在未來(lái)成為乳腺癌HER-2檢測(cè)的常規(guī)方法。當(dāng)然作為一種新技術(shù)SISH也有一些不足，如檢測(cè)成本較高、銀染的HER-2基因信號(hào)為黑色而內(nèi)對(duì)照CEP17信號(hào)是紅色造成信號(hào)對(duì)比不夠清晰［10］。

2.2 MLPA

MLPA的檢測(cè)原理主要為使用熒光標(biāo)記的探針與HER-2基因的DNA進(jìn)行雜交，之后通過(guò)連接、PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分離及數(shù)據(jù)收集，對(duì)收集的數(shù)據(jù)使用軟件進(jìn)行分析后得出檢測(cè)結(jié)果。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)，還具有檢測(cè)成本低廉、耗時(shí)短、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［6，16-17］。特別適合用來(lái)檢測(cè)片段化的DNA樣本，如中性福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）的腫瘤組織，并且少量標(biāo)本便可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的。在HER-2基因檢測(cè)的同時(shí)，MLPA可對(duì)17號(hào)染色體上不同區(qū)域的多個(gè)靶基因進(jìn)行檢測(cè)，有利于17號(hào)染色體非整倍體的檢測(cè)并獲得不同區(qū)域的靶基因異常擴(kuò)增信息［7］。但是該技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)，如檢測(cè)標(biāo)本缺乏組織形態(tài)學(xué)的評(píng)價(jià)、DNA提取中難免混有非浸潤(rùn)性癌組織的DNA、可能受到靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染等。Moelans等［16］發(fā)現(xiàn)MLPA和FISH/CISH有很好的一致性，是一種可靠的HER-2檢測(cè)方法。因此對(duì)于組織較少無(wú)法進(jìn)行FISH/CISH檢測(cè)或需同時(shí)檢測(cè)17號(hào)染色體上多個(gè)基因的乳腺癌病例可選擇MLPA進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 Q-RT-PCR

Q-RT-PCR在HER-2基因檢測(cè)的原理是將HER-2基因信使核糖核酸（mRNA）逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）再進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定樣品中特定mRNA含量，繼而反映細(xì)胞內(nèi)HER-2基因表達(dá)量［18］。該方法具有PCR的普遍優(yōu)點(diǎn)，如檢測(cè)成本低廉、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單和自動(dòng)化檢測(cè)等［19］，尤其適合對(duì)新鮮的冰凍組織進(jìn)行檢測(cè)，并且少量組織便可獲得檢測(cè)結(jié)果。但是該技術(shù)最大的缺點(diǎn)是在DNA/RNA提取過(guò)程中不可避免的混入非浸潤(rùn)癌成分，也不能徹底消除腫瘤異質(zhì)性和17號(hào)染色體異倍體對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，另外因組織固定等原因?qū)е翲ER-2基因mRNA片段降解和操作中RNA酶的污染，也可能干擾檢測(cè)結(jié)果，造成檢測(cè)結(jié)果的不穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)Q-RT-PCR檢測(cè)HER-2擴(kuò)增和IHC一致率可達(dá)97%［20］，但也有研究表明相比于IHC/FISH，Q-RT-PCR更易造成HER-2的假陰性［21］?？梢?jiàn)Q-RT-PCR進(jìn)行HER-2檢測(cè)還存在爭(zhēng)議。Q-RT-PCR因較少的標(biāo)本便能進(jìn)行HER-2基因的高通量檢測(cè)，對(duì)乳腺癌的治療及預(yù)后可能有較好的應(yīng)用前景。

2.4 RNA-ISH

RNA-ISH進(jìn)行HER-2檢測(cè)的原理與DNA-ISH類似，通過(guò)使用地高辛或熒光素標(biāo)記的探針與被檢組織中HER-2基因的mRNA片段進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后進(jìn)行顯色或激發(fā)光照射，在普通光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下對(duì)mRNA信號(hào)進(jìn)行定量，繼而獲得被檢組織HER-2基因表達(dá)情況。RNA-ISH是一種特異而敏感的檢測(cè)方法，可對(duì)新鮮的冰凍組織或FFPE組織進(jìn)行快速檢測(cè)，檢測(cè)需要標(biāo)本量較少并且全程自動(dòng)化檢測(cè)［22］。但是作為一種新技術(shù)，RNA-ISH也有一些不足，如檢測(cè)標(biāo)本mRNA可能降解、操作過(guò)程中可能受到RNA酶的污染、判讀結(jié)果時(shí)缺乏組織形態(tài)學(xué)資料等。西班牙Alba等［23］發(fā)現(xiàn)RNA-ISH與FISH和IHC的一致性分別為96.5%和95.2%。所以RNA-ISH也可能是檢測(cè)HER-2狀態(tài)的一種比較可靠方法。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，準(zhǔn)確檢測(cè)乳腺癌患者HER-2的狀態(tài)是乳腺癌患者預(yù)后評(píng)估和制定有效治療方案的先決條件，對(duì)乳腺癌的診療具有重要的指導(dǎo)作用。隨著研究的深入，HER-2檢測(cè)技術(shù)也處于不斷發(fā)展中。目前IHC、FISH、CISH等常規(guī)的HER-2檢測(cè)技術(shù)因自身的不足和17號(hào)染色體異倍體等局限性而無(wú)法滿足一些患者HER-2的檢測(cè)需求。因此不斷發(fā)展和評(píng)估新的實(shí)用技術(shù)，如SISH、MLPA、Q-RT-RCR和RNA-ISH等彌補(bǔ)傳統(tǒng)技術(shù)的不足，為臨床診療工作提供參考，對(duì)乳腺癌患者更好地進(jìn)行個(gè)體化治療具有重要意義。

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（2014-03-08收稿）

（2014-04-16修回）

Current situation and development of HER-2 testing in breast cancer

Li FU;E-mail:fulijyb@hotmail.com
Department of Breast Cancer Pathology and Research Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, National Clinical Research Center of Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China

Human epidermal growth factor receptor 2(HER-2/neu)is an important prognostic predictor and the key predictor of anti-HER-2 therapy of breast cancer.Accurate testing of HER-2 status for breast cancer patients is important in clinical practice.As of this writing,the American Society of Clinical Oncology and the College of American Pathologists recommend three methods for HER-2 detection,namely,immunohistochemistry,fluorescence in situ hybridization,and bright-field in situ hybridization.The abovementioned methods have their own advantages and disadvantages.New methods,such as multiplex ligation-dependent probe amplification,quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,and RNA in situ hybridization,are currently applied to detect HER-2 status.New technologies not only make up for the shortcomings of routine methods but also have unique benefits that can meet the demands for HER-2 testing of some breast cancer patients.Thus,these methods are promising for clinical applications and can improve clinical diagnosis and treatment.The characteristics,advantages,and drawbacks of these technologies are introduced and reviewed in this paper.

HER-2,HER-2/neu testing,breast cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.20140377

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺病理研究室，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津市300060）

*本文課題受國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：30930038）資助

付麗 fulijyb@hotmail.com

Qiang GENG,Xiaolong QIAN,Li FU

This study was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China(No.30930038)

張亻 刡）

耿強(qiáng) 碩士研究生。研究方向?yàn)槿橄侔┥L(zhǎng)侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制。

E-mail：jedgeng@163.com

·特約綜述·